JPH0446928B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0446928B2 JPH0446928B2 JP56112914A JP11291481A JPH0446928B2 JP H0446928 B2 JPH0446928 B2 JP H0446928B2 JP 56112914 A JP56112914 A JP 56112914A JP 11291481 A JP11291481 A JP 11291481A JP H0446928 B2 JPH0446928 B2 JP H0446928B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lymphotoxin
- cells
- human
- animal
- derived
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、リンホトキシンを含有する抗リンホ
トキシン感受性疾患剤に関する。 リンホトキシンは、青木隆一ほか共著「リンホ
カイン」、新免疫学叢書６、1979年医学書院、
Bloom、B.R.＆Glade、P.R.共編「In vitro
methods in cell mediated immunity」
Academic Press、1971年、などにも記載されて
いるように、例えば、感作されたリンパ細胞に抗
原を作用させるか、ミトーゲンとしてフイトヘマ
グルチニン、コンカナバリンＡをはじめとするリ
ンホトキシン誘導剤を細胞に作用させることによ
つて、その細胞内外に誘導生成させる蛋白性質物
質であつて、細胞障害機能を持つ物質に与えられ
た名称であり、特に腫瘍細胞に対して細胞障害機
能を持つていることは公知である。 リンホトキシンの持つこのような機能から、リ
ンホトキシンはその発見の当初より悪性腫瘍治療
剤として期待されて来た。 リンホトキシンは、ヒトをはじめ種々の動物の
リンパ細胞から調製されて来たが、ヒトの治療に
供するには、ヒトの生細胞由来であることが、治
療上に生ずる抗原性などの副作用面において極め
て安全であり、優れている。 従来から、リンホトキシンの調製に使用されて
来たヒトの生細胞には白血球がある。しかしなが
ら、白血球はヒトの新鮮血から分離して調製され
るものであり、その保存が困難であつて、大量に
安価に供給することは極めて困難である。このよ
うな理由から、ヒトの治療に供し得るリンホトキ
シンの製造は、未だ工業的規模で実施されるまで
に至つていない。 本発明者らは、工業的規模で容易に実施し得る
リンホトキシンの製造方法を検討し、そのリンホ
トキシンが悪性腫瘍の治療剤として有用であるか
否かを鋭意研究して来た。 その結果、培養株化されたヒト由来の細胞を生
体外（ir vitro）の栄養培地に接種し、増殖させ
るのではなく、ヒト以外の温血動物体内に移植
し、または、拡散チヤンバー内に接種してその動
物体から栄養物を含有する体液の供給を受けつつ
増殖させ、得られる細胞に生体内または生体外で
リンホトキシン誘導剤を作用させることによつ
て、リンホトキシンが高活性で誘導生成され、こ
れを精製分取することによつてリンホトキシンが
多量容易に製造し得ることを見いだし、そのリン
ホトキシンが悪性腫瘍の治療剤として優れている
ことを確認して本発明を完成した。 本発明において使用されるリンホトキシンの製
造方法は、生細胞を生体外（in vitro）で増殖さ
せる場合とは違つて、高価な血清などを含む栄養
培地が不要または大幅に節約できるばかりでな
く、細胞増殖中の維持管理も極めて容易であり、
その上誘導生成されるリンホトキシン活性が高い
特徴を有している。即ち、培養株化されたヒト由
来の細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、あ
るいは、その動物の体液の供給を受けることので
きる拡散チヤンバー内に収容し、このチヤンバー
を動物体内に埋設し通常の飼育をすれば、温血動
物体から供給される栄養物を含有する体液を利用
してその細胞が容易に増殖しうるのである。更に
生体外（in vitro）で増殖させる場合と比較し
て、この細胞の増殖が安定していること、その増
殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多いこ
と、更には細胞当りのリンホトキシンの収量が著
増することも大きな特徴である。本発明で使用す
る培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒト以外の
温血動物体内に移植して容易に増殖し得てしかも
リンホトキシン産生能を有するものであればよ
く、例えば「Journal of Clinical Microbiology
Vol.1」116〜117頁（1975年）に記載されている
Namalva細胞、Ｉ、Miyoshi著「Nature
Vol.267」843〜844頁（1977年）に記載されてい
るBALL−１細胞、TALL−１細胞、NALL−１
細胞、「Journal of Immunology Vol.113」1334
〜1345頁（1974年）記載のＭ−7002細胞、Ｂ−
7101細胞などのほか、マクロフアージ、繊維芽細
胞なども自由に使用され、また、これら細胞のリ
ンホトキシン産生能を持つ遺伝子を、例えばポリ
エチレングリコール、センダイウイルスなどを利
用する細胞融合の手段や、DNAリガーゼ、制限
酵素（ヌクレアーゼ）、DNAポリメラーゼなどの
酵素を利用する遺伝子組み換えの手段などによつ
て、より容易に継代培養しうる培養株化されたリ
ンパ芽球様細胞などに導入し、その増殖速度を高
めたり、細胞当りのリンホトキシン産生能を高め
たりして使用してもよく、本明細書に記載する株
化細胞のみに限定されるものではなく、これらの
細胞は、後に述べるリンホトキシンを誘導生成さ
れるまでの過程で、単独で又は２種以上を混合し
て自由に使用される。必要ならば、これに、例え
ばヒトの新鮮血から精製される白血球を併用する
こともできる。 本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞
が増殖し得るものであればよく、例えばにニワト
リ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサ
ギ、ヤギ、ブタ、ウシ、モルモツト、ラツト、ハ
ムスター、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳
類が使用できる。 これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好
ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、そ
の反応をできるだけ抑えるため、使用する動物は
できるだけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、また
は新生期、幼少期のものの方が好ましい。 また、これらの動物に例えば200〜600レム程度
のエツクス線若しくはガンマ線を照射するか、ま
たは抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射するな
どの前処理をほどこして、免疫反応を弱めて移植
してもよい。 使用する動物がヌードマウスの場合には、成長
したものであつても免疫反応が弱いので、これら
の前処理を必要とすることなく、培養株化された
ヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖できるの
で特に好都合である。 また、培養株化されたヒト由来の細胞を、例え
ば、先づハムスターに移植し増殖させた後、この
細胞を更にヌードマウスに移植するなどのよう
に、ヒト以外の温血動物間で移植してヒト由来の
細胞の増殖をより安定化したり、更にそれらから
誘導生成されるリンホトキシン量を増加させるこ
とも自由である。 この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同網
間、同門間移植であつてもよい。ヒト由来の細胞
を移植する動物体内の部位は、移植した細胞が増
殖しうる部位であればよく、例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。 また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植す
ることなく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性
の濾過膜、例えば孔経約10-7〜10-3ｍを有するメ
ンプランフイルター、限外濾過膜またはホローフ
アイバーなどを設けた公知の各種形状、大きさの
拡散チヤンバーを動物体内、例えば腹腔内に埋設
して、動物体からの栄養物を含む体液の供給を受
けつつ、そのチヤンバー内で前述の培養株化され
たヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。 また必要に応じて、このチヤンバー内の栄養物
を含む溶液を動物体内の体液と接続し、潅流させ
るようにしたチヤンバーを、例えば動物体表に取
付け、チヤンバー内のヒト由来の細胞の増殖状態
を透視できるようにすることも、また、このチヤ
ンバー部分のみを着脱交換できるようにして動物
を屠殺せずに寿命一杯細胞を増殖させて、動物固
体当りの細胞生産量を更に高めることもできる。
これらの拡散チヤンバーを利用する方法は、ヒト
由来の細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒ
ト由来の細胞のみが容易に採取できるだけでな
く、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないの
で、免疫反応を抑制する前処理の必要もなく、各
種温血動物を自由に利用できる特徴を有してい
る。 移植した動物の維持管理は、その動物の通常の
飼育管理を続ければよく、移植後といえども特別
の取扱いは何ら必要としないので好都合である。 ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は、通
常１〜10週の期間で目的を達成することができ
る。このようにして得られるヒト由来の細胞数
は、動物固体当り約107〜1012個、またはそれ以
上に達することも見出した。 換言すれば、本発明で使用されるリンホトキシ
ンの製造方法により増殖させたヒト由来細胞数
は、動物固体当り移植した細胞数の約102〜107
培、またはそれ以上にも達し、生体外の栄養培地
に接種して増殖させる場合の約101〜106培、また
はそれ以上にも達して、リンホトキシンの製造の
ために極めて好都合である。 このようにして増殖させたヒト由来の生細胞か
らリンホトキシンを誘導生成させる方法は自由で
ある。それが増殖した動物体内のままでリンホト
キシン誘導体を作用させることもできる。例え
ば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の
細胞に、または皮下に生じた腫瘍細胞に、リンホ
トキシン誘導体を直接作用させてリンホトキシン
を誘導生成させ、次いでその腹水または腫瘍から
リンホトキシンを精製分取すればよい。 また、ヒト由来の増殖細胞を動物体内から取り
出し、生体外でリンホトキシン誘導剤を作用させ
てリンホトキシンを誘導生成させることもでき
る。例えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を
分取し、または皮下に生じたヒト由来の細胞を含
む腫瘍を摘出、分散し、得られる細胞を約20〜40
℃に保つた栄養培地に細胞濃度が約105〜108／ml
になるように浮遊させ、これにリンホトキシン誘
導剤を作用させることによつてリンホトキシンを
誘導生成させ、これを精製分取すればよい。 更に、ヒト由来の細胞を拡散チヤンバー内で増
殖させた場合は、増殖させた細胞をチヤンバー内
のままで、またはチヤンバーから取り出して、リ
ンホトキシン誘導剤を作用させ、リンホトキシン
を誘導生成させることもできる。 また、例えば増殖させたヒト由来の細胞に先づ
動物体内のままでリンホトキシンを誘導生成させ
た後、次いで同一動物固体の特定の部位または全
体から採取したヒト由来の細胞に動物体外でリン
ホトキシンを誘導生成させる方法、また一度リン
ホトキシンの誘導生成に使用した細胞を更に２度
以上リンホトキシンの誘導生成に使用する方法、
または動物体内に埋設、若しくは接続するチヤン
バーを交換して得られる細胞数を増殖させる方法
などによつて、使用する動物個体当りのリンホト
キシン生成量を更に高めることも自由である。 リンホトキシン誘導剤としては、通常、例えば
フイトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、ポー
クウイードミトーゲン、リポポリサツカリド、エ
ンドトキシン、多糖類、細菌などのミトーゲンお
よびウイルス、核酸などの一種若しくは二種以上
が用いられる。 また、感作化された細胞にとつて抗原もリンホ
トキシン誘導剤である。 このようにして誘導生成されたリンホトキシン
は、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾
過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うことに
よつて、同時に誘導生成されたインターフエロン
などと容易に精製分離し、採取することができ
る。更に高度の精製を必要とする場合には、例え
ばイオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾過、等電
点分画、電気泳動、イオン交換クロマトグラフイ
ー、高速液体クロマトグラフイー、カラムクロマ
トグラフイーなどの公知の方法を組合せれば、最
高純度のリンホトキシンを採取することも可能だ
が、フイトマグルチニン−セフアロースを用いた
アフイニテイクロマトグラフイーにより、高純度
のリンホトキシンを極めて簡便かつ迅速に製造で
きるので、非常に好都合である。この場合、フイ
トヘマグルチニンはフイトヘマグルチニン−Ｐ、
フイトヘマグルチニン−Ｍ、フイトヘマグルチニ
ン−Ｅなどどんなフイトヘマグルチニンを用いて
もよい。 リンホトキシンは、その分子量から、７〜９
万、3.5〜５万、１〜２万の３種、すなわち、α、
βおよびγ−リンホトキシンが存在することが報
告さている〔Cohenら編「Biology of the
Lmphokines」Academic Press（1979年）〕。リン
ホトキシンの活性は、Bloom、B.R.＆Glade、P.
R.共編「In vitro methods in cell−mediated
immunity」Academic Press（1979年）に報告さ
れているマウスＬ細胞を使用して、一定時間培養
後の生残細胞数を測定する公知の方法を用いた。 本発明における抗リンホトキシン感受性疾患剤
の有効成分であるリンホトキシンは、例えば次の
ような製造例により調製できる。 成長したヌードマウスの皮下に、培養株化され
たBALL−１細胞を移植した後、通常の方法で３
週間飼育した。皮下に生じた約10ｇの腫瘍を摘出
し細切した後、トリプシン含有の生理食塩水に懸
濁して細胞を分散分取した。この細胞をヒト血清
5v／ｖ％含有するPH7.2のEagleの最小基本培地で
洗浄し37℃に保つた同じ組成の培地に細胞濃度が
約５×106／mlになるよう希釈し、これにフイト
ヘマグルチニンを約20μｇ／mlの割合で加えて２
日間保つてリンホトキシンを誘導生成せしめた。
これを４℃、約1000ｇで遠心分離し、沈澱物を除
去し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリン酸塩緩
衝液を含有する生理食塩水で21時間透析し、更に
精密濾過して得た瀘液を濃縮し、凍結乾燥してリ
ンホトキシン活性を含有する粉末を得た。得られ
た粉末をG.Bodoの報告（Symposium on
preparation、standardization and clinical use
of interfer on、llth International
Immunobiological Symposium 889 June 1977、
Zagreb.Yugoslavia）に準じてイオン交換体への
吸脱着、ゲル濾過による分子量分画、濃縮および
精密濾過などの手段によりインターフエロンを除
去し、更に硫安塩析、フイトヘマグルチニン−セ
フアロースアフイニテイークロマトグラフイーに
より精製し、高純度リンホトキシンを得た。 このようにして得られたリンホトキシンは、比
活性30000単位／mgであつた。 更に、ゲル濾過法により分子量分画したとこ
ろ、α−リンホトキシン（分子量７〜９万）、β
−リンホトキシン（分子量3.5〜５万）、およびγ
−リンホトキシン（分子量１〜２万）の３種類
が、活性量比約１：１：２の割合で分取された。 以下、本発明の有効成分であるリンホトキシン
の有効性、毒性、用法および容量について説明す
る。 実験例 １ BALB／Ｃ由来ヌードマウスに人乳癌組織片
を背部皮下に移植した。腫瘍体積が約200mm3の時
期から前述の製造例で得られたα−、β−、γ−
リンホトキシン混合品（以下、単にリンホトキシ
ンと称する。）を４および40単位／Kg、１日２回
に分けて静注し、15日目にマウスを殺し、腫瘍重
量を測定した。その結果を第１表に示した。な
お、対照はリンホトキシン無含有生理食塩水を静
注した。
トキシン感受性疾患剤に関する。 リンホトキシンは、青木隆一ほか共著「リンホ
カイン」、新免疫学叢書６、1979年医学書院、
Bloom、B.R.＆Glade、P.R.共編「In vitro
methods in cell mediated immunity」
Academic Press、1971年、などにも記載されて
いるように、例えば、感作されたリンパ細胞に抗
原を作用させるか、ミトーゲンとしてフイトヘマ
グルチニン、コンカナバリンＡをはじめとするリ
ンホトキシン誘導剤を細胞に作用させることによ
つて、その細胞内外に誘導生成させる蛋白性質物
質であつて、細胞障害機能を持つ物質に与えられ
た名称であり、特に腫瘍細胞に対して細胞障害機
能を持つていることは公知である。 リンホトキシンの持つこのような機能から、リ
ンホトキシンはその発見の当初より悪性腫瘍治療
剤として期待されて来た。 リンホトキシンは、ヒトをはじめ種々の動物の
リンパ細胞から調製されて来たが、ヒトの治療に
供するには、ヒトの生細胞由来であることが、治
療上に生ずる抗原性などの副作用面において極め
て安全であり、優れている。 従来から、リンホトキシンの調製に使用されて
来たヒトの生細胞には白血球がある。しかしなが
ら、白血球はヒトの新鮮血から分離して調製され
るものであり、その保存が困難であつて、大量に
安価に供給することは極めて困難である。このよ
うな理由から、ヒトの治療に供し得るリンホトキ
シンの製造は、未だ工業的規模で実施されるまで
に至つていない。 本発明者らは、工業的規模で容易に実施し得る
リンホトキシンの製造方法を検討し、そのリンホ
トキシンが悪性腫瘍の治療剤として有用であるか
否かを鋭意研究して来た。 その結果、培養株化されたヒト由来の細胞を生
体外（ir vitro）の栄養培地に接種し、増殖させ
るのではなく、ヒト以外の温血動物体内に移植
し、または、拡散チヤンバー内に接種してその動
物体から栄養物を含有する体液の供給を受けつつ
増殖させ、得られる細胞に生体内または生体外で
リンホトキシン誘導剤を作用させることによつ
て、リンホトキシンが高活性で誘導生成され、こ
れを精製分取することによつてリンホトキシンが
多量容易に製造し得ることを見いだし、そのリン
ホトキシンが悪性腫瘍の治療剤として優れている
ことを確認して本発明を完成した。 本発明において使用されるリンホトキシンの製
造方法は、生細胞を生体外（in vitro）で増殖さ
せる場合とは違つて、高価な血清などを含む栄養
培地が不要または大幅に節約できるばかりでな
く、細胞増殖中の維持管理も極めて容易であり、
その上誘導生成されるリンホトキシン活性が高い
特徴を有している。即ち、培養株化されたヒト由
来の細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、あ
るいは、その動物の体液の供給を受けることので
きる拡散チヤンバー内に収容し、このチヤンバー
を動物体内に埋設し通常の飼育をすれば、温血動
物体から供給される栄養物を含有する体液を利用
してその細胞が容易に増殖しうるのである。更に
生体外（in vitro）で増殖させる場合と比較し
て、この細胞の増殖が安定していること、その増
殖速度が大きいこと、得られる細胞量が多いこ
と、更には細胞当りのリンホトキシンの収量が著
増することも大きな特徴である。本発明で使用す
る培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒト以外の
温血動物体内に移植して容易に増殖し得てしかも
リンホトキシン産生能を有するものであればよ
く、例えば「Journal of Clinical Microbiology
Vol.1」116〜117頁（1975年）に記載されている
Namalva細胞、Ｉ、Miyoshi著「Nature
Vol.267」843〜844頁（1977年）に記載されてい
るBALL−１細胞、TALL−１細胞、NALL−１
細胞、「Journal of Immunology Vol.113」1334
〜1345頁（1974年）記載のＭ−7002細胞、Ｂ−
7101細胞などのほか、マクロフアージ、繊維芽細
胞なども自由に使用され、また、これら細胞のリ
ンホトキシン産生能を持つ遺伝子を、例えばポリ
エチレングリコール、センダイウイルスなどを利
用する細胞融合の手段や、DNAリガーゼ、制限
酵素（ヌクレアーゼ）、DNAポリメラーゼなどの
酵素を利用する遺伝子組み換えの手段などによつ
て、より容易に継代培養しうる培養株化されたリ
ンパ芽球様細胞などに導入し、その増殖速度を高
めたり、細胞当りのリンホトキシン産生能を高め
たりして使用してもよく、本明細書に記載する株
化細胞のみに限定されるものではなく、これらの
細胞は、後に述べるリンホトキシンを誘導生成さ
れるまでの過程で、単独で又は２種以上を混合し
て自由に使用される。必要ならば、これに、例え
ばヒトの新鮮血から精製される白血球を併用する
こともできる。 本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞
が増殖し得るものであればよく、例えばにニワト
リ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ウサ
ギ、ヤギ、ブタ、ウシ、モルモツト、ラツト、ハ
ムスター、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳
類が使用できる。 これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好
ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、そ
の反応をできるだけ抑えるため、使用する動物は
できるだけ幼若な状態、即ち卵、胚、胎児、また
は新生期、幼少期のものの方が好ましい。 また、これらの動物に例えば200〜600レム程度
のエツクス線若しくはガンマ線を照射するか、ま
たは抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射するな
どの前処理をほどこして、免疫反応を弱めて移植
してもよい。 使用する動物がヌードマウスの場合には、成長
したものであつても免疫反応が弱いので、これら
の前処理を必要とすることなく、培養株化された
ヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖できるの
で特に好都合である。 また、培養株化されたヒト由来の細胞を、例え
ば、先づハムスターに移植し増殖させた後、この
細胞を更にヌードマウスに移植するなどのよう
に、ヒト以外の温血動物間で移植してヒト由来の
細胞の増殖をより安定化したり、更にそれらから
誘導生成されるリンホトキシン量を増加させるこ
とも自由である。 この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同網
間、同門間移植であつてもよい。ヒト由来の細胞
を移植する動物体内の部位は、移植した細胞が増
殖しうる部位であればよく、例えば尿液腔、静
脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。 また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植す
ることなく、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性
の濾過膜、例えば孔経約10-7〜10-3ｍを有するメ
ンプランフイルター、限外濾過膜またはホローフ
アイバーなどを設けた公知の各種形状、大きさの
拡散チヤンバーを動物体内、例えば腹腔内に埋設
して、動物体からの栄養物を含む体液の供給を受
けつつ、そのチヤンバー内で前述の培養株化され
たヒト由来の細胞を何れも増殖させることができ
る。 また必要に応じて、このチヤンバー内の栄養物
を含む溶液を動物体内の体液と接続し、潅流させ
るようにしたチヤンバーを、例えば動物体表に取
付け、チヤンバー内のヒト由来の細胞の増殖状態
を透視できるようにすることも、また、このチヤ
ンバー部分のみを着脱交換できるようにして動物
を屠殺せずに寿命一杯細胞を増殖させて、動物固
体当りの細胞生産量を更に高めることもできる。
これらの拡散チヤンバーを利用する方法は、ヒト
由来の細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒ
ト由来の細胞のみが容易に採取できるだけでな
く、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないの
で、免疫反応を抑制する前処理の必要もなく、各
種温血動物を自由に利用できる特徴を有してい
る。 移植した動物の維持管理は、その動物の通常の
飼育管理を続ければよく、移植後といえども特別
の取扱いは何ら必要としないので好都合である。 ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は、通
常１〜10週の期間で目的を達成することができ
る。このようにして得られるヒト由来の細胞数
は、動物固体当り約107〜1012個、またはそれ以
上に達することも見出した。 換言すれば、本発明で使用されるリンホトキシ
ンの製造方法により増殖させたヒト由来細胞数
は、動物固体当り移植した細胞数の約102〜107
培、またはそれ以上にも達し、生体外の栄養培地
に接種して増殖させる場合の約101〜106培、また
はそれ以上にも達して、リンホトキシンの製造の
ために極めて好都合である。 このようにして増殖させたヒト由来の生細胞か
らリンホトキシンを誘導生成させる方法は自由で
ある。それが増殖した動物体内のままでリンホト
キシン誘導体を作用させることもできる。例え
ば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の
細胞に、または皮下に生じた腫瘍細胞に、リンホ
トキシン誘導体を直接作用させてリンホトキシン
を誘導生成させ、次いでその腹水または腫瘍から
リンホトキシンを精製分取すればよい。 また、ヒト由来の増殖細胞を動物体内から取り
出し、生体外でリンホトキシン誘導剤を作用させ
てリンホトキシンを誘導生成させることもでき
る。例えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を
分取し、または皮下に生じたヒト由来の細胞を含
む腫瘍を摘出、分散し、得られる細胞を約20〜40
℃に保つた栄養培地に細胞濃度が約105〜108／ml
になるように浮遊させ、これにリンホトキシン誘
導剤を作用させることによつてリンホトキシンを
誘導生成させ、これを精製分取すればよい。 更に、ヒト由来の細胞を拡散チヤンバー内で増
殖させた場合は、増殖させた細胞をチヤンバー内
のままで、またはチヤンバーから取り出して、リ
ンホトキシン誘導剤を作用させ、リンホトキシン
を誘導生成させることもできる。 また、例えば増殖させたヒト由来の細胞に先づ
動物体内のままでリンホトキシンを誘導生成させ
た後、次いで同一動物固体の特定の部位または全
体から採取したヒト由来の細胞に動物体外でリン
ホトキシンを誘導生成させる方法、また一度リン
ホトキシンの誘導生成に使用した細胞を更に２度
以上リンホトキシンの誘導生成に使用する方法、
または動物体内に埋設、若しくは接続するチヤン
バーを交換して得られる細胞数を増殖させる方法
などによつて、使用する動物個体当りのリンホト
キシン生成量を更に高めることも自由である。 リンホトキシン誘導剤としては、通常、例えば
フイトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、ポー
クウイードミトーゲン、リポポリサツカリド、エ
ンドトキシン、多糖類、細菌などのミトーゲンお
よびウイルス、核酸などの一種若しくは二種以上
が用いられる。 また、感作化された細胞にとつて抗原もリンホ
トキシン誘導剤である。 このようにして誘導生成されたリンホトキシン
は、公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾
過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うことに
よつて、同時に誘導生成されたインターフエロン
などと容易に精製分離し、採取することができ
る。更に高度の精製を必要とする場合には、例え
ばイオン交換体への吸着−溶出、ゲル濾過、等電
点分画、電気泳動、イオン交換クロマトグラフイ
ー、高速液体クロマトグラフイー、カラムクロマ
トグラフイーなどの公知の方法を組合せれば、最
高純度のリンホトキシンを採取することも可能だ
が、フイトマグルチニン−セフアロースを用いた
アフイニテイクロマトグラフイーにより、高純度
のリンホトキシンを極めて簡便かつ迅速に製造で
きるので、非常に好都合である。この場合、フイ
トヘマグルチニンはフイトヘマグルチニン−Ｐ、
フイトヘマグルチニン−Ｍ、フイトヘマグルチニ
ン−Ｅなどどんなフイトヘマグルチニンを用いて
もよい。 リンホトキシンは、その分子量から、７〜９
万、3.5〜５万、１〜２万の３種、すなわち、α、
βおよびγ−リンホトキシンが存在することが報
告さている〔Cohenら編「Biology of the
Lmphokines」Academic Press（1979年）〕。リン
ホトキシンの活性は、Bloom、B.R.＆Glade、P.
R.共編「In vitro methods in cell−mediated
immunity」Academic Press（1979年）に報告さ
れているマウスＬ細胞を使用して、一定時間培養
後の生残細胞数を測定する公知の方法を用いた。 本発明における抗リンホトキシン感受性疾患剤
の有効成分であるリンホトキシンは、例えば次の
ような製造例により調製できる。 成長したヌードマウスの皮下に、培養株化され
たBALL−１細胞を移植した後、通常の方法で３
週間飼育した。皮下に生じた約10ｇの腫瘍を摘出
し細切した後、トリプシン含有の生理食塩水に懸
濁して細胞を分散分取した。この細胞をヒト血清
5v／ｖ％含有するPH7.2のEagleの最小基本培地で
洗浄し37℃に保つた同じ組成の培地に細胞濃度が
約５×106／mlになるよう希釈し、これにフイト
ヘマグルチニンを約20μｇ／mlの割合で加えて２
日間保つてリンホトキシンを誘導生成せしめた。
これを４℃、約1000ｇで遠心分離し、沈澱物を除
去し、得られた上清をPH7.2、0.01Mリン酸塩緩
衝液を含有する生理食塩水で21時間透析し、更に
精密濾過して得た瀘液を濃縮し、凍結乾燥してリ
ンホトキシン活性を含有する粉末を得た。得られ
た粉末をG.Bodoの報告（Symposium on
preparation、standardization and clinical use
of interfer on、llth International
Immunobiological Symposium 889 June 1977、
Zagreb.Yugoslavia）に準じてイオン交換体への
吸脱着、ゲル濾過による分子量分画、濃縮および
精密濾過などの手段によりインターフエロンを除
去し、更に硫安塩析、フイトヘマグルチニン−セ
フアロースアフイニテイークロマトグラフイーに
より精製し、高純度リンホトキシンを得た。 このようにして得られたリンホトキシンは、比
活性30000単位／mgであつた。 更に、ゲル濾過法により分子量分画したとこ
ろ、α−リンホトキシン（分子量７〜９万）、β
−リンホトキシン（分子量3.5〜５万）、およびγ
−リンホトキシン（分子量１〜２万）の３種類
が、活性量比約１：１：２の割合で分取された。 以下、本発明の有効成分であるリンホトキシン
の有効性、毒性、用法および容量について説明す
る。 実験例 １ BALB／Ｃ由来ヌードマウスに人乳癌組織片
を背部皮下に移植した。腫瘍体積が約200mm3の時
期から前述の製造例で得られたα−、β−、γ−
リンホトキシン混合品（以下、単にリンホトキシ
ンと称する。）を４および40単位／Kg、１日２回
に分けて静注し、15日目にマウスを殺し、腫瘍重
量を測定した。その結果を第１表に示した。な
お、対照はリンホトキシン無含有生理食塩水を静
注した。
【表】
※ 危険率５％以下で対照の値に比し、推計
学的に有意差あり。
実験例 ２ 体重25ｇ前後のBDF1雄マウスを１群10匹と
し、２mm角に切断したルイス肺癌を背部皮下に移
植した。移植後８日目から前述の製造例で得られ
たリンホトキシンおよびγ−リンホトキシンをそ
れぞれ４および40単位／Kg、１日２回に分けて連
日静注し、21日目にマウスを殺して腫瘍重量を測
定した。 その結果を第２表に示した。なお、対照はリン
ホトキシン無含有生理食塩水を静注した。
学的に有意差あり。
実験例 ２ 体重25ｇ前後のBDF1雄マウスを１群10匹と
し、２mm角に切断したルイス肺癌を背部皮下に移
植した。移植後８日目から前述の製造例で得られ
たリンホトキシンおよびγ−リンホトキシンをそ
れぞれ４および40単位／Kg、１日２回に分けて連
日静注し、21日目にマウスを殺して腫瘍重量を測
定した。 その結果を第２表に示した。なお、対照はリン
ホトキシン無含有生理食塩水を静注した。
【表】
学的に有意差あり。
実験例 ３ 急性毒性 生後20日のマウスを使用して、前述の製造例で
得られたリンホトキシンの急性毒性試験をしたと
ころ、本リンホトキシンの毒性は極めてひくく、
腹腔内に注射した時のLD50は10000単位／Kg以上
であることが判明した。 実験例 ４ 腫瘍細胞増殖抑制作用 第３表に示すヒト由来の各種腫瘍細胞105個を
あらかじめ24時間培養した後、被検物質を添加し
た10％仔牛血清含有Eagle培地又は10％仔牛血清
含有RPMI1640倍地１ml中で37℃、５％炭酸ガス
を含む酸素ガス通気下にて48時間培養した。培養
終了後、トリパンブルーに染色されない生残細胞
数を光学顕微鏡下に計数し、増殖抑制率（％）を
次式によつて求めた。 増殖抑制率＝（１−処置群の生残細胞数／対照群の生残
細胞数）×100
実験例 ３ 急性毒性 生後20日のマウスを使用して、前述の製造例で
得られたリンホトキシンの急性毒性試験をしたと
ころ、本リンホトキシンの毒性は極めてひくく、
腹腔内に注射した時のLD50は10000単位／Kg以上
であることが判明した。 実験例 ４ 腫瘍細胞増殖抑制作用 第３表に示すヒト由来の各種腫瘍細胞105個を
あらかじめ24時間培養した後、被検物質を添加し
た10％仔牛血清含有Eagle培地又は10％仔牛血清
含有RPMI1640倍地１ml中で37℃、５％炭酸ガス
を含む酸素ガス通気下にて48時間培養した。培養
終了後、トリパンブルーに染色されない生残細胞
数を光学顕微鏡下に計数し、増殖抑制率（％）を
次式によつて求めた。 増殖抑制率＝（１−処置群の生残細胞数／対照群の生残
細胞数）×100
【表】
このように、リンホトキシンは、各種のヒト由
来の腫瘍細胞に対して明らかな増殖抑制効果を示
した。 以上の実験からも明らかなように、本発明のリ
ンホトキシンは、その有効用量からも極めて安全
であり、リンホトキシン感受性疾患に用いること
ができる。リンホトキシン感受性疾患とは、リン
ホトキシンによつて治療される疾患、即ち、リン
ホトキシンによつて根治され、症状が緩和され、
また、再発が防止される疾患であり、例えば乳
癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、子宮癌、胃癌、大腸
癌、白血病、リンパ腫、皮膚癌などの悪性腫瘍で
あつてもよい。 更には、悪性腫瘍に適用するにあたつては、例
えば患者の腫瘍の一部を取り、本発明のリンホト
キシンと生体外で処理することによつて腫瘍の免
疫原性を高めた後、腫瘍患者の体内に戻すことに
より、この悪性腫瘍の治療を行うこともできる。
本発明のリンホトキシンの成人１日当りの用量は
５〜500000単位であり、好ましくは局所注射およ
び点眼などの局所適用用量は５〜1000単位、軟膏
の場合10〜1000単位、静注および筋注など全身注
射の場合50〜2000単位、経口投与の場合500〜
500000単位であるが用法あるいは症状に応じて適
宜増減することができる。必要に応じて任意、慣
用の製薬用担体、基剤あるいは賦形剤とともに慣
用の方法で医薬用製剤に調製することができる。 本発明のリンホトキシンを含有する抗リンホト
キシン感受性疾患剤は、その目的に応じてその形
状を自由に選択できる。 経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤な
どの腸溶製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、
注射剤としては、例えば用時に注射用蒸溜水に溶
解して使用する凍結乾燥注射剤、その他点鼻もし
くは点眼、軟膏剤として用いることもできる。 以下に製剤の実施例を示すが、製剤はこれのみ
に限定されるものではない。 実施例 １ 注射剤 前述の製造例で調製したリンホトキシン20000
単位を200mlの生理食塩水に溶解し、メンブラン
フイルターを用いて無菌的に濾過する。瀘液を滅
菌したガラス容器に２mlずつ充填して凍結乾燥
し、これを密栓して、凍結乾燥粉末製剤とする。 本品は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療
に好適である。 実施例 ２ 軟膏剤 前述の製造例で調製したリンホトキシンを常法
に従い少量の流量バラフインに研和した後、ワセ
リンを加え50単位／ｇの軟膏薬とした。 本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に
好適である。 実施例 ３ 点眼剤 蒸溜水800mlとβ−フエニルエチルアルコール
５mlと前述の製造例で調製したリンホトキシンを
40000単位とに等張化するよう食塩を加え蒸溜水
で1000mlとし点眼剤とした。 本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適であ
る。 実施例 ４ 腸溶性錠剤 前述の製造例で調製したγ−リンホトキシンを
常法に従つて澱粉とマルトースとを混合使用して
打錠するに際し、リンホトキシンを製品１錠
（100mg）当り2000単位になるように含有せしめて
錠剤を製造し、これにメチルセルロースフタレー
トをコーテイングして腸溶性錠剤とした。 本品は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好
適である。
来の腫瘍細胞に対して明らかな増殖抑制効果を示
した。 以上の実験からも明らかなように、本発明のリ
ンホトキシンは、その有効用量からも極めて安全
であり、リンホトキシン感受性疾患に用いること
ができる。リンホトキシン感受性疾患とは、リン
ホトキシンによつて治療される疾患、即ち、リン
ホトキシンによつて根治され、症状が緩和され、
また、再発が防止される疾患であり、例えば乳
癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、子宮癌、胃癌、大腸
癌、白血病、リンパ腫、皮膚癌などの悪性腫瘍で
あつてもよい。 更には、悪性腫瘍に適用するにあたつては、例
えば患者の腫瘍の一部を取り、本発明のリンホト
キシンと生体外で処理することによつて腫瘍の免
疫原性を高めた後、腫瘍患者の体内に戻すことに
より、この悪性腫瘍の治療を行うこともできる。
本発明のリンホトキシンの成人１日当りの用量は
５〜500000単位であり、好ましくは局所注射およ
び点眼などの局所適用用量は５〜1000単位、軟膏
の場合10〜1000単位、静注および筋注など全身注
射の場合50〜2000単位、経口投与の場合500〜
500000単位であるが用法あるいは症状に応じて適
宜増減することができる。必要に応じて任意、慣
用の製薬用担体、基剤あるいは賦形剤とともに慣
用の方法で医薬用製剤に調製することができる。 本発明のリンホトキシンを含有する抗リンホト
キシン感受性疾患剤は、その目的に応じてその形
状を自由に選択できる。 経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤な
どの腸溶製剤、直腸内投与剤としては直腸坐剤、
注射剤としては、例えば用時に注射用蒸溜水に溶
解して使用する凍結乾燥注射剤、その他点鼻もし
くは点眼、軟膏剤として用いることもできる。 以下に製剤の実施例を示すが、製剤はこれのみ
に限定されるものではない。 実施例 １ 注射剤 前述の製造例で調製したリンホトキシン20000
単位を200mlの生理食塩水に溶解し、メンブラン
フイルターを用いて無菌的に濾過する。瀘液を滅
菌したガラス容器に２mlずつ充填して凍結乾燥
し、これを密栓して、凍結乾燥粉末製剤とする。 本品は、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療
に好適である。 実施例 ２ 軟膏剤 前述の製造例で調製したリンホトキシンを常法
に従い少量の流量バラフインに研和した後、ワセ
リンを加え50単位／ｇの軟膏薬とした。 本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に
好適である。 実施例 ３ 点眼剤 蒸溜水800mlとβ−フエニルエチルアルコール
５mlと前述の製造例で調製したリンホトキシンを
40000単位とに等張化するよう食塩を加え蒸溜水
で1000mlとし点眼剤とした。 本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適であ
る。 実施例 ４ 腸溶性錠剤 前述の製造例で調製したγ−リンホトキシンを
常法に従つて澱粉とマルトースとを混合使用して
打錠するに際し、リンホトキシンを製品１錠
（100mg）当り2000単位になるように含有せしめて
錠剤を製造し、これにメチルセルロースフタレー
トをコーテイングして腸溶性錠剤とした。 本品は、大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好
適である。
Claims (1)
- １ リンホトキシン産生能を有する培養株化され
たヒト由来の細胞を、ヒト以外の温血動物体内に
移植し、その温血動物の体液の供給を受けながら
増殖させて得られる細胞に、生体内または生体外
でリンホトキシン誘導剤を作用させて生成せしめ
たリンホトキシンを精製分取し、得たリンホトキ
シンを有効成分として含有する抗リンホトキシン
感受性疾患剤。
Priority Applications (14)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56112914A JPS5815921A (ja) | 1981-07-21 | 1981-07-21 | 抗リンホトキシン感受性疾患剤 |
| SE8204382A SE8204382L (sv) | 1981-07-21 | 1982-07-19 | Sett att framstella malcellysfaktor och anvendning derav |
| FR8212541A FR2513124B1 (fr) | 1981-07-21 | 1982-07-19 | Production et applications du facteur de lyse des cellules-cibles |
| KR8203215A KR870001433B1 (ko) | 1981-07-21 | 1982-07-20 | 적상적혈구(的狀赤血球) 붕괴인자의 제조 방법 |
| CH4420/82A CH664974A5 (fr) | 1981-07-21 | 1982-07-20 | Production du facteur de lyse des cellules-cibles. |
| IT48855/82A IT1196549B (it) | 1981-07-21 | 1982-07-20 | Procedimento per la produzione del fattore di lisi cellule bersaglio (tclf),prodotto ottenuto a suo impiego in terapia clinica,in particolare come agente citolitico antitumurale |
| AU86200/82A AU560793B2 (en) | 1981-07-21 | 1982-07-20 | Production of target cell lysis factor |
| GB08221100A GB2106117B (en) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Process for producing target cell lysis factor |
| AT0283582A AT387980B (de) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Verfahren zur herstellung eines die aufloesung menschlicher zellen bewirkenden faktors |
| ES514210A ES514210A0 (es) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Un procedimiento para la produccion de tclf. |
| DE3249946A DE3249946C2 (de) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | hTNF-haltiges therapeutisches Mittel gegen maligne Tumoren und dessen Verwendung |
| DE3227262A DE3227262C3 (de) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Tumor-Nekrose-Faktor und menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor |
| US06/400,487 US4495282A (en) | 1981-07-21 | 1982-07-21 | Process for producing target cell lysis factor and uses therewith |
| SE9000532A SE9000532L (sv) | 1981-07-21 | 1990-02-14 | Farmaceutisk tclf-komposition |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56112914A JPS5815921A (ja) | 1981-07-21 | 1981-07-21 | 抗リンホトキシン感受性疾患剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5815921A JPS5815921A (ja) | 1983-01-29 |
| JPH0446928B2 true JPH0446928B2 (ja) | 1992-07-31 |
Family
ID=14598641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56112914A Granted JPS5815921A (ja) | 1981-07-21 | 1981-07-21 | 抗リンホトキシン感受性疾患剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5815921A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5889195A (ja) * | 1981-11-21 | 1983-05-27 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 標的細胞障害性因子の製造方法 |
| JPH0764744B2 (ja) * | 1981-11-21 | 1995-07-12 | 株式会社林原生物化学研究所 | 標的細胞障害性因子とヒトインタ−フェロンとを有効成分として含有する悪性腫瘍治療剤 |
-
1981
- 1981-07-21 JP JP56112914A patent/JPS5815921A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5815921A (ja) | 1983-01-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL192086C (nl) | Werkwijze ter bereiding van interferonen en werkwijze ter bereiding van een geneesmiddel dat interferonen bevat. | |
| US4495282A (en) | Process for producing target cell lysis factor and uses therewith | |
| US4621050A (en) | Process for the production of human colony-stimulating factor | |
| JPS631296B2 (ja) | ||
| KR930000188B1 (ko) | 신규 림포카인(lymphokine), 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 및 이들의 제조방법 | |
| JPS6227048B2 (ja) | ||
| KR930004596B1 (ko) | 신규 림포킨(lymphokine) 및 이에 대해 특이성을 갖는 모노클로날(monoclonal) 항체의 제조 방법 | |
| JPS58107197A (ja) | ツモアネクロシスフアクタ−の製造方法 | |
| JPH0446928B2 (ja) | ||
| JPH0214039B2 (ja) | ||
| JPS5821621A (ja) | ヒトツモア・ネクロシス・ファクタ−を含有する悪性腫瘍治療剤 | |
| JP2926409B2 (ja) | 癌転移抑制因子の製造方法 | |
| KR950008569B1 (ko) | 신규 림포카인(lymphokine) 및 그 제조방법과 사용방법 | |
| JPS5888322A (ja) | 標的細胞障害性因子を含有する悪性腫瘍治療剤とその製造方法 | |
| JP2532025B2 (ja) | 新リンホカインｉｉｉを有効成分とする抗腫瘍作用を有するリンホカインの活性増強剤 | |
| KR970002165B1 (ko) | γ-인터페론의 제조방법과 그 용도 | |
| JP2518634B2 (ja) | ヒト ツモア・ネクロシス・フアクタ−の製造方法 | |
| JP2518635B2 (ja) | ヒト ツモア・ネクロシス・フアクタ− | |
| JP2850293B2 (ja) | γ−インターフェロン感受性疾患剤 | |
| KR830001817B1 (ko) | 타이프ⅱ 인터페론의 제조방법 | |
| JPH0527640B2 (ja) | ||
| KR820001174B1 (ko) | 사람 특이성 인터페론의 제조법 | |
| JPH0523755B2 (ja) | ||
| JPS61115027A (ja) | 新リンホカイン２とその製法および用途 | |
| JPS5889195A (ja) | 標的細胞障害性因子の製造方法 |