JPS5888322A - 標的細胞障害性因子を含有する悪性腫瘍治療剤とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、標的細胞障害性因子を含有する悪性腫瘍治療
剤とその製造方法に関する。

標的細胞障害性因子（Ｔａｒｇｅｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｉ、ｙ
ｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ。

以下、単にＴＣＬＦと略称する。）は、マウスＬ　−９
２９細胞を標的細胞とし、この細胞に障害（Ｃｙｔｏ−
ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を与え、その細胞を死滅破壊（Ｃｙ
ｔｏｌｙｓｉｓ　）させる因子でリンホトキシン、ツモ
ア　ネクロシス　ファクターなどが知られている。

リンホトキシンは、青木隆−ほか共著「リンホカイン」
、新免疫学叢書６．１９７９年、医学書院、’　　１３
１ｏｏｍ、　Ｂ、Ｒ，＆　Ｇｌａｄｅ、　Ｐ、’　Ｒ，
共編ｒ　Ｉｎ　ｖｉｔｒ。

ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　−ｍｅｄｉａｔｅｄ
　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ｊ　Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ
、　１９７１年、などにも記載されているように、例え
ば、感作されたＴ　ＩＪンパ球細胞に抗原を作用させる
か、ミトーゲンとしてフィトヘマグルチニン、コンカナ
バリンＡをはじめとするリンホトキシン誘導剤をＴ　Ｉ
Ｊンパ球細胞に作用させることによって、その細胞内外
に誘導生成する蛋白性物質であって、細胞障害機能を持
つ物質に与えられた名称である。リンホトキシンは、マ
ウスＬ−９２９細胞のみならず、ヒト腫瘍細胞さらには
ヒト正常細胞にも障害を与えることが知られている。ま
たツモア　ネクロシス　ファクターは、Ｃａｒｓｗｅｌ
ｌ。

Ｅ、んｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　７２、Ｎｏ、　９．８
６６６−８６７０頁（１９７５年）及びＥ、Ｐｉｃｋ編
Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　
ｕＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　”　Ｖｏｌ、　Ｉｔ。

１）Ｉ）、　２８５〜２７２、Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒ
ｅｓｓ、　１９８１年、などにも記載されているように
、例えば、ウサギに１３ａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔ
ｔｅ　Ｑｕｊｒｉｎ（ＢＣＧ　）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ　、ｔ−ンドトキシンなどの
ツモア　ネクロシスファクター銹導剤を非経口的に投与
することによって、その血清中マクロファージ細胞が誘
導生成する蛋白性物質であって、ＭｅｔｈＡ肉腫出血性
壊死能を持つ物質に与えられた名称である。ツモア　ネ
クロシス　ファクターは、マウスＬ−９２９細胞のみな
らずヒト腫瘍細胞にも障害を与えそれを死滅破壊させる
がヒト正常細胞には実質的に障害を与えないことが知ら
れている。

このように、マウスＬ−９２９細胞を標的細胞とするＴ
ＣＬＦは、腫瘍細胞に対して細胞障害機能を持っている
ことよシ、悪性腫瘍治療剤として期待されてきた。ＴＣ
ＬＦには種特異性がほとんど見られないので、ウサギ、
ラットなど種々の動物由来の細胞から調製したＴＣＬＦ
を利用することも考えられるが、ヒトの治療に供するに
は、ヒトの生細胞由来であることが、治療上に生ずる抗
原性などの副作用の懸念もなく極めて安全であり、優れ
ている。

本発明者は、工業的規模で容易に実施し得るヒトのＴＣ
ＬＦの製造方法を検討し、そのＴＣＬＦが悪性腫瘍治療
剤として有用であるか否かを鋭意研究した。

その結果、ＴＣＬＦ産生能を有する培養株化されたヒト
由来のＢリンパ芽球様細胞を増殖させて得られるＢリン
パ芽球様細胞に、ＴＣＬＦ誘導剤を作用させることによ
って、ＴＣＬＦが高活性で誘導生成され、これを精製採
取することによってＴＣＬＦが多量容易に製造しうろこ
とを見いだし、そのＴＣＬＦが悪性腫瘍の治療剤として
優れていることを確認して本発明を完成した。

このようにして製造されたＴＣＬＦは、分子量約１〜１
０万の範囲に存在し、少′くとも８種の糖蛋白質を含有
していることが明らかとなシ、その作用は、マウスＬ　
−９２９細胞の不ならずヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅
させる能力を有しているが、ヒト正常細胞には実質的に
障害を与えないことが判明した。

以下、本発明のＴＣＬＦの製造方法について詳細に説明
する。

本発明に使用する培養株化されたヒト由来のＢリンパ芽
球様細胞には、常法に従って、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏ　）で増殖させた細胞が使用できる。しかしながら、
本発明の場合には、Ｂリンパ芽球様細胞の増殖に際し、
ヒト以外の温血動物体内に直接移植するかまたは拡散チ
ャンバー内へ接種して、その温血動物の体液の供給を受
けながら増殖させたＢ　’Ｊンパ芽球様細胞を使用する
方が望ましい。

即ち、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で増殖させる場合
とは違って、高価な血清などを含む栄養培地が不要また
は大幅に節約できるばかりでなく、細胞増殖中の維持管
理も極めて容易であり、その上誘導生成されるＴＣＬＦ
活性が高い特徴を有している。

ヒト以外の温血動物を利用する方法は、培養株化された
ヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞をヒト以外の温血動
物体内に移植し、あるいは、その動物の体液の供給を受
けることのできる拡散チャンバー内に収容し、このチャ
ンバーを動物体内に埋設し通常の飼育をすれば、温血動
物体から供給される栄養物を含有する体液を利用してそ
の細胞が容易に増殖しうるのである。更に生体外（ｉｎ
　ｖｉｔｒｏ　）で増殖させる場合と比較して、この細
胞の増殖が安定していること、その増殖速度が大きいこ
と、得られる細胞量が多いこと、更には細胞当りのＴＣ
ＬＦの収量が著増することも大きな特徴である。

本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒ
ト以外の温血動物体内に移植して容易に増殖し得てしか
もＴＣＬＦ産生を有するＢ　ＩＪンパ芽球様細胞であれ
ばよい。例えばｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｌｉｎｉｃ
ａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｊ　Ｖｏｌ、　１．
１１６〜１１７頁（１９７５年）に記載されているＮａ
ｍａ１ｗａ細胞、１．　Ｍｉｙｏｓｈｉ著ｒ　Ｎａｔｕ
ｒｅ　Ｊ　Ｖｏｌ、　２６７、８４８〜８４４頁（１９
Ｔ’７年）に記載されているＢＡＬＬ−１細胞、「組織
培養」第６巻、第１３号、５２７〜５４６頁（１９８０
年）に記載されているＪＢＬ細胞、ＥＢＶ−３ａ細胞、
ＥＢＶ−Ｗａ細胞、ＥＢＶ−ＨＯ細胞や、その他ＢＡＬ
Ｍ２細胞、ＣＣＲＦ−８Ｂ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　　１
２０）などの株化細胞、更には、正常な３３１Ｊンバ球
細胞を各種ウィルス、薬剤、放射線などで処理し培養株
化させた細胞などが自由に使用される。

また、これらＢリンパ芽球細胞のＴＣＬＦ産生能を有す
る遺伝子を、例えばポリエチレングリコールやセンダイ
ウィルスなどを利用する細胞融合の手段や、ＤＮＡＩＪ
ガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラー
ゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段などによ
って処理し、その増殖速度を高めたり、細胞当りのＴＣ
ＬＦ産生能を高めたシして使用してもよく、本明細書に
記載する株化細胞のみに限定されるものではない。

これらの細胞は、後に述べるＴＣＬＦを誘導生成させる
までの過程で、単独で又は２種以上を混合して自由に利
用される。必要ならば、これに、例えばヒトの新鮮面か
ら調整される白血球を併用することもできる。

本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖し
得るものであればよく、例えばニワトリ、ハトなどの鳥
類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウ
シ、モルモット、ラット、ハムスター、普通マウス、ヌ
ードマウスなどの哺乳類が使用できる。

これらの動物にヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞を移
植すると好ましくない免疫反応を起すおそれがあるので
、その反応をできるだけ抑えるため、使用する動物はで
きるだけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、または新生期
、幼少期のものの方が好ましい。

また、これら動物に例えば２００〜６００レム程度のエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスの場合には、成長したもの
であっても免疫反応が弱いので、これらの前処理を必要
とすることもなく、培養株化されたヒト由来のＢ　ＩＪ
ンバ芽球様細胞が移植でき、急速に増殖できるので特に
好都合である。

また、培養株化されたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞を
例えば先づハムスターに移植し増殖させた後、この細胞
を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒト以外
の温血動物間で移植してヒト由来のＢリンパ芽球様細胞
の増殖をよシ安定化したり、更にそれらから誘導生成さ
れるＴＣＬＦ量を増加させることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、囲網間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来のＢ　ＩＪンバ芽球様
細胞を移植する動物体−内の部位は、移植した細胞が増
殖しうる部位であればよく、例えば尿液腔、静脈、腹腔
、皮下など自由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過■止し得る多孔性の濾過膜、例えば
孔径的１０−７〜１０−’ｍを有するメンブランフィル
タ−１限外濾過膜またはフォローファイバーなどを設け
た公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内
、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含・
む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培
養株化されたヒト由来のＢ　ＩＪンバ芽球様細胞を何れ
も増殖させることができる。

また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む溶
液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにしたチ
ャンバーをＣ）例上げ動物体表に取付け、チャンバー内
のヒト由来のＢリンパ芽球様細胞の増殖状態を透視でき
るようにすることも、また、このチャンバ一部分のみを
着脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一杯細
胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量を更に高め
ることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
Ｂ　ＩＪンパ芽球様細胞が動物細胞と直接接触しないの
で、ヒト由来のＢ　ＩＪンバ芽球様細胞のみが容易に採
取できるだけでなく、好ましくない免疫反応を起す心配
も少ないので、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく
、各種温血動物を自由に利用できる特徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育管理
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何ら
必要としないので好都合である。

ヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞を増殖させるための
期間は通常１〜１０週の期間で目的を達成することがで
きる。このようにして得られるヒト由来のＢリンパ芽球
様細胞数は動物個体当り約１０７〜１０１２個、または
それ以上に達することも見出した。

換言すれば、本発明で使用するＴＣＬＦの製造方法によ
シ増殖させたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞数は、動物
側体当シ移植した細胞数の約１０２−１０７倍、または
それ以上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増殖さ
せる場合の約１０１〜１０６４１！、またはそれ以上に
も達して、ＴＣＬＦの製造のために極めて好都合である
。

このようにして増殖させたヒト由来のＢリンパ芽球様細
胞からＴＣＬＦを誘導生成させる方法は自由である。そ
れが増殖した動物体内のままでＴＣＬＦ誘導剤を作用さ
せることもできる。例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増
殖したヒト由来のＢリンパ芽球様細胞に、また皮下に生
じた腫瘍細胞に、ＴＣＬＦ誘導剤を直接作用させてＴＣ
ＬＦを誘導生成させ、次いでその血清、腹水または腫瘍
からＴＣＬＦを精製採取すればよい。

また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体内から取
り出し、生体外でＴＣＬＦ誘導剤を作用させてＴＣＬＦ
を誘導生成させることもできる。

例えば、腹水中で増殖したヒト由来のＢ　ＩＪンバ芽球
様細胞を採取し、または皮下に生じたヒト由来のＢ　Ｉ
Ｊンパ芽球様細胞を含む腫瘍を摘出、分散し、得られる
細胞を約２０〜４０℃に保った栄養培地に細胞濃度が約
１０５〜１０　’／ｍ／になるように浮遊させ、これに
ＴＣＬＦ誘導剤を作用させることによってＴＣＬＦを誘
導生成させ、これを精製採取すればよい。

更に、ヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞を拡散チャン
バー内で増殖させた場合は、増殖させた細胞をチャンバ
ー内のままで、またはチャンバーから取り出して、ＴＣ
ＬＦ誘導剤を作用させ、ＴＣＬＦを誘導生成させること
もできる。

また、例えば増殖させたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞
に先づ動物体内のままでＴＣＬＦを誘導生成させた後、
次いで同一動物個体の特定の部位または全体から採取し
たヒト由来のＢ　ＩＪンバ芽球様細胞に動物体外でＴＣ
ＬＦを誘導生成させる方法、また一度ＴＣＬＦの誘導生
成に使用した細胞を更に２度以上ＴＣＬ−Ｆの誘導生成
に使用する方法、または動物体内に埋設、若しくは接続
するテャンバーを交換して得られる細胞数を増加させる
方法などによって、使用する動物個体当りのＴＣＬＦ生
成量を更に高めることも自由である。

本発明のＴＣＬＦ誘導剤としては、α−インターフェロ
ン誘導剤として知られているウィルス、核酸、ポリヌク
レオチドなどやｒ−インターフェロン誘導剤として知ら
れているフィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ１ポ
ークウイードミトーゲン、リボポリサツカリド、エンド
トキシン、多糖類、細菌などが適宜用いられるが、通常
、ａ　−インターフェロン誘導剤を使用する方が、高活
性のＴＣＬＦを誘導生成できるので好都合である。

また、感作化され念細胞にとっては、抗原もＴＣＬＦの
誘導剤である。

更に、ヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞からＴＣＬＦ
を誘導生成させるに際し、ＴＣＬＦ誘導剤トして、α−
インターフェロン誘導剤とｒ−インターフェロン誘導剤
とを併用することによりＴＣＬＦの生成量を著増しうろ
ことが判明した。

また、これら誘導生成−よってＴＣＬＦが産生されるだ
けでなく、種特異性の高いヒトインターフェロンも同時
に産生されることが判明した。

このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物質の同時
生産を可能にし、更に、ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞
の高度利用を可能にし、ヒ）ＴＣＬＦ及びヒトインター
フェロンを大量に安価に供給する点からきわめて好都合
である。

このようにして誘導生成されたＴＣＬＦは、公知の精製
分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、濃縮、
凍結乾燥などを行なうことによって容易に精製分離し、
採取することができる。更に高度の精製を必要とする場
合には、例えば、イオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾
過、および等電点分画、電気泳動などの公知の方法を組
合せれば、最高純度のＴＣＬＦを採取することも可能だ
が、抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーや、
コンカナバリンＡ−セファロースを用いたアフイニティ
クロマトグラフィーによシ、高純度のＴＣＬＦを極めて
簡便かつ迅速に製造できるので非常に好都合である。

このようにして製造されたＴＣＬＦは、分子量約１〜１
０万の範囲に少くとも８種の糖蛋白質すなわち分子量約
１〜２万、約ａ５〜５万及び約７〜９万の存在が明らか
となり、その作用は、マウスＬ−９２９細胞のみならず
ヒト腫瘍細胞に障害−を与え死滅させる能力を有してい
るが、ヒト正常細胞には実質的に障害を与えないことが
判明した。

従って、本発明のＴＣＬＦは、ＴＣＬＦ感受性疾患例え
ば悪性腫瘍の予防剤、治療剤なかでも、従来、治療がき
わめて困難とされてきたヒトの各種悪性腫瘍治療剤とし
て有利に用いることができる。

ＴＣＬＦの活性は、Ｂｌｏｏｍ、　Ｂ、　Ｒ，＆　Ｇｌ
ａｄｅ　Ｐ、　Ｒ。

共編ｒ　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃ
ｅｌｌ　−ｍｅｄｉａｔｅａｉｍｍｕｎｆｔｙ　Ｊ　Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７１年）に報告さ
れているリンホトキシンの場合の方法に従って、マウス
Ｌ　−９２９細胞を標的細胞に使用して、一定時間後の
生残細胞数を測定する方法を用いた。

ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性ハｒ　ｉ
白質核酸酵素ｊ　Ｖｏｌ、２０．　Ｎｏ、　６．６１６
〜６４８頁（１９７５年）に報告されているヒト羊膜由
来のＦ’Ｌ細胞を使用して公知のプラーク半減法で測定
した。

赤血球凝集価はＪ、　Ｅ、　５ａｌｋ著ｒ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　。

Ｊｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｊ　Ｖｏｌ、　４９．８７頁、
（１９４４年）の方法に準じて測定した。

次に、ＴＣＬＦの産生に関する実験Ａを述べる。

〔実験Ａ〕　生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）又は、生体
内で増殖させて得た細胞によるＴＣＬＦ産生能試験実験
Ａ−１生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）での増殖ヒト由来
のＢ　ＩＪンバ芽球様細胞ＢＡＬＬ−１細胞を牛胎児血
清を２０％補足したＲＰＭＩ　１６４０培地（ｐＨ７２
）に接種し、３７℃で浮遊培養した。

得られた細胞を血清無添加のＲＰＭＩ　１６４０培地（
ｐＨ１２）で洗浄し、同培地に約１×１０シーになるよ
う懸濁した。

実験Ａ−２生体内での増殖 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下にＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常の方
法で８週間飼育した、皮下に生じた腫瘤を摘出し細切し
、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を血
清無添加のＲＰＭＩ　　１６４０培地（１）Ｉ（’ｉ［
２）で洗浄し、同培地に約ｌｘ　１０　／ｍｊになるよ
う懸濁した。

実験Ａ−８ＴＣＬＦの産生 実験Ａ−１、Ａ−２で得たＢＡＬＬ−１細胞の懸濁液に
センダイウィルス若しくはフィトヘマグルチニンを単用
するかまたはセンダイウィルスとフィトヘマグルチニン
とを併用してＴＣＬＦを誘導生成させた。即ち、約１×
１０ν讐の細胞濃度を有する懸濁液゛にセンダイウィル
スを−当り約３００赤血球凝集価の割合で添加し、３７
℃で２日間保ってＴＣＬＦを誘導生成させた５、マタ、
フィトヘマグルチニンの場合には、細胞懸濁液−当シ約
５０μｇを添加して８７℃で２日間保ってＴＣＬＦを誘
導生成させた。また、センダイウィルスとフィトヘマグ
ルチニンとを併用する場合には、センダイウィルスを一
当シ約８００赤血球凝集価及びフィトヘマグルチニンを
−当り約５０μｇを添加して８７℃で２日間保ってＴＣ
ＬＦを誘導生成させた。この際、ＴＣＬＦ以外に多量の
α−インターフェロン、ｒ−インターフェロンが同時に
産生されていた。

ＴＣＬＦの産生結果は第１表に示す。

（注）″″数値、ゴ当シのＴＣＬＦ活性を示す。

但し、（）内の数値は、−当りのヒトインターフェロン
活性を示す。

第１表の結果から明らかなように、ＴＣＬＦは生体外で
増殖させた細胞からも生成される。

しかしながら生体内で増殖させた細胞から誘導生成され
るＴＣＬＦ量の方が多く、生体外で誘導生成されるもの
の約１０倍以上である。またセンダイウィルスによりて
誘導生成されるＴＣＬＦは、フィトヘマグルチニンを使
用する場合と同等以上である。また、ＴＣＬＦ誘導剤が
、センダイウィルス単独またはフィトヘマグルチニン単
独の場合に誘導生成されるＴＣＬＦ活性と、センダイウ
ィルス及びフィトヘマグルチニンとを併用する場合に誘
導生成されるＴＣＬＦ活性とに着目すると、生体外で増
殖させた細胞を用いた場合も、生体内で増殖させた細胞
を用いた場合もいずれもセンダイウィルスとフィトヘマ
グルチニンとの相乗効果が認められる。

その相乗効果の程度は、生体内で増殖させ念細胞を用い
た場合の方が特に顕著である。

以上述べた実験結果から明らかなように、種特異性のな
いＴＣＬＦの誘導生成に種特異性の高いインターフェロ
ン誘導剤なかでもα−インターフェロン誘導剤及びｒ−
インターフェロン誘導剤の併用が好都合である。

次に、ＴＣＬＦの製造実施例を述べる。

実施例　Ａ−１ 新生児の７１ムスターに、ウサギから公知の方法で調製
した抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後
、その皮下にヒト由来のリンパ芽球様細胞ＢＡＬＬ−１
細胞を移植し、その後通常の方法で８週間飼育した。皮
下に生じた約１５ｆの腫瘤を摘出し細切し、生理食塩水
中で分散させほぐした。得られた細胞を血清無添加のＲ
ＰＭＩ　１６４０培地（ｐＨ７２）で洗浄し、同培地に
約５　Ｘ　１０６／ｄに懸濁した。この懸濁液に、セン
ダイウィルスを−当り約ＬＯＯＯ赤血球凝集価及びフィ
トヘマグルチニンを一当シ約２００μｔを添加し、８７
℃で２日間保ってＴＣＬＦを誘導生成させた。これを約
４℃、約ｉ、ｏｏｏｒで遠心分離し、沈澱物を除去し、
得られた上清をｐＨ７２、＋１０１Ｍリン酸塩緩衝液を
含有する生理食塩水で２１時間透析し、更に精密濾過し
て得た濾液を濃縮し、凍結乾燥してＴＣＬＦ活性を含有
する粉末を得た。得られたＴＣＬＦ活性は、ノ為ムスタ
ー１匹当り約ａｏｏｏ万単位であった。なお、本品には
、ヒトインターフェロン約ａ２００万単位含有していた
。

実施例　Ａ−２ ヒト由来のリンパ芽球様細胞ＢＡＬＬ−１細胞を牛胎児
血清を２０％補足したＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐＨ
７４）に接種し、８７℃で常法に従い生体外（ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ　）で浮遊培養した。得られた細胞を血清無添
加のＥａｇｌｅの最少基本培地（ｐＨ７４）で洗浄し、
同培地に約Ｉ　Ｘ　１０７．乙ｄになるように懸濁した
。この懸濁液にセンダイウィルスを−当り約ｉ、ｏ　ｏ
　ｏ、赤血球凝集価及びコンカナバリンＡを−当り約５
μ２を添加し、８８℃で１日保ってＴＣＬＦを誘導生成
させた。これを４℃、約ｔ、ｏｏｏｒで遠心分離し、得
られた上清をｐＨ’Ｚ２、αＯＩＭＩＪン酸塩緩衝液を
含有する生理食塩水で１５時間透析し、更に精密濾過し
て得た濾液を濃縮してＴＣＬＦ活性を含有する溶液を得
た。得られたＴＣＬＦ活性は誘導生成時の懸濁液ｌｔ当
り約４５０万単位であった。なお、本液のヒトインター
フェロン活性は、誘導生成時の懸濁液１を当り約４５０
万単位であった。

実施例　Ａ−８ 成長したヌードマウスの腹腔内に、ヒト由来のリンパ芽
球様細胞Ｎａｍａ１ｗａ細胞を移植後、通常の方法で５
週間飼育した。この腹腔内へ、約ａ０００赤血球凝集価
のニューカッスル病ウィルスを紫外線によって予めほと
んど失活させて注入し、２４時間後に屠殺して腹水を採
取した。以後、実施例Ａ　−、１と同様に精製し濃縮し
てＴＣＬＦ活性を有する粉末を得た。得られたＴＣＬＦ
活性は、ヌードマウス１匹当り約９００万単位であった
。なお、本品にはヒトインターフェロン約５２０万単位
を含有していた。

実施例　Ａ−４ 成長した普通マウスに約４００レムのエックス線を予め
照射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮下
に培養株化されたヒト由来のＢ　ＩＪンバ芽球様細胞Ｃ
ＣＲＦ−８Ｂ細胞を移植し、その後通常の方法で８週間
飼育した。皮下に生じた約１０２の腫瘤を摘出した後、
実施例Ａ−１と同様にして細胞を分散させた。この細胞
を実施例Ａ−１と同様に懸濁した後、この懸濁液に、セ
ンダイウィルスを−当り約５００赤血球凝集価及びコン
カナバリンＡを−当り０８μ２を添加し、３７℃−で１
日間保ってＴＣＬＦを誘導生成させた。

以後、実施例Ａ−１と同様に精製濃縮してＴＣＬＦ活性
を有する粉末を得た。得られたＴＣＬＦ活性は、マウス
１匹当り２，４００万単位であった。

なお、本品にはヒトインターフェロン約１，９００万年
位含有していた。

実施例　Ａ−５ 新生児のハムスターに実施例Ａ−１と・同様にしてヒト
由来のリンパ芽球様細胞ＪＢＬ細胞を移植し、その後通
常の方法で４週間飼育した１、皮下に生じた約２０２の
腫瘤を実施例Ａ−１と同様にほぐして約８Ｘ１０シーの
細胞懸濁液を得た。

本懸濁液にセンダイウィルスを−当り約１，０００赤面
球凝集価を添加し８６℃で２日間保ってＴＣＬＦを誘導
生成させ次いで実施例Ａ−２と同様に精製濃縮してＴＣ
ＬＦ活性を有する濃縮液を得た。得られたＴＣＬＦ活性
は、ノ・ムクター１匹当り約１，６００万単位であった
。なお本液にはハムスター１匹当り約７００万単位のヒ
トインターフェロンを含有していた。

実施例　Ａ−６ 孔径α５ミクロンのメンブランフィルタ−を設けた内容
量的１０−のプラスチック製円筒型拡散チャンバー内に
、培養株化されたヒト由来のＢリンパ芽球様細胞ＥＢＶ
−ＨＯ細胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長したラ
ットの腹腔内に埋設した。このラットを通常の方法で４
週間飼育した後、この拡散チャンバーを取り出した。

これにより得られたヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞
の濃度は約６×ｌＯシ讐であって、生体外の栄養培地に
炭酸ガスインキュベーター中で増殖させる場合の約１０
２倍以上にも達することがわかった。この細胞を実施例
Ａ−２と同様に懸濁し、この懸濁液に、−当り約５００
赤血球凝集価のニューカッスル病ウィルスを紫外線で予
めほとんど失活させて加え、さらにフィトヘマグルチニ
ンを−当り約１００μを加え３７℃で２日間保ってＴＣ
ＬＦを誘導生成させた。以後、実施例Ａ−１と同様に精
製し濃縮してＴＣＬＦ活性を有する粉末を得たつ得られ
たＴＣＬＦはラット１匹当り約５４０万単位であった。

なお、本品にはヒトインターフェロン約６８０万単位を
含有していた。

実施例　Ａ−７ ３７℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、培養株化さ
れたヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球様細胞ＢＡＬＬ−１細
胞を移植した後、８７℃で１週間保った。この卵を割卵
し次後、増殖細胞を採取した。この細胞を実施例Ａ−１
と同様に５　Ｘ　１０’／ｍに懸濁した。この懸濁液に
−当り約１，０００赤面球凝集価のセンダイウィルスを
添加し、８７℃で１日間保ってＴＣＬＦを誘導生成させ
、次いで実施例Ａ−２と同様に精製濃縮してＴＣＬＦ活
性を有する濃縮液を得た。得られたＴＣＬＦ活性は、受
精卵１０個当り約９０万単位であった。なお、本液には
、受精卵１０個当り約３５万単位のヒトインターフェロ
ンを含有してりた。

実施例　Ａ−８ 実施例Ａ−１の方法で調製したＴＣＬＦ含有粉末を、Ｇ
、　Ｂｏｄｏの報告（Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｐｒ
ｅｐａ−ｒａｔｉｏｎ、　５ｔａｎｄａｉｒｉｚａｔｉ
ｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｕｓｅ　ｏｆｉｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎ、　１１　ｔｈ　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ　ＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ　、８　＆　９　Ｊｕｎｅ　１９７７、　Ｚａ
ｇｒｅｂ、　Ｙｕｇｏｓｌａｖｉａ　）に準じてイオン
交換への吸脱着、ゲル濾過による分子量分画、濃縮及び
精密濾過などの手段によりインターフェロンを除去し、
さらに硫安塩析により濃縮精製を行ない、その後、ＰＨ
７４、＋１０１．　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液中でフイトヘ
マグルチニンーセファロースアフイニテイクロマトグラ
フィーを行い、吸着画分をαＩＭＮ−アセチルーＤ　−
ガラクトサミン含有上記緩衝液で溶出させ、得られた画
分を上記緩衝液で透析し、濃縮後、凍結乾燥してＴＣＬ
Ｆ活性を含有する粉末を得た。

このようにして得られたＴＣＬＦは、比活性８ＱＯＯＯ
単位／■であった。

さらに、ゲル濾過法により分子量分画したところ、分子
量７〜９万、分子量ａ５〜５万及び分子量１〜２万のＴ
ＣＬＦが活性量比的１：１：２で分取された。本ＴＣＬ
Ｆはいずれも糖蛋白質で、その糖含量は分子量の違いに
よっても異なるが、約５〜４５％である。

以上述べた製造実施例のようにして得た本発明のＴＣＬ
Ｆは、ＴＣＬＦ単独で若しくはＴＣＬＦとインターフェ
ロンとの混合物でまたはＴＣ’　Ｌ　Ｆに１種若しくは
２種以上の他の物質を含有せしめることにより、例えば
注射薬、内服薬、点眼薬、点鼻薬、外用薬などとしてＴ
ＣＬＦ感受性疾患の予防剤、治療剤として有利に用いる
ことができる。ＴＣＬＦ感受性疾患とは、ＴＣＬＦによ
って予防され若しくは治療される疾患であり、例えば、
乳癌、肺癌、膀胱癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、白血病、
リンパ腫、皮膚癌などの悪性腫瘍である。

次に、ＴＣＬＦの有効性、毒性、用法および用量につい
て実験Ｂで明らか圧する。

〔実験Ｂ）　　ＴＣＬＦの有効性、毒性試験実験　Ｂ−
１ Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ由来ヌードマウスに人乳癌組織片を
背部皮下に移植する。腫瘍体積が約２００？Ｆ＋７７１
’の時期から実施例Ａ−８の方法で得られたＴＣＬＩＦ
の分子量７〜９万、分子量ａ５〜５万、分子量１〜２万
の混合品（以下、単にＴＣＬＦ混合品と称する。）を４
および４０単位／Ｋｇ、１日２回に分けて静注し、１５
日１にマウスを殺し、腫瘍重量を測定した。その結果を
第２表に示した。なお、対照はＴＣＬＦ無含有生理食塩
水を静注した。

第　　２　　表 実験　Ｂ−２ 体重２５１前後のＢＤＦ１雄マウスを各群１０匹とし、
２＋＋＋ｓ＋角に切断したルイス肺癌を背部皮下に移植
した。移植後８日目から実施例Ａ−８の方法で得られた
ＴＣＬＦ混合品および分子量１〜２万のＴＣＬＦをそれ
ぞれ４および４ｃ単位／Ｋｔ。

１日２回に分けて連日静注し、２旧目にマウスを殺して
腫瘍重量を測定した。

その結果を第８表に示した。なお、対照はＴＣＬＦ無含
有生理食塩水を静注した。

※　危険率５チ以下で対照の値に比し、推計学的に有意
差あり。

実験　Ｂ−８ 体重２５２前後のＢＤＦ１雄マウスマウ２０匹とし、こ
れに白血病Ｌ　Ｌ２１０細胞を移植した。移植後１日目
からＴＣＬＦ混合品をそれぞれ８ｃ単位／Ｋｇ／日およ
び８００単位／ＫＬｉ／日を１５日１回又は１日２回投
与して連日静注し、生残率が５０％に低下するまでの日
数を比較した。なお対照として、ＴＣＬＦ無含有生理食
塩水又はマイトマイシン０５■／Ｋｆ１日を同様に静注
した。結果は第４表に示した。

第　　４　　表 第４表の結果からＴＣＬＦ混合品の投与量が比較的少な
い場合でもその投与方法を１日１回から１日２回に増す
ことによシきわめて有効である。

実験　Ｂ−４ 体重ｇ５１ｉ前後のＢＤＦ１雄マウスマウ２０匹とし、
これに白血病Ｐ８８８細胞を移植した。移植後１日目か
らＴＣＬＦ混合品を１日１回、連日、腹腔内に８０日間
静注し、ＴｃＬＦ混合品の投与量、生残日数及び生残率
（４）の関係を求めた。なお対照はＴＣＬＦ無含有生理
食塩水又はマイトマイシン０５■／に９／日を静注した
。

結果は第５表に示した。

第５表の結果から明らかなように、ＴＣＬＦ混合品を１
，０００単位以上／に９／日の大量投与が予防剤、治療
剤としてきわめて有効である。

実験　Ｂ−５急性毒性 生後２０日のマウスを使用して、実施例Ａ−８の方法で
得られたＴＣＬＦ混合品の急性毒性試験をしたところ、
本ＴＣＬＦ混合品の毒性は極めて低く、腹腔内に注射し
た時のＬＤ５ｏはｔｃ４ｏｏ。

単位以上／にグであることが判明した。

また、ヒト正常細胞とヒト腫瘍細胞とを用いて、常法に
従って”ｊｎ　ｖｉｔｒｏで細胞の生育を５０チ阻害す
るＴＣＬＦ混合品の濃度を調べた。

その結果、１ｎｔｅｓｔｉｎｅ　（４０７）細胞、Ｌ４
ｖｅｒ　（Ｃｈａｎｇ　）細胞又はＱｉｒａｒｄｉ　）
（ｅａｒｔ細胞などの正常細胞ではいずれも２ｃ（ｏｏ
ｏ単位以上／−と高濃度であるの。

に対し、ＫＢ（鼻咽腔癌）細胞、Ｈ，Ｅｐ豐２（咽喉筋
）細胞又はＨＬＥ（肺癌）細胞ではそれぞれ１８単位／
−１２４単位／ｄ、８８単位／−ときわめて低濃度であ
った。

以上の実験からも明らかなように、本発明のＴＣＬＦは
、その有効用量からも極めて安全であり、ＴＣＬＦ感受
性疾患に用いることができる。

更には、悪性腫瘍に適用するにあたっては、例えば患者
の腫瘍の一部を取り、本発明のＴＣＬＦと生体外で処理
することによって腫瘍の免疫原性を高めた後、腫瘍患者
の体内に戻すことにより、この悪性腫瘍の治療を行うこ
ともできる。

本発明のＴＣＬＦの成人１日当りの用量は５〜５ＱＯＯ
ＱＯＯＯ単位であり、好ましくは局所注射および点眼な
どの局所適用用量は５〜ｔ、ｏ　ｏ　ｑｏ　ｏ　ｏ単位
、軟膏の場合１０〜ｆｉ００ＱＯＯＯ単位、静注および
筋注など全身注射の場合５０〜ＩＱＯ，０ＱＯＯＯ単位
、経口投与の場合５００〜５ＱＯＯＱＯＯＯ単位である
が用法あるいは症状に応じて適宜増減することができる
。

必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤あるいは賦
形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤に調製することが
できるが、ＴＣＬＦの毒性、有効量及び安定性などを考
慮すると医薬用製剤ダラム当り５単位以上のＴＣＬＦを
含有せしめることが望ましい。

本発明のＴＣＬＦを含有するＴＣＬＦ感受性疾患予防剤
、若しくは治療剤は、その目的に応じてその形状を自由
に選′択できる。

経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤などの腸溶
製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、注射剤としては
、例えば月間に注射用蒸溜水に溶解して使用する凍結乾
燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏剤として用い
ることもできる。

以下に製剤の実施例を示すが、製剤はこれのみに限定さ
れるものではない。

実施例　Ｂ−１注射剤 実施例Ａ−８の方法で調製したＴＣＬＦ混合品２ＣＬＯ
ＯＯ単位を２００−の生理食塩水に溶解し、メンブラン
フィルタ−を用いて無菌的に濾過する。

濾液を滅菌したガラス容器に２−ずつ充填して凍結乾燥
し、これを密栓して、凍結乾燥粉末製剤とする。

本品は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療に好適で
ある。

実施例　Ｂ−２軟膏剤 実施例Ａ−８の方法で調製したＴＣＬＦ混合品を常法に
従い少量の流動パラフィンに研和した後、ワセリンを加
え５０単位／ｆの軟膏薬とした。

本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に好適であ
る。

実施例　Ｂ　−１点眼剤 蒸溜水８ｏｏ　ｍｔｔ　（！：β−フェニルエチルアル
コール５ｍ／と実施例Ａ−６の方法で調製したＴＣＬＦ
混合品の４０，０００単位とに等張化するよう食塩を加
え蒸溜水で１，０００−とじ点眼剤とした。

本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適である。

実施例　Ｂ−４腸溶性錠剤 実施例Ａ−８の方法で調製した分子量１万〜２万のＴＣ
ＬＦを常法に従って澱粉とマルトースとを混合使用して
打錠するに際し、このＴＣＬＦを製品１錠（１００■）
当り２，０００単位になるように含有せしめて錠剤を製
造し、これにメチルセルロースフタレートをコーティン
グして腸溶性錠剤とした。

本品は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好適である
。

特許出願人 手　　続　　補　　正　　書 昭和５６年１２月２９日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 Ｌ　事件の表示 昭和５６年特許願第１８７６２７号 ２　発明の名称 標的細胞障害性因子を含有する 悪性腫瘍治療剤とその製造方法 ａ　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 屯　補正の対象 願書および明細書

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　標的細胞障害性因子を含有することを特徴と
   する悪性腫瘍治療剤。
2. （２）標的細胞障害性因子が分子量約１〜１０万で約５
   〜４５％の糖質を含有する糖蛋白質であることを特徴と
   する特許請求の範囲（１）項記載の悪性腫瘍治療剤。
3. （３）標的細胞障害性因子が分子量約１〜２万、約ａ５
   〜５万及び約７〜９万の少くとも１種以上を含有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲（１１項又は（２）項記
   載の悪性腫瘍治療剤。
4. （４）標的細胞障害性因子をダラム当り５単位以上含有
   することを特徴とする特許請求の範囲（１１項、（２）
   項又は（３）項記載の悪性腫瘍治療剤。
5. （５）　　標的細胞障害性因子をヒトインターフェロン
   とともに含有するととを特徴とする特許請求の範囲（１
   ）項、（２）項、（３）項又は（４）項記載の悪性腫瘍
   治療剤。
6. （６）標的細胞障害性因子が、ヒト由来のＢ　ＩＪンパ
   芽球様細胞の産生じたものであることｔ特徴とする特許
   請求の範囲（１）項、（２）項、（３）項、（４）項又
   は（５）項記載の悪性腫瘍治療剤。
7. （７）標的細胞障害性因子が、標的細胞障害性因子産生
   能を有する培養株化されたヒト由来のＢ　ＩＪンパ芽球
   様細胞をヒト以外の温血動物体内に直接移植するか、ま
   たは拡散チャンバー内へ接種して、その温血動物の体液
   の供給を受けながら増殖させて得られるヒト由来ＯＢ　
   ＩＪンバ芽球様細胞に標的細胞障害性因子誘導剤を作用
   させ、生成した標的細胞障害性因子を精製採取したもの
   であることを特徴とする特許請求の範囲Ｃ１１項、（２
   ）項、（３）項、（４）項、（５）項又は（６）項記載
   の悪性腫瘍治療剤。
8. （８）分子量約１〜１０万、糖質約５〜４５チの標的細
   胞障害性因子を含有せしめることを特徴とする悪性腫瘍
   治療剤の製造方法。
9. （９）標的細胞障害性因子をダラム当シロ単位以上含有
   せしめることを特徴とする特許請求の範囲（８）項記載
   の悪性腫瘍治療剤の製造方法。 ０〔標的細胞障害性因子が、培養株化されたヒト由来の
   Ｂ　ＩＪンパ芽球様細胞から産生させ精製採取したもの
   であることを特徴とする特許請求の範囲（８）項又は（
   ９）項記載の悪性腫瘍治療剤の製造方法。