JPS589069A - 改良された抗体およびその作成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発−はイムノアッセイ等において用いられる高い特異
性と低い交叉反応性とを有すみ抗体、この種の抗体生産
能を有するクローン、？−０種の杭体を含有する抗血清
、およびこれらの製法に−する０次に本発明は、この種
の抗体重九は該抗体を含有する抗血清を用いる分析法に
関す為。 さらに本発明は、上記クローンを用いる特定抗体の製法
に関する。 ホルモン等の生体内活性物質を高感度でかつ特異的に測
定する分析法としてイムノアッセイ法が知られている。 この方法は、競合的な抗原／抗体反応を利用するもので
、一定量の抗体と可変量の抗原とを用いる分析法である
。たとえば、ラジオイムノアッセイ法は一般に次の一つ
のステップから成り立っている。 （１）　　Ｉｌｉ識抗原及び特異抗体の作成。 （２）非榔鐵技原存在下における＊ｍ抗原と特異杭体と
の反応。 （３）標識抗原と抗体との反応物からの標識抗原の分離
。 （４）簾射活性の測定１次いで標準−線を用いる定量。 標識抗体と非榔鐵抗原とを用いることもできる。 ステップｌが最も重要で掬定に用いる試殖としての抗体
は、被検物質（抗原）に対して厳書な特異性を有するこ
とが要求される。しかし、この要求が満たされない場合
がある。すなわち非常に高い特異性を有すると考えられ
るイムノアッセイにおいてさえも、用いられる抗体が被
検物質と類似構造を有する他の物質と交叉反応を生じる
場合があ〕、これがイムノアッセイの一点の７つとなる
場合がある。　　・ このような難点を克服する公知手段は次の二つの方法に
大別される。すなわち ｌ）物理化学的方法を利用して、被検物質の試料から各
種の交叉反応性物質を除去した後に測定する。 Ｊ）抗血清中の交叉反応性抗体を免疫歇着剤を用いてあ
らかじめ徴収して除去する。または検出物質に対し出来
るだけ高い特異性を有する高度に？ＩＩｌされ九抗体を
測定に用いる。 目的物質に対して最高の特異性を有する抗体を得る丸め
に、動物宿主に投与する前に担体蛋白質に抗原を化学構
造上適当な部位において、結合させることくよって、抗
体くよって認識されるべき抗原の、特異抗原決定基部位
を担体蛋白の表面に露出させることが提案されている。 特異抗原決定基部位が露出されると、低交叉反応性抗体
の産生が誘起される。 しかし現在までに行なわれて来九この種のアブリーチは
、一般に複雑な手法と金成過禍を必要とする欠点がある
。しかも交叉反応性抗体の産生を避けることができない
場合もある。仁の種の１―は、イムノアッセイ法の限界
を規定している。 本発明は、Ｄ−／ルタｉ／＠とＤ−９ジンとの共重合体
（以下Ｄ−ＧＬという）０１１１！用によって。 交叉反応性抗体の量を減少することができ、しかもある
種の物質（九とえば被検物質）Ｋ対して優れた特異性を
有する抗体を得ることがで自るという知見に基いている
。仁の共重合体（Ｄ−ＧＬ）は％　ＧＩＩ胞（抗体産生
前駆細胞）に作用して効果的な免疫無応答性（寛容性）
を誘発する。すなわちＤ−ＧＬと締金された抗原を動物
に投与し丸場合、一般に生体内のＤ−ア建ノ酸は容ａＫ
代謝されないし、重要Ｄ−ＧＬＦｉ生体内のＴ細ｊＩＩ
ＩＯ免疫応答性を集質的Ｋｌｌ起しない。従って、Ｄ　
−ＧＬと結合された抗原を動物に投与した場合、抗原と
Ｄ−ＧＩＩの結合物はＢ９ンパ球表藺の免疫グ胃プリン
受容体と結会し、これＫよって、辷れらＯ＃ｌ施内に不
可逆的な無応答性（寛容性）を誘起する。 従って本発明は第１抗原に対し高い特異性を有し、′＊
丸上記第７抗原と構造的Ｋ１１ｌ似し九一つ以上０＊原
決定畠を有する菖Ｊ杭原に対して低い交叉性を有す為目
的とする抗体を作成する方法において、Ｄ−ダルタ電ン
蒙と１−リジンとＯ共重合体と上ｌ！館ココ抗原の共有
結合物を哺乳動物Ｋｍ与し、これＫよって上１ｅｊｌｌ
Ｊ抗原に対す為効果的な免Ｉ１２無応答性を上記動物Ｋ
ｌｌ起した後に上記動物を上記第１抗原て免疫すること
を特徴とする改嵐された抗体の作成方法を提供する。 本発明の方法は、上記の他の抗原（第２抗原）とＤ−Ｇ
Ｌ　（Ｄ−／ルタンイ酸とＤ−リジンとの共重合体）と
の共有結合物を哺乳動物に投与することｋよって抗原に
対して免疫無応答性を誘起した後、との哺乳動物を上記
の第１抗原で免疫することを特徴としている。 本発明の方法によ如、上記抗体を産生する能力を有する
一定の遺伝的構造をもつ細胞（以下クローンという）を
哺乳動物の生体内に産生することができる。従って１本
発明によるＤ−ＧＬと交叉反応性抗原との結合物を哺乳
動物に投与することによ如、交叉反応性抗原に対して実
質的に有効な免疫無応答性を誘起し、次にこＯ哺乳動物
を所望の抗原すなわち特定の免疫決定基を含有する抗原
で免疫することによって低交叉反応性で特定の決定基に
対して高い特異性を備え九抗体を産生ずることができる
。 上述Ｏ高い特異性を有する抗体を、精製抗体の形で、を
九は上記抗体を含有する杭血清の形で産生することがで
自ゐ、鵞え哺乳−物の生体からと東出し九ターーンを抗
体産生に利用することもで自る。すなわち所ＭＥり夕謬
−ンを適当な朧瘍細麿との融食（ハイブリッド化）Ｋよ
って永久に生自クツけさぜ、このターーンから抗体を産
生することもで自為、質って、一度クロー／が得られる
と、もとの生龜九哺乳動物がいなくても所望の抗体を産
生することがで自る。 従って、誘発＠によシ、上記の方法で得られたりｐ−ノ
を利用する上記抗体ＧＩＩ法が提供される。よく知られ
えように、適当なり四−ンが入手で龜れば、これを適当
な腫瘍細胞と締金することによ〉、融會１ＩＡｊｌｉｉ
（）飄イプリドーマ）を容ＴｏＫ４ｊｈることがで自る
。九とえば、ある種のりｐ−ンと骨髄腫瘍細胞（ｘＩ３
ｒ＊ｌｏ＋ｍ　ｃａｌｌｇ　）　０癒金細ＩＩＩ（ハイ
プリドーマ）は文献中に、九とえばケー２−（！δｈｌ
＠ｒ　）等〔ネーチェア（−一）。 Ｊｌ４巻、参Ｆｊ−４ｃＦ７（／Ｆ７ｊ）、およびユー
ロピアン　ジャーナル、オプ、イミュノージー（ｍｕｒ
、　Ｊ、！ｍｍｕｎｏ１．　）、４巻、！／／−Ｊ／デ
（ｌｒｙｊ））Ｋよｌ；（ルｘタイｙ　（Ｍｉｌｓｔｏ
ｉｎ）等（ＭＩＬｔｕｒｅ。 ２４４巻、ｊｊｔＯ−４１２（／り７７）〕によ如；そ
してクオルシエ（Ｗａｌｓｈ　）　（Ｍａｔｕｒｅ、コ
ａａ６％参りＩ（ｌデフ７）〕により上記されている。 次いで諌ハイブリッド細脂を麹の動物Ｋ１１ｌｌｌする
と、諌動物生体内（例えばマウスの腹水中など）で増殖
を続け、大量の特異抗体を産生する。従ってこのハイブ
リッド細胞は所望の抗体の新丸な源泉となシ得る。 次に本発明は、前述の方法によ〉得られ九抗体またはこ
の種の抗体を含有する抗血清を利用し九イムノアッセイ
法を提供す為、上記抗体は上記物質に対して特異性を有
しているので、従って、アッセイは抗体と上記物質との
反応によって行なわれる◎ この場合、アッセイされるべき物質は抗原として作用す
るのである。本発明によるイムノアッセイ渋を、ラジオ
イムノアッセイ渋、非アイソトープイムノアラ竜イ法（
たとえば酵素、遊離基、細胞、ウィルス、金属イオン、
螢光体、化学的発光体勢で標識を行った方法）で行なう
むとかで會る０本発１ｉＫよるアラ七イ法は、交叉反応
性抗原の存在下にも行なうことができる。 本発明の目的に利用されるＤ−１）Ｌ社分子量が、約２
７．ｔ）００ｆｉら約／２ＱＯＯ００４ｈｔ）＃ヨイ＊
　Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンのモル比は７０：Ｊｌ
）〜ＪＩＳニア０のものが利用され、たとえばＤ−グル
タミン酸：Ｄ−リジン＝ｔＯ：＋ｏのものである。この
種の共重合体は、例えばＭｌｌ・ａ−４ｅａａ　（米国
）社から市販されているが。 一方、常法により、Ｄ−グルタミン酸−ｒ−メチルエス
テルのＮ−力＾ボン駿無水１１ｋｌトｔ−Ｍ−カルボベ
ンジルオキシ−Ｌ　−１７’／ンのＮ　−カルボン酸無
水物とを適当なアミンの存在下共重合し、次いで保験基
をと）はずすことによって調製することもできる。 イムノアッセイ用抗体産生に、たとえば多数の天然物を
用いることができるう好ましい材料の例はステロイド類
、及びそのグルクロン酸抱合体および硫酸抱合体、カテ
コールアミン類、はデチド類及びそのサブユニットなら
びに関連化合物（フラグメント）その他の各種薬剤等で
ある。 社体的なステロイドの例は、テストステロン（以下Ｔと
略す）、５α−ジヒドロテストステロン（１：Ｊ下ＤＴ
（Ｔ　ト略ｔ　）　、アンドロステロン（Ａｎｄｒｏｓ
ｔｓｒｏｎｅ　）、エチオコラノ０７（ＩＣｔｉｏ−ｃ
ｈｏｌａｎｏｌｏｎｅ　）、プログステｏ　ン（Ｐｒｏ
ｇｅｓｔｅｒｏｎｅ　）１７α−ハイドロキシプログス
テロン（１７α−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅａｔｅｒｏ
ｎｅ　）、プレグネノｏｙ（Ｐｒｏ−ｇｎｅｎ０１０ｎ
θ）、テヒドロエピアンＰロステロン（ＤｅｈｙｃＬｒ
ｏｅｐｉａｎｄｒｏａｔｅｒｏｎｓ　）、エストラジオ
−Ａ／　（０ｅｓｔｒａｄｉｏｌ　）、エストｏ　ｙ　
（０ｅｓｔｒｏｎｅ　）、エストリオール（０ｅｓｔｒ
ｉｏｌ　）　、アルドステロン（ＡｌｄＯｓｔｅｒｏｎ
・）、デオキシコルチプステロン（Ｄｅｏｘｙｃｏｒｔ
ｉｃｏｅｔｅｒｏｎａ　）、コルチゾール（Ｃｏｒ−ｔ
ｉｓｏｌ　）、コルチゾｙ　（Ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ　）
、コルチ＝ｔｘテｏ　ｙ　（ＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒＯ
ｎｅ　）　、　１１−デオキシコーチゾール（１１−ａ
ｅｏｘｙｃｏｒｔｔａｏｌ）　、胆汁酸（グリップール
酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　）、コール酸
（Ｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　）、デオキシコール酸（Ｄ
ｅ−＝ｏｘｙｃｈｏｌｉｃ　ａａｌ　）、リトコール酸
（ＬｉｔｈＯＱｈｏ１１０ａｃｉ４　）など）及びその
抱合体である。 カテコールアミン類の例は、ドパーミン（Ｄｏ−ｐａｍ
ｉｎｅ　）、ノルエピネフリｙ　（Ｎｏｒｅｐｉｎｅｐ
ｈｒｉｎｅ　）、エピネフリｙ　（Ｆｆｐｉｎｅｐｈｒ
ｉｎｅ　）である。 はデチドホルモン類の例はガストリン（Ｇａｓ−チ ｔｒｉｎ　）　、コレシストキニン−パンクレオフミン
（Ｃｈｏｌｅｃｙａｔｏｋｉｎｉｎ−ｐａｎｃｒｅｏｚ
ｙｍｉｎ　）、インシュリン（工ｎ５ｕｌｉｎ）、プロ
インシュリン（Ｐｒｏ−１ｎｓｕｌｉｎ　）、Ｃ−ｄブ
タイド（Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ　）、グルカゴン（Ｇｌｕ
ａａｇＯｎ　）　、卵−胞刺激ホルモン（１１′ＳＨ）
　、　黄体ホルモン（ｘＪＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン（ＨＣＧ　）　、ソマトスタチン（８ｏｍａ−ｔｏ
ｓｔａｔｉｎ　）、甲状腺刺激ホルモｙ　（Ｔ０ｎ　）
およびこれらのサブユニットならびに関連化合物などで
ある。 薬剤の例ばβ−遮断剤のプロプラノロール（ｔ−Ｐｒｏ
ｐｒａｎｏｌｏｌ　）など、鎮痛剤のＬ型またＦｉＤ型
のシクラゾシン（Ｃｙｃｌａｚｏｃｉｎｅ　）などであ
る。 例えば抗′ｒ抗体または抗血清が常用の免疫法で作成さ
ルる場合、ＤＨＴの構造はＴの構造に酷似しているので
、ＤＨＴは交叉反応性抗原として作用する。１＋ｊＪ様
に、抗ＤＨＴ抗体または抗血清が作成される場合、Ｔは
交叉反応性抗原として作用する。このように［７て、各
種ステロイドは他のステロイドに対する交叉反応性抗原
として作用するのである。 上記の物質は一般的に・・ブテンの類である。 すなわち、これらの物質は抗体と結合することは出来る
が、生体に投与される前に担体と結合って抗体産生を誘
起するためには゛、上記物質を適当な担体上に結合させ
なければならなｈｏたとえば、ある橿の抗原に対して特
異的な抗体（たとえば抗テストステロン抗体、以下抗Ｔ
抗体と称する）を誘起するためには、この抗原を適当な
神体と結合して免疫に用いなければならない。 しかし、こうして得られたＴクローンおよび抗体は類似
構造を有する物質（例、ＤＨＴ　）と強い交叉反応性を
有す石のが普通のことである。本発明によれば、Ｄ　−
ＧＬ共重合体と交叉反応性抗原（この場合にはＤＨＴで
ある）との結合産物で動物を処理することにより、上記
の交叉反応性を有する抗ＤＨＴクローンおよび抗体の生
成を特ＧＬとの共有結合物を用いて動物を処理するとと
厘 鳳 上記はズチドの構造の一部は所望抗Ｖの構造の一部と共
通である）。この−例は、消化管ホルモンの一種である
コレン゛ストキニンーパンクレオチミン（以下ＣＣＫ−
ＰＺと略す）のＣ−末端の８つのアミノ酸からなるオク
タベゾチドの抗体である。尚参考のためにガストリン（
ヒト）、ＣＣＫ　−ＰＺおよび関連化合物の構造式（ア
ミノ酸配列）を示す。 ヒトガストリｙ　：　（Ｐｙｒｏ）Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−。 Ｇｌｕ　−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−擾 （８０，Ｈ） Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨＩＣＣＫ　−Ｐ
Ｚ　　：　Ｌｙａ−ム１ａ−Ｐｒｏ−８ｏｒ−Ｇｌｙ−
ムｒｇ−Ｖａｌ−Ｂｅｒ−Ｍｅｔ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−８６ｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｂａｒ−Ｈｌｓ−ムｒｇ−工１ｅ−８ｅｒ−Ａｌｉ
ｌｐ−ムｒｇ−ム８ｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−量 ８０、Ｈ Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅ　ｔ−Ａ８　ｐ−Ｐｈｅ　−ＮＨ
ＩＣＣＫ−８−Ｐ　　　　：　　Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍａ
ｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ′−Ｍｅｔ−ムｓｐ−０３Ｈ Ｐｈｅ−ＩＪＨ２ ペンタがストリン　：　Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−ムａ
　ｐ−Ｐｈｅ　−ＭＨ２コレシストキニン−バンクレオ
チミン（Ｃｈｏｌｅ−胆嚢収縮を起こす消化管ホルモン
で、お個のアミノ酸からなるポリはデチドである。その
生物活性はｃ−末端の８つのアき）酸部分（ＣＣＫｏｏ
ｔａｐｅｐｔｌｅ　、以下ＣＣＫ−８−Ｐ　　と略す）
に存在することが知られている。また、ＣＣＫ−８，−
ＰのＣ末端５個のアミノ酸配列は胃において酸分泌全刺
激するホルモンであるがストリンのＣ末端５個のアミノ
酸配列と同じである。従つ−て、従来の抗ＣＣＫ−８−
Ｐ抗体はガス）　ＩＪンと高い交叉性を示すことが知ら
れている。 一方、ＣＣＫ−８−Ｐおよびその反応性リセデターは脳
にも存在することが近年見出された。こＯホルモ７　（
７）神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔθｒ
）としての機枠を調べることや胃鴫管の疾患との関係の
あるこのホルモンの分泌と作用を知ることが望まれてい
る。従って、ＣＣＫ−８−Ｐに特異的に反応する抗体の
提供が重要である。 結合物を動物に投与することによって、−ｍ−９１１＆
−＋Ｒンタガストリンおよびまたはガスト０リン様化合
物と交叉反応する抗体を産生ずるクローンｌを不活化し
た後、１紀動物をＣＣＫ−Ｑ　−Ｐ−ＫＬＨで免疫する
ことｆよって、ＣＣＫ−ｇ−Ｐと特異的に反応し得る抗
体を生産し得るクローンおよびこの種の抗体を得ること
ができる。 従って本発明によると、所望の抗原のＣ端側フラグメン
トとしてのインタがストリンとＤ−ＧＬとの共有結合物
を用いて動物を処理した後に、この動物をガストリンで
免疫することＫよ抄、クローン（ＣＣＫ−ＰＺと交叉反
応する一クローン）の産生を抑制すれば、ガストリンに
対して特異性を有する抗体を得ることができる。 下記の実施例から分るように、ｋゾチドの分別（ｒｒａ
ｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　）　Ｉｃよって、全はブチＦか
ら特定の抗原決定基を容易に除去することができない場
合でも、Ｄ−ＧＩｔと交叉反応性はゾチドとの共有結合
物を免疫動物に投与することによ的 って、ン望の特異網抗体を得ることができる。 リゾチームの抗原決定基の組成が”　８ｕｒｆａｏ・Ｉ
ｔＬｍｕｘｌｔｉＯｎ　ｍｏｄｅｌ　”　に基づく合成
ペプチドを使って証明されている〔ムｔａｓｓｌ、　Ｍ
、　Ｌ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ　Ｈ＄巻９
０９−９８６　Ｎ　（１９７８年）〕。 その場合の如く、抗原決定基が不規則な間隔で存在する
アミノ酸によって形成されるような場合、−たとえば抗
原決定基がムＢＯＤ　なるアミノ酸で形成されていると
すると、全く異なったアミノ酸配列を有するペプタイド
でもたまたま立体的に共通の抗原決定基Ｂ−０を形成す
る部分があり九場合、アミノ酸Ｂ−０を含む抗原決定基
をＤ−ＧＬと結合して得られた物質を動物に投毒し、こ
れｋよってアずノ酸Ｂ−０を含む抗原決定基との交叉反
ｉ性をもつクローンを消去すると、この結果、抗原決定
基ム−Ｄに向かった特異的クローンを１選択的に増加さ
せ、特定の部位に向かった抗体のみを産生増巾すること
ができる。 上記抗原とＤ−ＧＬとの結合物は、（１）上記抗原とＤ
　−ＧＬをＷ接結合する方法あるいは（２）抗原とＤ−
ＧＬとを架橋して間接的に結合する方法によって調製さ
れる。架橋物としては、　Ｂｒｌａｎｇｅｒらによるオ
キシム化合物、サクシニル化合物およびクロルカルボン
酔化合物〔例えば、Ｂ、？。 ＋！２１１　　７１！Ｉ Ｅｒｌａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、　！、　ｓ！４→（Ｉ　Ｑ−５７）　）カルボキシ
メチルチオエーテル誘導体（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎムｅｔ
　ａｌ、日ｔｅｒｏｌ＊２０．７８９　（１９７２）　
）、カルボキシメチルエーテル誘導体（Ｐ、Ｎ、　Ｒａ
ｏ　ｅｔ　ａｌ。 Ｊ、５ｔｅｒｏｔａ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９．５３９　
（１９７８）　）などが用いられる。 結合法としてはカルボジイミド法（Ｃａｒｂｏ−法 ｄｉｉｍｉｄｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　）、無水物ｊｌ　（Ｍ
ｉｘｅｄ　Ａｎｈｙ−ｄｒｌｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　）、シ
ョツテンバウマン法（Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎ
ｎ　Ｍｅｔｈｏａ　）、イノΦサゾリウム法などがあげ
られる。 なお、−Ｊｌ　ｆ（、基が上記化合物に導入されれば、
グルタアルデハイド法管用いて結合することができ、又
−ＮＨ２基または−ＥＩＨ基が導入されればｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ・サクシニミドーエス
テル、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル−
シクロヘキサン）−１−カルボキシレート、サクシニミ
ジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等ま
たはＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート、Ｎ−サクシニミジル−（４−アリ「フ
ェニルジチオ）プロピオネート等が用いられる。 その他ズデチＰ化学において常用されるはデチド類の他
物質との結合方法は、全て、Ｄ−ＧＬと、抗原との結合
に利用できる。 また本発明で用いられる免疫抗原は通常はノ・ブテンで
あるので、抗原を通常の免疫方法で常用される適当なキ
ャリアーと結合したＶｔＫ用いられる。 好適なキャリアーとして例えば、スカシガイのヘモシフ
　＝　７　（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈａｅｍ
ｏｃｙａｎｔｎ。 以下ＫＬＨと略す）、種々の異種動物、例えばヒト、ヤ
ギ等の血清ｒ−グロブリンやアルプきンなどが例示され
る。 これらのキャリアーと抗原、そのサブユニットまたは関
連フラグメントとの結合方法は、交叉性抗原そのサブユ
ニットまたは関連フラグメントとＤ　−ＧＬとの結合方
法と同様で直接結合させるか、適当な中間物で架橋して
結合する方法が用いられる。徒者の場合Ｄ−ＧＬと交叉
反応性抗原の結合に用いたと同じ中間物と方法が用いら
れる。 免疫方法は常法による。動物によって抗原（ハプテンと
キャリアとの結合物）の生理食塩水溶液を腹腔内もしく
は足前と背中に、初回は完全フロインドアジュバントと
共に、２回目はＩ不完全フロインドアジュバントと共に
投与する。 その後、マウスでは生理食塩水のみでよい。ウサギのよ
うな大動物では完全フロインドアジュバントと不兜全フ
ロインドアシュパン）！交互に投４することができる。 投与量は抗原とキャリアーの結合比、キャリ′アーの分
子量等によるが、通常は小動物例えばマウスでｌ／μｆ
／〜１００μｔ７１匹、ウサギ等の大動物では０．１■
〜１■／１同／１匹を２〜５回、２−４週間毎にくり返
し投与する。 交叉反応性抗原と、Ｄ−ＧＬとの結合物を通常は第１回
の免疫操作の２−３日前に投与する。 本ちろん抗原の種類によっては、第１回、第２回の費疫
処理后で本抗原とＤ　−ＧＬとの結合物を投与して−も
よい。 ポ交叉性抗原とＤ−ＧＬとの結合物の投与量はマウスの
ような不動物では、１００μ２〜５００　ｔｔｆ、ウサ
ギ等の大動物では２−１０１９が好ましい。この投与量
は交叉反応性を示す抗原（ハプテン）のＤ−ＧＬに対す
る結合量、結合位置や中間に介在する化合物の種類等に
より多少変化する。 実用的には、抗原とＤ−ＧＬとの結合物は生食溶液とし
て腹腔内に投与される。 交叉反応性抗原とＤ−ＧＬとの結合物の結合様式は免疫
用抗原とキャリアとの結合様式と同一であることが好ま
しいので、同一の中間物を交叉反応性抗原とＤ−ＧＬと
の結合および抗原とキャリアとの結合に用いることが好
ましい。 上舵の如く、Ｄ−ＧＬと交叉反応性抗原との結的無応答
性を誘起することができる。その後、る特定の抗原決定
基に対して極めて高い特異性ｌを有する抗体を産生じ得
るクローン、抗体もしくけ核抗体を含有する抗血清を得
ることができる。 前述の知りはマウスのような小動物ばかりでなくウサギ
のような大動物に於いても確認された。動物種が違えば
結果も違うと予想されるにも拘らず、小動物でも大動物
でも同じ結果が得られたことは実用的にとても重要であ
る。何故ならばウサギのような大動物を使用すると、マ
ウ／のような小動物よりも、もつと大量の抗体を得るこ
とができるからである。 ＴとＤＨＴのような、構造類似の化合物を識別し得る抗
体の作成は従来困難であったが、本発明によって、一つ
の抗原を他の交叉反応性抗原から識別し得る抗体を産生
じ得る多数のクローンを選択的に得ることができる。Ｉ
Ｐ！Ｆ異性抗体を産生するクローンの住体内での頻度が
増加する結果、特定のクローンを摘出、単離することが
実際に可能となる。公知文献によると、特定の、抗原を
分別する能力を有するクローンを動物から取り出せる確
率は約百万分の１ないし一千万分の１であり、−従って
との種の摘出および単離は事実上不可能とされていた。 しかＬ７、本発明によって得られる特異的抗体産生能を
有するクローンは、交叉反応性決定基を含有する抗原で
免疫し九場合においてさえも、所望の抗原決定基と構造
上類似の交叉抗原決定基との差を特異的に識別すること
がで龜る。本発明の方法は、との種の特異抗体を高い確
率で生成することを可能にし、従って、この種の特異性
抗体量生能を有するクローンの生成の確率も高めていゐ
。 Ｄ−ＧＬと低交叉反応性抗原との結合法、結合つて１本
発明の方法を、すべての抗体生産法に適用することがで
きる。 次に本発明は、試料中に含有された特定物質の量が不明
である場合Ｋ、この物質を簡単に定量する方法を提供す
る。この方法は後記方法によって得られた抗体または抗
血清を用いることを特徴としてい・る。 下記の実施例において用いられた試薬および分析法は次
の通りである。 （１１ＤＨＴ　−３＋　（〇−カルボキシメチル）オキ
シム（以下ＤＨＴ　−３−ＣＭＯと略す）の合成法。 （イ）　反応式： ％式％ ） ） ） ） イト°ロクロライド　（東京化成工業株式会社）＋１．
３　ｇ　　（２，７ｍｍｏｌｅ　）２Ｎ−ＮａＯＨ１，
２５１１ｄ エタノール　１５ｄ （ハ）操　作 上記原料を還流器付丸底容器に入れ３時間加熱還流後反
応液に精製水４５−を加え、Ｉｃ希ＮａＯＨ液にてｐｌ
’ｉを８にした。この液を分液ロートに移し、酢酸エチ
ル約３０−を加えて振とうし、次いで酢酸エチル層を分
液して除き、未反応ＤＨＴを除去した。次いで水層に氷
を加えて冷却し、希塩酸で酸性（約ｐＨ４）にし冷酢酸
エチルを加え生成したＤＨＴ−３−（ｏ−カルボキシメ
チル）オキシムを抽出し、骸酢酸エチル）−を無水硫酸
ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを蒸発除去し残渣を熱
メタノールから再結晶し、目的物を得る。 （２：　　テストステロン−３−（ｏ−カルボキシメチ
ル）オキシム（以下？　−３−ＣＭＯと略ス）の合成法
。 ３Ｈ−ＤＨＴ　Ｋ代、ｔ　テ３Ｈ−Ｔ、　ＤＨＴＫ　代
ニーｒ−Ｔ　ヲ夫々同モル量用いる他は（１）と同様の
操作を行なって目的物を得た。 （３１ｈａｐｔｅｎ　−Ｄ　−ａＬの合成法（イ）　　
ＤＨＴ　−ａ　−（０−カルボキシメチル）オキシム−
Ｄ−ＧＬ（以下ＤＨＴ　−３−Ｄ−ＧＬと略す）の合成
法（Ｂｒｌａｎｇｅｒ等による混合酸無水物法に準拠す
る） 反応式： （１１使用原料 ＤＨＴ−３−ＣＭＯ，（）レーサーとしての３Ｈラベル
したＤＨＴ　−３−ＣＭＯを含む）２０″ｑ 乾燥ジオキサン　　　　（１ｍ＋５ｄ）ｔｒｉ　−ｎ−
ブチルアミン　　　　　　　２０μｔクロルギ酸インブ
チルエステル　　　　　　　１０　μを精製水　　　　
　　６− Ｄ−（）Ｌ　（ＭＹ　４９，０００　）　　　　３０　
ＷＩ　Ｎ　−ＮａＯＨ１５０μｔ （ｋｌ）　８作 ＤＨＴ−３−０Ｍ０２０ｗ９を無水ジオキサン（ジオキ
サンにモレキュラーシープ５ムを加え脱水したもの）１
−に溶解し、攪拌下にｔｒｉ　−ｎ−プチルアンン加μ
ｔを加え１１゛Ｃに保ちつつ５分間攪拌した。次いでク
ロルギ酸イソブチルエステルｌＯμｔを加え１１°Ｃに
保ちつつ１時間攪拌下に反応する。 別にＤ−ＧＬ３０′Ｈ９を精製水６−に溶解し、ｌ　Ｎ
　ＮａＯＨ１５０μｔを加え混和し、この液にジオキサ
ン５−を徐々に加えた。 このＤ−ＧＬ溶液を攪拌下上配反応液に一度に加えた。 １０分後、ｐＨを調べ、ＩＮ−ＮａＯＨを極く少しずつ
加えてｐａを６．５〜７．０に戻し、約２時間１０°Ｃ
前後で攪拌を続ける。次いでこの反応液を４°Ｃで一夜
水にて透析し、翌朝希塩酸で約Ｔ）Ｈ４，５に調節する
と沈澱が析出した。この液を４°Ｃで７時間放置し沈澱
を完了した。次いでこの液を遠心分離しく　４’Ｃ，３
，００Ｏｒｐｍ。 ９分間）上清は捨て、沈澱物に精製水ｌＯαを加え、ｌ
　Ｎ−ＮａＯＨでｐＨを約７．０に調整して沈澱物を溶
解する。この溶液を４でで精製水で１夜透析し１次いで
凍結乾燥した。 トレーサーとして加えたＨ−ＤＨＴ−３−ＣＭＯ１■当
りの放射活性と反応生成物１ｔｎｇの放射活性よりＤ−
ＧＬＩモル当りに結合したＤＨＴの数を算出した。得ら
れた反応生成物のＤＨＴ対Ｄ−ＧＬのモル比は３０＝１
であった。 Ｋｒｌａｎｇｅｒ等による混合酸無水物法の原籍（、Ｔ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２２８．７１３　（１９５７
）　）より算出したＢＡＡに対する水およびジオキサン
の葉ではＤ−ＧＬを添加した時にグル状になるために、
水およびジオキサンを多量Ｋ　７ＪＯλ、Ｄ−ＧＬが反
応液中でグル状になるのを防ぎ、かつ反応が適当に進む
ようにジオキサンと水の量を決めた。 この工夫により混合酸無水物法でＤ　−ＧＬとオキシム
の結合が可能となり且つ、充分の曽のオキシム、がＤ　
−ＧＬに結合するのを可能にした。 （ロ）　テストステロン−３−（ｏ−カルボキシメチル
）オキシム−Ｄ−ＧＬ（以下Ｔ−３−Ｄ−ＧＬと略す）
の作成 Ｔ−３−オキシム（トレーサーとしての３ＨラベルＴ−
３−オキシムを含む）を用いる他は前記と同様の操作を
行ってＴ−３−Ｄ−ＧＬ　３７４　（Ｔ　：　Ｄ、−Ｇ
Ｌのモル比は３０：１）を得た。 （４）　　ｈａｐｔｅｎ　−ＫＬＨの合成法（イ）　Ｍ
Ｔ　−３−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＫＬＨ
（以下ＤＩ−１’ｌ’　−３−ＫＬ）Ｉと略す）の作成
法 （ａ）　　使用原料 ＤＨＴ−３−ＣＭＯ１２ｑ 無水ジオキサン　　　　　　　　　０．５ｍ＋２．５ｓ
ｇｔｒｉ　−ｎ−ブチルアミン　　　　　　　１０　ｌ
ｉｔクロルギ酸イソブチルエステル　　　　　５μを精
製水　　　　　　４ｄ ＫＬＨ（Ｍｗ　１００，０００　）　　　　１５０　Ｈ
９１Ｎ　ＮａＯＨ７５μｔ （ｂｌ操作 上記原料を用いて前記同様の操作を行 なってＤＩＥＴ　−３−ＫＬＨ５４，７ｙｔａｙ（ＤＨ
Ｔ　：　ＫＬＨのモル比は１０　：　１　）を得た。 （ｏ）　　　　Ｔｅ５ｔｏａｔｅｒｏｎｅ　−３−（ｏ
　−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ　）ｏｘｉｍｅ−ＫＬ
Ｈ（以下Ｔ　−３−ＫＬＨと略す）の作成法 Ｔ−３−ＣＭＯ４０１Ｗ 無水ジオキサン　　　　　　　　　２ｄ＋５ｍＩｔｒ１
−ｎ−！チルアｉン　　　　　　　４０μｔ１ａｏ−ブ
チルクロルギ酸　　　　　　　２０μを檀製氷　　　　
　　１０ｍ１！ ＫＬ）Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　
＃Ｉ　ＮＮａＯＨ３００μｔ を用いて前記と同様の操作を行ってＴ−３−ＫＩＪ）Ｉ
　１９７１ｑ（Ｔ二ＫＬＨのモル比は８：１）を４＃た
。 （５１Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｅｙ　＠作法ｖ：
、４ １）’Ｈ−Ｔ標準液 １．２，３Ｈ−Ｔ　（５８Ｃ１／ｍｍｏｌ　）を工ｐ　
）　−ルで希釈し、２０，０００６ｐｍ／１０１ｔｔ　
（Ｔとしテ４５ｐｆ）含むエタノール溶液を作成する。 ２）　　’）Ｉ−ＤＨＴｍｍ液 ５α−ジヒドロ−１，２，４，５，６，７−’Ｈ−Ｔ（
１１４Ｃ１７／ｍａｔｏｘ　）をエタノールで希釈し、
４ｏ、ｏｏｏｄｐｍ／ｌｏμｚ　（ＤＨＴとしテ４５ｐ
ｆ）含むエタノール溶液を作成した。 ３）　　０．０５Ｍ　）リス緩衝液ｐＨ８，０（０，０
５ｔｌｌｒ　Ｂ１３ム、０．１チＢＧＧを含む） ４）飽和硫階アンモニウム溶液 ５）非放射ラベルのＴＩＩ準液 ６）非放射ラベルのＤＨＴ標準液 操作法１）抗テストステロン抗血清の力価の測定 上記３Ｈ−Ｔ標準液１０μｔをガラスチューブに入れ、
蒸発乾固した。これにトリス緩衝液で段階希釈した抗血
清０．２−を加え混和する。 ２時間室温で放ｔｘｔ後０．２−の飽和硫酸アンモニウ
ム溶液を加え混和した。次いで遠心分離（３０００ｒｐ
ｍ、　ｔｏ仕分間した。上清０．２−をバイアルに移し
、シンチレータ−（ＰＰＯ２，ＯＦをトルエン１ｔに溶
解したもの）２−を加え、放射活性を測定した。 操作法２）抗テストステロン抗血清のＤＩＩＴとの交叉
反応性の測定 上記）１−Ｔ標準液各ｌＯμｔを二基列のガラスチュー
ブに入れ、一つの系には非放射ラベルのＴ標準液を他の
一つの系には非放射ラベルのＤＩ（Ｔ標準液をそれぞれ
加え、非ラベルステロイドをそれぞれ段階的に量を増し
て加え、次いでそれぞれを蒸発乾固した。０．２−の抗
血清（トリス緩衝液で希釈し）をガラスチューｆ中（９
３Ｈ−Ｔ　（４５ｐｆ）　（７）６０％と結合し得る濃
度にして上記ガラスチューブに加え混和する。２時間室
温で放置後、上記操作法１）と同様の操作を行なう。 交叉反応性はアプラハムの方法（ＡｂｒａｈａｍＧ、Ｅ
、　：　：ｒ、ｃｌｘｎ、　１ｎｄＯＣｒ、２９　（１
９６９）　８６８−８７０　）に基き算出する。 操作法３）抗ＤＨＴ抗血清の力価の測定’Ｈ−Ｔ標準液
に代えて、”Ｈ−ＤＨＴ標皐液を用いる他は、前記操作
法１）と同様の操作を行ない測定した。 操作法４）抗ＤＨＴ抗血清のＴとの交叉反応性の測定 ’Ｈ−ＴＶｃ代ｔて、５Ｈ−ＤＨＴヲ用イル他ハ、前記
操作法２）と同様の操作を行ない測定した。 実施例１ マウスにおける低交叉反応性抗テストステロン特異抗体
の作製 Ｃ５７ＢＬ１５系８−１ｏ週雌マウス１群４−５匹を３
群用いた。第１群は対照群でＤＨＴ　−３−Ｄ　−ＧＬ
を投与しないで生理食塩水を投与した。第２＃は５００
μｔのＤＨＴ　−３−Ｄ　−ＧＬを、Ｔ−３−ＫＬＨ［
よる初期免疫３日前に、マウスの腹腔内に投与した。各
群にＴ−３−ＫＬＨ（１００μｔ／匹）の生理食塩水溶
液を完全フロインドアジュバントと共に腹腔内に投与し
た。３週間後同量のＴ−３−ＫＬＨの生理食塩水溶液を
不完全７０インドアリユパントと共に各マウスに投与し
た。５　、７．９　、１７週後には、同量のＴ　−３−
ＫＬＨの生理食塩水溶液を各マウスにそれぞれ投与した
。第３群には、ＤＨ’ｌ’−３−Ｄ−ＧＬ（５００ｔ１
ｆ）をＴ−３−ＫＬＨ４’２：ｊル第２回（初回から３
週間後）、第３回（初回から５週間後）免疫の各３日前
に夫々投４した。２週間毎に採血を行ない抗体価および
交叉反応性を測定した。結果の一部を表ＩＫ示す。交叉
反応性はアブラハム法で測定した。 注）壷１　抗体価は４５１）ｆの３Ｈ−テストステロン
の５０１１と結合可能の血清の希釈倍数の逆数で表示し
である。 会２　交叉反応性（Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ
　）鴎）は次式で示される。 ×１００ 壷３　抗体価の平均値は相乗平均で表示され、交叉反応
性は算術平均上標準偏 差で表示しである。 会４　　ＤＨＴ−３−Ｄ−ＧＬで前処理しなかったが同
物質を初回免疫後に投与した。 表１から明らかな如く、第２群は対照群の第１群に比べ
抗体価はやや低いものの対照群とよく似た様相の抗体産
生を示していることが判かる。−力筒３群では全経過に
わたって有デ

【な枝体産生が認められなかった。 又、ＤＨＴ　−３−Ｄ　−ＧＬで前処理をうけた第２群
では対照群に比べ、ＤＨＴとの交叉反応性が著明に低下
していることが判かる。 又、表１の結果を個々のマウスについてその抗体の抗体
価と抗体の交叉反応性の関係を夫々グロットして調べる
と抗体価と交叉反応性の間に相関々係は關められなかっ
た、一般的にみてＤＨＴ　−３−’Ｄ　−ＧＬで前処理
した場合、ＤＨＴとの交叉反応性は低下し＾４−一、そ
れと抗体価の低下との間に相関関係は認められなかった
。すなわち交叉反応性が低いと抗体価が低いといった関
連性も認められない。これらの事実から明らかなように
、ＤＨＴ−３−Ｄ−ＧＬの事前膜島により、ＭＴと交叉
反応性を示すクローンを除去してやると、その次のＴ−
３−４ＬＨでの免疫によりテストステロンに関してより
高い特異性を有する抗生 体生産能を有するクローンのｒ成が選択的に強化される
。このように低交叉性の抗体を選択的に産生ずることは
本発明の実用上の有利さを示すものである。 実施例２ マウスにおける低交叉反応性杭ジヒドロテストステロン
特異抗体の作製 本実権例２に於いても、Ｃ５７ＢＬ／６系雌マウス１群
５〜７匹８週令を５群用いた。第１群は対照群でＴ−３
−Ｄ−ＧＬで前処理しないで、ＤＴ（Ｔ回 −３−ＫＬＨで初期免疫を行々い、初回から３週後に第
２回免疫、初回から５週後に第３回免疫、次いで２週毎
に追加免疫を行なう。他群のマウスの免疫時期、方法は
コントロール群と同じで回 ある。第２群はＤＨＴ　−３−ＫＬＨでの初期免疫前３
日前 日前に各５００μｍのＴ　−Ｄ−ＧＬを各マウスの腹腔
内Δ に投与した。第３群は別の対照群で、各５００μｔのＤ
ＨＴ−３−Ｄ−ＧＬ　５ＱＱμ２をＤＨＴ　−３−ＫＬ
Ｈでの初回 緒免役曲３′日前に各マウスの腹腔内に投与した。 第４群と第５群の各マウスをＤＨＴ　−３−ＫＬＨによ
って第１回免疫し、その３週間後に第２回免疫し、第２
回免疫の３日前に各５００μｔのＴ−３−Ｄ−ＧＬおよ
びＤＨＴ　−３−Ｄ−ＧＬをそれぞれ腹腔内投与した。 以上５群について初回免疫７週後より２週間毎に採血し
、血清中の抗体価、交叉反応性を調べた。初回免疫後１
３週０の結果を第２表に示す。 表　　　　　２ 注）秦１、※２共に表１の脚注に同じ。 表２の結果は実施例１で示されたのと同様にＴ−３−Ｄ
−ＧＬの前投与により、第２群で示されるごとく低交叉
反応性抗ＤＨＴ抗体の産生が認められた。 初期免疫後にＴ−３−Ｄ−ＧＩＩおよびＤＨ’ｌ’　−
３−Ｄ−ＧＬで処理された第４および５群では抗ＤＨＴ
抗体の有童義な産生はＵめられ々かった。 ＤＨＴ−３−Ｄ−ＧＬで前処理後、ＤＨＴ　−３−ＫＬ
Ｈで免疫された槙３群においてつくられた抗ＤＨＴ抗体
のＴとの交叉反応性は対照群と同様に高かった。また抗
体価は第２．３群と同様であった。 このことよりＴ−３−Ｄ−ＧＬで処置すると、Ｔとの交
叉反応性の低い抗ＤＨＴ抗体が得られることがわかる。 実施例３ ウサギ（家兎）の抗Ｔまたけ抗ＤＨＴ抗体の作製 本実権例に於いては体重的３ｋｌ？の雌家兎１群ドアシ
ュバントで乳化したＤＨＴ−３−ＫＬＨ（各間後にＤＨ
Ｔ−３−ＫＬＨ（各２００μｆ）を不完全フロインドア
ジュバントと共に皮下注射することにより、第２回免疫
を行なった。それ以後１ケ月毎に、完全フロインドアジ
ュバントと不完全フロインドアジュバントとを交代に用
いて、ＤＨＴ−３−ＫＬＨ（各２００μｆ）Ｋよる第３
、第４回免疫を行なった。第２群は対照群で、Ｔ−３−
Ｄ−ＧＬを投与しないで、ＤＨＴ　−３−ＫＬＨで第１
群と同様に免疫した。第３群はＤせ？−３−ＫＬＨＦ）
第２回（３週間后）、第３回（Ｘ週間后）投与による免
疫の夫々３日前に各１０ＷｑのＴ　−３−Ｄ　−ＧＬを
ウサギの腹腔内に投与した。 第４群は各１０１９のＤＨＴ　−３−Ｄ　−ＧＬをＴ−
３−回 ＫＬＨでの初期免疫前３日前にウサギの腹腔内に投与し
た。 第５群は対照群でＤＨ’Ｉ’　−３−Ｄ　−ＧＬを投与
せず、？　−３−ＫＬＨで第４群と同様に免疫を行なっ
た。 第６群は’ｌ’　−３−ＫＬＨによる第２回（初回免疫
の３週間後）、第３回（初回免疫の７週間後）免疫の夫
々３日前に各１０ｗｑのＤＨＴ　−３−Ｄ　−ＧＬを各
ウサギの腹腔内に投与１．た。採血を各免疫後１０日０
に行なった。その結果、第３群および第６群では全経過
にわたって有意な抗体産生は認められなかった。 対照群である第２群からの抗ＤＨＴ抗体および第５群（
コントロール群）から得られた抗テス体のテストステロ
ンに対する交叉反応性は１００チ、又笥５群の抗テスト
ステロン抗体のＤＨＴに対する交叉反応性は９５．２％
であった。しかし第１群および第４群では交叉反応物質
に対して有に 意−◆低い反応性を示した。すなわち第１群の抗ＤＨＴ
抗体のテストステロンに対する交叉は１１．９優、また
第４群の抗テストステロン抗体のＤＨＴに対する交叉は
２２．０１であった。 実施例４ ウサギ抗Ｔ特異抗体および抗ＤＨ？特異抗体を用いたヒ
ト血中ＴおよびＤＨＴの測定 】）上記実施例の第１および第４群のウサギでそれぞれ
低交叉反応性の抗Ｔ特異抗体及び抗ＤＨＴ特異抗体が得
られたので、これらの抗体のヒ）Ｊｆ１１清中のＴ及び
ＤＨＴの検出法への実用性を検討するために、ヒト血清
にそれぞれ既知ｔのテストステロンおよびＤｌ（Ｔを添
加して、上記抗血清を使ったラジオイムノアッセイで測
定されたＴおよびＤＨＴ量と実際に添加した量との関係
をしらべてみた。曲片テストステロンレベルの測定の際
にはより実際の場合に則し、プール血清（血清Ｔ値の低
い女性の血清を用いたう）１−にＴ　１．２，４ｎｆ、
あるいはＤＨＴＱ、ｌ、０．２．０．３ｎ？をそれぞれ
加え、抽出操作過権における回収率を測定するためＫさ
らに”−Ｔ２，９０．Ｏｄｐｍあるいは３Ｈ−ＤＨＴ２
．０００　ａｐｍを加え混和した。各試料ごとにヘキサ
ン：エーテル（３：２）３−を加えＶｏｒｔｅｘミキサ
ーにて１分間振とうした。損とう稜試験管を、ドライア
イス−アセトン浴Ｋｌθ秒間つけ、有機溶媒層を別の試
験管に移した。有機溶媒はエバポレーターでとげし、残
渣にエタノール２−を加え混和し、このエタノール溶液
を各抗血清を用いての阻害曲線の測定可能範囲に相当す
るような量ずつ小試験管に移し、蒸発乾固し、ＤＨＴ　
−Ｄ　−ＧＬ前処理によって得らｔ１＋低交叉反応性抗
Ｔ抗体を用いてラジオイムノアッセイにて測定した。一
方、＃妃のエタノール溶液０．５−をバイヤルに移し、
エタノールを蒸発させ、シンチレータ−を残渣に加えて
カントをはかり、抽出操作過稈における回収率算出に用
い、ラジオイムノアッセイによって得られた値を補正し
た。また血中ＤＨＴレベルを測定する際にはヒト女性プ
ール血清ｌ−にＤＨＴ　Ｏ１２，０，５ｆｉｆまたはＴ
Ｏ１２，０，５ＤＩＰをそれぞれ加え、抽出操作過程に
おける回収率を測定するために３）１−ＤＨＴ　２．Ｑ
ＱＱｄ、ｐ、ｍ。 あるいは５Ｈ−Ｔ　２．０００　ｔｌ、ｐ、ｒｎ、を加
えよく混和した。ヘキサン：エーテル（３：２）３−を
混合物に加え、前述と同様にして抽出を行ない、抽出残
渣に２−のエタノールを加え、このエタノール溶液の一
部を小試験管に移し、その量を各抗血清によるＤＨＴの
阻害曲線の測定可能範囲にはいるように調整し、蒸発乾
固し、テストステロン−Ｄ　−ＧＬ処理によって得られ
た低交叉反応性抗血清を用いてラジオイムノアッセイに
て測定した。一方エタノール溶液０．５−バイヤルに移
し、エタノールを蒸発させ、シンチレータ−を残渣に加
えてカウントをはかり、抽出操作過程における回収率算
出にもちいラジオイムノアッセイによって得られた値を
補正し念。 その結果は、低交叉反応性抗血清体を使って正常女性血
清にＴを１．２．４ｎｆ添加した場合、その添加前の正
常血清のＴ価は０．３０１１１１Ｐであったが、それぞ
れの添加後の対応するＴ価は１．１５　ｎｒ　、２．３
０　ｎｆ、　４．６０　ｎｆであ−１）７）。 なお、同様な実験系［Ｔに代えてＤＨＴを０．１．０．
２および０．３ｎｌを加え、測定されたテストステロン
量へのＤＨＴの影響をみると無添加血清のレベルと殆ん
ど同じであって、有意膚な影箒のないことがわかった。 一方、正常女性血清［ＤＨＴを０．２　オよび０．５ｎ
ｆを加えて血清中のＤＨＴ　ｔを低交叉反応性杭ＤＨ？
抗体を用いて測定した結果は添加前の正常血清ではＤＨ
Ｔ　Ｏ，２１ｎｔが測定されたのに対し、それぞれのＤ
ＨＴを添加後では０．４１および（１，７２ｔｌｌ　の
ＤＨＴが測定され、それぞれの値は添加されｆＦＤＨＴ
とよく一欽し九。なお、同様な実験系Ｋ　ＤＨＴ　（７
）代りＫＴを０．２．０．５１Ｆを加え、測定されてく
るＤＨＴ量へのＴの影響をみると無添加血清のレベルと
殆んど同じであって、有意−な影響のないことがゎかっ
★。　１この結果は実施例３の低交叉反応性抗面清を使
用すると血清中のＴ或いはＤＨ？レベルが正確に測定さ
れることを示す。　　　゛ 低交叉反応性つサギ抗ＤＨＴ抗体を用いてヒト血中のＤ
ＨＴを測定する。 女性プール血清０．１−に表３の如（ＤＨＴとＴの量を
それぞれ（５ｎｆ、　１Ｏｎｆ）、（１０ｏｒ。 ５ｎｒ）、あるいけ（ｔｏｎ９、ｔｏｆｌｙ）ずつ加え
測定は上記１）の例に従った。その結果各量の交叉反応
性抗原である〒が試料に含まれていても測定されるＤＨ
Ｔの量はそれぞれの場合について、５．６７ｎｆ、　１
０．１７ＨＰおよび９，２０　ｎｆであった。このこと
により前記実施例３で得られた低交叉反応性抗ＤＨＴ抗
体は、たとえ交叉反応性抗原であるＴが多量に含憧れて
い・てもＤＨＴを正確に検出することができることがわ
かった。 表　　　　　３ また同様に血清０．１−にテストステロンとＤＨ’ｒを
表４の如くそれぞれ（ｓｎｔ、　１ｏｎｒ　）、（ｘｏ
ｎｆ、ｓ　ｎｔｉ　）　、および（１０ｎｆ、１０ｎｆ
　）ずつ加え、低交叉反応性つサギ抗テストステロン抗
体を用いてテストステロン量を測定した所、夫々の場合
について６．８（’１？、　１０．３ｎｆおよび１０．
５９ｎｐのテストステロンの価であった。 このように低交叉反応性抗テストステロン抗体の場合［
４，交叉反応性抗原であるＤＩ’ｉＴの存在下でテスト
ステロンを正確に測定することができる。 表　　　　４ ３）実際のヒト検体の測定（直接法） 直接法とＦｉＴとＤＨＴを前屯って分離する操作を何も
行なわないで分析する方法を意味する。一方比較の為に
従来法即ちは−パークロマトグラフイーでＴとＤＨＴを
夫々分別した後ｒ　ａｔ中＋１嘴辻ｆｒ　Ｘ　ｆｉｌｌ
　中ａｍ　冬ｙＲす−３，１）血清中のＴの測定 イ）共通の処理 ０．１−の男性血清サンプルまたは０．５−の女性血清
サンプルをそれぞれ試験管にとり、’Ｈ−Ｔ　ヲ３，０
００　＋１．Ｉ）、ｍ、を抽出過程又は抽出、り四マド
グラフ分画過卑における回収率測定のために加えよく混
和した。 さら忙男性血清サンプルにけ純水０．５−を加える。ヘ
キサン：エーテル（３：　２）を３−加ま、ＶＯｒｔ６
！ミキサーで１分間振とうした。試験管をドライアイス
−アセトン浴に：１０秒間浸し、血清部分を凍結させ、
有機溶媒層を別の試験管に移し、有機溶媒をエバポレー
ターでとげした。 口）直接法 男性自消サンプルの各残渣にエタノール０．４−を加え
混和した。このエタノール溶液を艶〜４００　Ｔ）ｆの
範囲に入れるために、正常範囲では１００μｔを、また
第５表の１，２．３号のような高テストステロン血清の
場合には関μｔを各小試験管に移した。抽出操作過程に
おける回収率測定の為に１００μｔをバイヤルに移し、
蒸発乾固後桟１１ｆＫシンチレータ−を加えカウントし
た。 女性血清サンプルには上記ヘキサン−エーテル抽出残渣
にエタノール０．７．−を加オ、溶液０．５−を小試験
管に移した。抽出工種の回収率測定のために１００μｔ
をバイヤルに移し、蒸発乾固後、残渣にシンチレータ−
を加えカウントした。共に小試験管に移したエタノール
溶液のエタノールを窒素ガス気流下蒸発除去し、残渣を
ラジオイムノアッセイに用いた。 ハ）ば−パークロマトグラフイー法 上記の直接法と同様にして得られたヘキサン−エーテル
による抽出残渣にクロロホルムを５Ｘ＋ｔｔｔ加え、ペ
ーパーに塗布した。この操作を合計３回行った。別に同
様のぼ−パーに標準マーカーとしてテストステロンｌＯ
μｔを塗布した。Ｒ−パーをＢｕｓｈＡ（シクロヘキサ
ン；メタノール：水＝１０：１２）の溶媒を含むクロマ
トグラフ・タンクにセットした。２時間後、ＢｕｓｈＡ
の上層を加えて１６時間展開し大。展開後標単マーカー
としてのテストステロンのスポットを２５４ｎｍのＵＪ
吸収で検出した。この標準マーカーのスポットに相当す
る検体用ペーパーの部分の長さを３倒カツトし、エタノ
ール３−で抽出した。エタノールを窒素気流下で蒸発除
去した。そして以下直接法と同様に操作し、ラジオイム
ノアッセイに用い＊。 二）ラジオイムノアッセイ Ｔ標準曲線の作成のためＴ・エタノール溶液（′ｒとし
テ０．２０１５０．１００．２００、または４００　Ｍ
含む）を各２本ずつ試験管にとった。これらの小試験管
とサンプルを含む小試験管に、Ｈ−Ｔ・エタノール溶液
（２０，０００（ｌＩ）ｎｌ／１０μｔ）　１ｏｐｔを
それぞれ加えエタノールを蒸発除去した。家兎抗Ｔ抗血
清をｌ′Ｈ−Ｔ　２０，０００ｃｌｐｍ　（Ｔとして４
５’Ｅ）ｆ）ｔ６０チ結合しうるような濃度（ＢＯ＝ω
９ｇ）にするためＫ、０．０５Ｍ　）リス緩衝液（Ｔ）
）１８．０．０．０５１　ＢｓＡ　（ウシ血清アルブミ
ン）、０．１％　ＢＧＧ　（ウシ血清ｒ−グ四プリン）
を含む〕で希釈し、各小試験管ＫＯ１２−ずつ加え、Ｖ
ＯｒｔｌＸ　ｆｆ１ｉＸ＠ｒで混和した。別に％　’Ｈ
−’１’２０．０００＋１１）１ｍのみを含む小試験管
２本にトリス緩衝液各・０．２−を加え、混和し、Ｂ□
＝ｅ１００嘔用とする。各溶液を２時間室温で放置し、
飽和硫安水溶液０．２−を加え混和した。３，０００　
ｒＴｌｍで１０分間遠心分離し、上清０．２−をバイヤ
ルに移し、シンチレータ−２７！を加えカウントした。 そして測定されたカウントをＢ／Ｂｏ　（＊　）に換算
した。 ３．２）女性血清中の１）１１Ｔの測定血清サンプル量
、抽出及びは−パークロマトグラフによるＤＨＴとＴの
分離操作は女性血清サンプル中のＴの測定に用いられた
ものと同様に行った。ＤＨ’ｒの検出は１チｍ−ジニト
ロベンゼン・エタノール溶液と２．５Ｎ水酸化ナトリウ
ム・エタノール溶液の等量混倉溶液の噴霧によっておこ
なつ九。 ＤＨＴのラジオイムノアッセイはＤＩＩＴ・エタノール
標準液と”Ｈ−ＤＩＩＴ・エタノール溶液（４０ｅＯ０
０ｄｐｍ／１０４ｔ）を用いてテノラジオイムノアツセ
イ法と同様に行つ九。 直接法および常法によるイーパークロマトグラフィー共
に、ラジオイムノアッセイによって得られた値を回収率
によって補正した。 直接法の場合にはＴ又はＩ）ＩＴの回収率は５〜１００
優の範囲内ＫＩｈ抄、測宇値にバラツキがなかったので
、３Ｈ−Ｔ又は３Ｈ−ＤＨ？添加による回収率補正は通
常の場合不要と考えられる。 結果を第５表、第６１！に示す。 結果と解析 表　　　　５ 上表から明らか表如く、両測定法の測定値はそれぞれ明
瞭な一致を示している。 表　　　　６ （女性血清） 上表から明らかな如く、両測定法の測定値はよい二数を
示している。 以上の実験事実から明らかな如く、本発明により提供さ
れる低交叉反応性抗体を用いる直接法により、交叉反応
性抗原の存在下でも簡便正確に目的物質を測定すること
ができる。 従来法のは−パークロマトグラフイーのように、交叉反
応性抗原をあらかじめ分別する必要も危く簡単に目的物
を測定することができる。本発明により、交叉反応性抗
原とＤ−ＧＬとの結合物で動物を前処理すると、これに
よって、交叉反応性抗原に対する免疫無応答性を誘起し
、その結果、特異性抗体およ〜び上記抗体生渚能を有す
るクローンとを得ることができる。この方法は、？−３
−Ｄ−ＧＬ　＋ＤＨ？　−３−Ｄ　−ＧＬ　を用いた前
述の例に限定されるものでは）〈て、次の実施例５に示
きれるように、他の例にも応用することができる。す表
わち実権例５では、ＴおよびＤＨＴとの担体の結合部位
を変えているが、この場合［４、実質的に同様な結果が
得られる。この例では、！およびＤＨＴをふたたびモデ
ル抗原として使用し、それらと担体との結合部位を３位
から１５位に変身、これＫよって、担体分子の表面に露
出するハプテンの構造を変えている。 実施例５ １５β−カルボキシエチルメルカプトテストステロン（
以下１５β−Ｃ１１ｉＭ　−Ｔと略す）及び１５β−カ
ルボキシエチルメルカプト−５α−ジヒド四テストステ
四ン（以下１５β−ＣＥＭ　−５α−ＤＩ（’ｒと略す
）とＫＬｉ［ｉたはＤ−ＧＩ、との結合物を用いて得ら
れる抗血清の性質について １５β−ＣＥＭ　−ＴはＲａｏ　％Ｐ、Ｎ　ａｎｌ　Ｐ
、Ｈ，Ｍｏｏｒｓ　Ｊｒニステロイド堡（１９７６）　
Ｐ　１０１．１５β−Ｃ１！！Ｎ　−５α−ＤＨＴはＲ
ａｏ、Ｐ、Ｎ、　、　Ａ、Ｈ，Ｋｈａｎ　ａｔｏｌ　Ｐ
、Ｈ，Ｍｏｏｒｓ、Ｊｒ　：ステロイ）”　２９　（１
９７７）Ｉ’、１７に夫々記載の方法によって合成した
亀のを使用した。１５β−ＣＩＣＭ　−ＴとＤ−ＧＬ又
はＫＬ）Ｉとの結合方法および１５β−ＣｌｆｉＭ　−
５α−ＤＨＴとＤ−ＧＬ又はＫＬＨとの結合はそれぞれ
前記ＤＨＴ　−３−ＣＭＯまたは？　−３−ＣＭＯとＤ
−Ｇ１又はＫＬＨとの結合と同様の方法で行つ九、夫々
得られた結合物をＴ　−１５−Ｄ−ＧＬ、！−１５−Ｋ
ＬＨ，ＤＨＴ　−１５−Ｄ　−ＧＬ、　ＭＴ　−１５−
４ＬＨと略する。 本実施例に於いては、Ｃ５７ＢＩＩ／６系ｉ１−マウス
（８−１０週）１群７匹を６群用いた。 第２群はＤＨＴ　−１５−Ｄ−ＧＬを５００μ？／１匹
初聾免疫３日前ｌ（ｖウスの腹腔内に投与した。 第１群は対照群でＤＨＴ　−１５−Ｄ−ＧＬを含まない
生理食塩水を同様に投与する。 日前に腹腔内に投与した。 第２回免疫、第２回以後２週間毎に追加免疫を行なった
。第４．５．６群はＤＨＴ　−３５−ＫＬＨで免疫され
、た。 内に投与した。第５群と同様に、＠４群（対照群）のマ
ウスにＴ−１５−Ｄ−ＧＬに代えて生理食塩水を投与し
た。 後より、２週間毎に採血し、血清中の抗体価と交叉反応
性とを調べた。抗体価の最も高い初層免疫から第１３週
後に得られた抗血清での結果は８Ｈ−！４５　ｍ）ｆを
５０１結合し得る抗血清の希釈倍数の逆数で表わすと対
照群（第１群）の抗体価は１．６００〜９．００００間
にあり、また第２群の抗体価は１，０００〜３，５００
０間にある０丁−１５−Ｄ−ＧＬを投与し光第３群では
抗体産生は認められなかった。 一方、ムｂｒａｈａｍの方法（前述）Ｋよって求めた場
合第１群のマウスの抗血清の、ＤＨＴ［対する交叉反応
性は４．１〜８．２−の範囲にあり、ＤＨＴ　−１５−
Ｄ−ＧＬで処理した第２群マウス抗血清の交叉反応性は
０．２７〜０．９４１の範Ｈにあった。 この数字は今市文献に報告された抗テストステロン抗血
清のＤＨＴとの交叉反応性の価よりも良好である。従っ
て、本発明による抗血清のＤＨＴとの交叉反応性値実際
に無視することができようＯ 従来報告された抗Ｔ抗血清のＤＨＴとの交叉反応性の最
低値は１８１１Ｇである。この数値を得る九め［Ｒａｏ
等は１５β−Ｃ１１ｆＭ−チーＢ８Ａを用イタ（Ｐ、Ｎ
、Ｒａｏ　ａｎｄ　Ｐ、ＨｏＭｏｏｒｅ　：ｆｒ、ｘテ
四イド２Ｂ（１９７６）本実織例でも同じく１５β−〇
ＩｌｆＭ　−Ｔμを用いている。本実施例の第１群から
得られた交叉゛反応性は、上記の最低値におよそ等しい
のである。 第４．５．６群から得られた抗ＤＨ’ｌ’抗血清の結果
は以下の通シであった。 ’ｕ−ｐｕｔ−４−！−ｆＰｐｒｔ５０１結合ＬＩＩル
抗血清Ｏ希べ釈倍数の逆数で表わすと、第４群（対照群
）の抗ＤＨ？抗体価は１，５００〜５．６００の範ＷＡ
Ｋある。 Ｔ−３５−Ｄ−ＧＬを投４Ｌ＊＠５群の対応する抗体価
は１，０００〜７．６００の範囲に入る。 ＤＨＴ　−３５−Ｄ−ＧＬを投与し九第６群では抗体産
生は認められなかった。 ？−１５−Ｄ−ＧＬで処理した第５群のテストステロン
との交叉反応性はアプラハム法によると、６．５〜１９
．０チの範囲にあったが、対照群（第４群゛）の交叉反
応性は４８．３〜６８．５−の範囲Ｋｂつた。 この結果は、’ｊ　−１５−Ｄ−ＧＬ処理（投与）Ｋよ
って有意にテストステロンとの交叉反応性が抑えられて
いることを示している。 またＤＨＴ　−Ｄ　−ＧＬを投与し九票６群に抗体産生
が認められない理由は、ＤＨ？抗体童生能を有するり四
−ンが、Ｉ）ＩＴ−Ｄ−ＧＬの投与により特異的に不藩
性化されたためであると考えられる。 下記の実施例６−９（’−？デタイドの例）において用
いた試薬および分析法社次の通りである。 （１１ハプテン−Ｄ　−ＧＬの合成 ペンタガストリン−Ｄ−ＧＬ結金物の作成Ｌｉｕらの方
法（バイオケ定ストリー（Ｂｉｏ−ａｈｓｍｉｓｔｒｙ
　）、第１８巻、ｐ６９０　（１９７９）　）に準拠し
て合成した。 （ａｃ＠ｔｙｌ　ｍ＠ｒｏａｐｔｏ　−ａｕａｃｉｎｙ
’ｌ　）　−Ｄ　−ＧＬ（以下ムａ−８−Ｄ−ＧＬ　　
と略す）の合成り−ＧＬ（分子量４．９万）　４０ｑ　
（１，１６６μｍｏ１）を９００μｔの０．１２５　Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶解し、ｌ　Ｎ　ＮａＯ
ＨテｐＨヲ７．２に調整する。この溶液に８−アセチル
ーカテトコハク酸無水物のりメチルホルムアオド（以下
ＤＭＦと略す）溶液（酸無水物２００■を１−のＤＭＩ
Ｆ　Ｋ溶解する）５０μｔ（５７゜４μｍｏｌ）を加え
て（資）分間室温で攪拌する。反物と未反応の試薬とに
分離した。４４もこの反応生成物を含む溶液・１００μ
ｔａｌｃ　Ｏ，５ＭＮ−４Ｙａｄｔシアｔ　ｙ　（ｐＨ
７，３）水溶液１００μｊ（５０μｍｏｌ　　）を加え
、３７°ＣでＩ分間イレキューペートした。エルマン（
ＩＩ！ｌ１ｍａｎ　）らの方法〔アーカイック　バイオ
ヶｔ−−バイオフイジイーク（ムｒＯｈ、Ｂ１００Ｍｍ
、Ｂ１０ｐｈ７ｅ。 第羽巻ｐ７０　（１９５９）　）　ＫよりＤ−ＧＩＩＫ
導入出した。即ち１．この反応溶液（資）μｔＫ脱酸素
した０、ＯＩＭの（５，５’−リチオビス（２−二トｐ
安息香酸）のメタノール溶液）　０．１　ｍを加え、ｐ
Ｈ８，０のトリス緩衝液Ｊ’ｓ＋／中でｍ分間反応させ
、次いで４１２ｎｍの吸光度を測定する。 Ｄ−ＧＬＩ分子当りに導入されたＳ−アセト−サクシニ
ル−Ｄ　−ＧＬをＡｃ−Ｂ工、−Ｉ）−Ｇｌ。 と表示する）尚回収率は約７７嗟である。Ｄ−ＧＬが２
８０ｎｍでの吸収をもたないため、Ｄ−ＧＬ誘導体を含
む画分の回収率は吸光度測定により求められない。 従ってＮ−サクシイきりルー３−（４−ヒドロキシフェ
ニル）ゾロビオ＄−）トＤ−ＧＬを反応させ、この反応
産物をモニターとしてセファデックスＧ−２５−カラム
に流し一蕎各番番龜吸光度（２８０ｎｍ）を測定するこ
とにより回収率を求めた。 （ロ）　ｍ−マレイイドベンゾイルーはンタガストリン
（以下、ＵＢ−−Ｓンタガストリンと略す）の作成 声 Ｒンタがストリン１１　Ｗ　（１６，ｘ／ｍｏｘ　）　
ｔＯ０ＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）＠９．５ｓｆＫ
溶解し、これにｍ−マレイｔｐベンゾイルー麗−とｐａ
キシサクシンイｔｒエステル（以下、Ｍｎ２と略す）　
２５．３１１Ｆ（８０，５＃ｍＯ１、ｌ−のＤＭＰに溶
か１−九本の）を−変に加え攪拌をする。薄層クロマト
グラフ〔展開溶媒シクロヘキサン：酢噛エチル（１：Ｊ
’）、容量比〕によ抄反応が充分進んでいることを確認
の上、反応開始から５分後に反応液にジクロルメタ／３
−を加え、充分振とうした後、遠心分離する。 上層の緩衝溶液を別の試験管に移す。下層のジクロルメ
タン層に少量のリン酸緩衝液を加え振とうし、遠心分離
後、上層を先の溶液に加える。 ＭＢｉｌ　−−Ｚンタガストリノを含む緩衝液部からほ
ぼ完全に未反応のＭｎ２が除かれたζトラ薄層クロマト
グラフによ抄確認した。 一方、・窒素気流によ抄脱酸素された２−メルカプトエ
タノール水溶液加μｔ（７０ｔｋｍＯ１）ニ、上記のＭ
Ｂ日−Ｒンタがストリンを含む緩衝液加μｔを加え、室
温でｍ分間反応させた後、エルマン法により消費された
２−メルカプトエタノールのモル数を求め★。このモル
数がインタガストリンに導入されたマレイミドペンジイ
ル基に相当する。はフタガストリフ１分子当りに導入さ
れたマレイミドペンジイル基（Ｍ、Ｂ　）は０．９であ
った。（以下この化合物を日。、９ｇインタガストリン
表示する。） （ハ）インタガストリン−Ｄ　−ＧＩ、結合物の作成前
記（イ）項で調製したムａ−８１ｓ−Ｄ−ＧＬ浴溶液（
ロ）項で調製し九ＭＢ０．。−インタガストリン溶液を
混合し、次の通シ反応させた。窒素気流下で充分脱酸素
後、５Ｍヒドロキシルア建ノン水溶液　１）Ｈ７，３）
　５００μｔを混合物に加え、室温で攪拌をつづけた。 １時間後、反応液の一部分をとり、エルマン法によ抄チ
ェックしたところ、−未反応８Ｈ基は存在しなかった。 このことは、ＭＢ−−！！ンタがストリンと反応しなか
っ九８Ｈ基が存在していないこと、すなわちＤ−ＧＬ上
のすべての８Ｈ基は１ＭＢ−はンタがストリンと反応し
たことを青味する。 ヒドロキシルアミン水溶液を加えてから２時間後に２メ
ルカプトエタノール（最終濃度１　ｍＭ　）を加え、さ
らに領分攪拌した。 この反応液を透析膜（セロファン膜）を用いて０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　Ｋて約冴時間透析した
。（透析後得られた溶液を直擬屯しくは希釈して使用し
た。） この様圧して作成されたはンタがストリン−Ｄ　−ＧＬ
結金物のＤ−ＧＬＫ対するペンタガストリ／のモル比は
１５：１であった。 （以下インタガストリン０．−Ｄ−ＧＬと表示する。） （２１Ｃ（４−８−Ｐ　−＝？−ホールリンインド　ヘ
モシアニン（ＣＣＫ　−Ｂ　−ｐ　−ＫＴＪＨと以下略
称する）の作成 区ＬＨ（以下ムｃ−Ｂ　−ＫＬＨと略称する）の作成は
、前記（１）（イ）項記載のムａ−Ｂ−Ｄ−ＧＬ　の作
成と同様に行なった。 合成に先立って、ＫＬＨ７０”ＩＰを１．４−の１ｑＡ
　Ｋ、ＣｏＳ溶液に溶解し、０．１２５　Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，２）で透析した。この溶液の２８０ｎｍで
の吸光度を測定することにより、ＫＬＨの量を算出した
。 とのＫＬＨ溶液０．７　ｄ　（ＫＩ、Ｉ！として２６．
０６０ 岬１分子量を約１０万とすると、−ｎ　１ｎＯ１ハイド
ライド６．５μｍｏｌ　　を加え、（り（イ）項と同様
の操作で合成した。ＫＬＨ１分子に対しＦｉ６．８であ
った。（以下アセチル−８ａ、５−ＫＬＨ−と表示する
。） （ｏｌ　　ｍ　−マレイｉドベ７ゾイル−ＣＣＫ　−ｆ
３−Ｐ（以下ＭＢ−ＣＣＫ−８−Ｐと略称する・）Ｍ１
３−ハンタガストリンの作成と同様の方法で作成した。 フラグメント縮恰法によ妙合成した０、４２ｗｑ（３８
５ｎ　ｍｏｌ　）のＣＣＫ　−ｆ３−　Ｐを０．２Ｍリ
ン酸緩衝液０．５−に溶解し、６００　＃ｆ　（１，９
μｍｏｂ　）のＭＢ８と反応させた。反応には１．２ｑ
のＭＢ８を１００μｔのＤＭＩＦに溶解したＭＢＥＩ溶
液関μｔを用いた。 得られた生成物のＣＣＫ−８−１）：ＭＢの比は１　：
　１．０であった。（以下ＭＢ、、。−ＣＣＫ　−Ｂ−
Ｐと表示する。） （ハ）　ＣＣＫ　−ｇ　−Ｐ　−ＬＬＨ上記（２）（イ
）項で得られたアセチル−８６，ａ−ＫＩＪＨ溶液２．
３　ｗｔ　（７５，９ａｍｏｌ　）と上記（２１呻）項
で得られたＭＢｌ、。−ＣＣＫ−ｇ−Ｐ溶液を混合し、
０．ｓＭＮＨ，ｏＨＯ，３ＣＣ（０，１５ｍｍｏｌ　）
を加え、１１）（ハ）項同様の操作を〈シ返した。 得られたＣＣＫ　−８−ＰとＫＬ１’ｌ　ノ比は約５＝
１であった。 （３）　　ＣＣＫ　−８−Ｐ−牛血清アルブｆ　ｙ　（
Ｂｏｖｉｎｓ−・ｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　）　（以下
ＣＣＫ−９−Ｐ−Ｂ８ムと略称する） の作成 り８Ａ　２５ｗ５ｙ　（３５１ｎｍｏｌ）と８−アセチ
ルエル 〆カプトサクシニツクアンノ・イドライＰ１．５Ｍｌ　
（ｓ、ｇ＃ｍｏ１）を用いて（１）（イ）項と同様の操
７．６　：　１であった。 （ｏ）　　ＭＢ　−ＣＣＫ　−８−Ｐの作成ｃｃＫ−８
−Ｐ　Ｏ，５＊　（４５７ｎｍｏｘ　）を０．５−の０
．１　Ｍ　９ン酸緩衝液ｐＨ８，ＯＫ溶解しこれを７０
０μｆのＭＢ８２．２９μｍｏｌと反応サセタ。 反応ＫｄＭＢ日１．４ｑを１００μｔのＤＭＩＦ　Ｋ溶
かし大溶液関μｔを用い、（１）１０）項と同様の操作
で合成した。 ＭＢ：ＣＣＫ−８−Ｐの比け１．０　：　１であった。 （以下ＭＢ、ｏ−ＣＣＫ　−８−Ｐと表示する。）（ハ
）　ＣＣＫ　−３−Ｐ　−ＢＢムの作成前記（３）（イ
）項の液１．９　ｙｄ　（３４ｎ　ｍｏｂ　）と（３）
（ロ）項で得られた液を混合し、Ｑ、５　Ｍ　ＮＨｌＯ
ＨＯ，３５ＣＣ（１７５ａ　ｍｏｌ　）　ｔ　７Ｊ１　
ｆｉ−１ｍＨ］ｌＮ　と同ｍｆ）８作を行々つた。 得られたＣＣＫ−ｇ　−Ｐ　：　Ｂ８ムの比は約５＝１
であった。以下ＣＣＫ−ｇ−Ｐ、−ＢＳＡと表示する。 （４）ｋンタがストリン−Ｂｅムの作成（イ）　　ｕＢ
−ハンタガストリンの作成はンタがストリン０．５１１
ｖ（７５０ｎｍｏｌ）を０．５−の０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶解し、これを−φ礪のＭＢ８１．
０５■（３，３μｍｏｌ　）と反応させた０反応にはＭ
Ｂ８２，１　ｗｑを１００μｔのＤＭＩＦ　Ｋ溶かした
溶液間μｔを用い、前記（２）（ロ）項同様の操作を行
なった。 １（３３ニー＜ンタガストリンの比は１．０　：　１で
あつ九。 以下ＭＢ、、ｏ−／−？ンタガストリンと表示する。 １口）／−？ンタガストリンーＢｅムの作成（３）（イ
）項同様にして得られた溶液２．５４ｍ（１１２ｎｍｏ
１）と（４）（イ）の液を混合し、０．５ＭＮ％ＯＨ（
Ｄ　Ｏ，４Ｃｃ（２００ｐ　！ＥＩＯＩ　）を加え、（
１）（ハ）項と同様の操作を行なった。 得られたはンタガストリンーＢ８ムのＲンタがストリン
：Ｂｓムの比は約５：１であった。以下はンタガストリ
ン、−ＢＡＡと表示する。 （５）前記（１１項において、分子量３４，３００のＤ
−ＧＬＫ代えて分子量１１．５万のＤ−ＧＬを用いて、
（１）項同様の÷子反応量にて操作を行なって、はンタ
ガストリン♂、−Ｄ−ＧＬを得た。このものの分子表面
上での！−ＧＩＪに結合された抗原決定基（ベンタガス
ト１１ン）の密度は同様であった。 実施例６ （イ）免疫スケジュールと崩清採取 各ダルーゾロ匹ずつの（Ｃ５７ＢＩＪ／６ＪＸＤＢＡ／
２）？、マウスを免疫した。 全群の各マウスを各１０μｆのＣＣＫ−ｇ−Ｐ−ＫＬＨ
（各０．２−の完全フロインドアジュバントエマルジョ
ン）で免疫し、３週間後、各１０μＶのＣＣＫ−９−Ｐ
　−ＩＣＬＨ（各０．２−の不完全アリュパントエマル
ジョン）でさらに免疫した。 第２回免疫の２週間後、各ｌＯμｔのＣＣＫ　−Ｑ−Ｐ
　−ＫＬＨを水酸化アル電ニュウムグル（アルミニニウ
ム２■）Ｋ吸着させたもので、追加免疫した。 追加免疫の２週間後および４週間後、各１ＯＪｌｆｔ）
　ＣＣＫ−Ｊ　−Ｐ　−Ｉｌｌを含む０．２−生理食塩
水でさらに免疫した。 免疫は全て腹腔内投与でおこなった。第２群の全マウス
に、初回免疫の３日前に各マウス当り３００μｔのはン
タガストリン□、−Ｄ−ＣｋＸｓを含ｔｒ　Ｏ，５ＣＣ
の生理食塩水を腹腔内投与した。 第１群（′：１ントロール）の各マウスに生理的食塩水
０．５　ｍｇ　（ばンタガストリン、、−Ｄ−ＧＬを含
まず）のみを投与した。 第３群のマウスは、２回目・の免疫の３日前と、３回目
の免疫の３日前に、各３００μｔのぼンタガストリン、
、−Ｄ−ＧＬを含む０．５０ｃの生理食塩水溶液を腹腔
内投与した。 各免疫個体からの血清の採取は後眼窩静脈叢より行なっ
た。 （ロ）抗体力価の測定 抗体力価の測定は、ラジオイムノアッセイ法により行な
った・ 固相ラジオイムノアッセイ用ポリビニール丸底マイクロ
プレートの各ウェルに抗原（ＣＣＩＣ−ｆ３−Ｐ−Ｂ８
ＡまたはＲンタガストリンーＢｅム）ｌＯμｆ／−を含
有する０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２で０．１５
ＭのＮａＣＡを含む）を、１００μｔずつ加え、室温で
２時間インキエベートすることＫよシ、該抗原をポリビ
ニール板の表面に結合させる。この後、各ウェルの溶液
を捨て、ウェルを水道水で４回充分洗い落とす。その後
、水分を充分切って、ｌ　％　ＢＳＡを含む生理食塩水
２００μｔを各ウェルに加え４°Ｃで一夜放置すること
によって、ポリビニールの蛋白結合能をＢＳＡで完成に
マスクした。 その後、各ウェルの溶液を捨てウェルを水道水で４回充
分洗い流し、水分を充分切って、次いでイムノアッセイ
に用いた。 各抗血清をｌ　４　Ｂ１１−　ＰＢ８で希釈して、その
０．１−を上記のプレートのウェルに加える。 ４°Ｃで一夜放置後、水道水で３回充分洗い流し、２　
Ｍ　ＮａＣｔ−ＰＢ８で６回洗浄し、最後に水道水で洗
い、充分水を切る。１“工でラベルした免疫吸着剤を用
いて特異精製したウサギ抗マウスエルＧ抗体θ自か會希
を１４　ＢＨム−ＰＢ８で希釈後０．１−を各ウェルに
加え、−夜装置した。この操作により、ポリビニール上
の抗原と反応する抗体があればこれと結合し、この抗体
は１″８ニ一ウサギ抗マウスエｆＧ抗体の結合度によっ
て知ることができる。各ウェルのアイントーデ溶液をピ
はストで取り除き、水で各ウェルを充分洗った後、各ウ
ェルを熱ニクロム線にて切り離し、各ウェルの放射活性
を測定した。 （ハ）結果 各採面時の各グループごとにゾール血清の抗体量を測定
し、抗体量のもつとも高かった第１回免疫後１１週目の
抗体について、さらに測定した。 得られた結果は第１図の如くである。標準血清として用
いたのはグループ１の第１回免疫後７週目のゾール抗血
清であった。第１１週後に各マウスから得られたメンゾ
ル中の抗体量を、標準抗血清に含まれた抗体量を１とし
て、比率で現わし・た。 標準として用いられたゾール抗血清は、次の様な力価を
もつものであった。 下記のｃｃｘ　−８を用いた液相ラジオイムノ△ アッセイ系において６００倍希釈のこのプール抗血清は
コレシストキニン（ＣＣＫ−３３）の０．００１５１１
ｍｏｌを結合することができた。 はンタガストリン、。−Ｄ−ＧＬを投与しなかを投与し
たマウスより得た抗体（第２および第３群。図１では、
それぞれム印および・印で表わす）のばンタガストリノ
と交叉反応する抗体の力価が非常に低いことが判った。 ％にば／夕がストリン０．−Ｄ−（）Ｌを初回免疫後（
２回目の免疫３日前と３回目の免疫の３８前）Ｋ投与し
たグループ３のマウスから以上の結果から１本発明によ
ｌ）、ＣＣＫ−８−アに４１１異的なｉｔノ酸配列に対
して即ち、れたことが分った。 実施例７ ＣＣＫ　−８とはンタガストリンとが共存する液相イム
ノアッセイ系を用いて、上記方法で得られた抗体の交叉
反応性を次の過砂測室した。 ＢＯｌｔＯｎ　−Ｈ１ｌｎｔ＠ｒ試薬を用いて１１１１
１でＣＣＫ　−８−Ｆをラベルした（　（ＩＩ、　ａａ
ｎｋａｒａら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈ＠ｗ、　、第２５４巻、９３４９〜９３５１頁、１
９７９年）。 以下このラベルした化合物を１１８１−　ＢＨ−ＣＣＫ
　−８と略す。〕。各小試験管Ｋ　Ｏ，０２Ｍ　リン酸
緩衝液（ｐＨ８，０，０，１慢ｒ？チンを含む）各５０
ｕｔｆ溶では、各試験管に種々の量のはンタガスト１）
ン加、ｔ、さらＫｘｓｓｌ　−ＢＨ−ＣＣＩＣ−８（約
５００００１）！１ｋ　）を含有すゐ同じリン酸緩衝液
（資）μｔを加え、試験管をポルテックス・々キサーで
損とり温和し、次に４１ｉｋ”ＣＫ２４時間保つ、た後
、同じリン酸緩衝液で希釈（１：２）したウサギの抗マ
ウスＩｇＧ　Ｆａｂ抗体５０μｔを試験管に加え、混和
し、４°ＣＫ２４時間保った。 その後ｓｏｏｏｒｐｍで試験液を５分間遠心分離した。 上清をアスピレータ−で吸い取抄、沈澹物に同じりん酸
緩衝液を用いて全１１１１ニーＢＨ−ＣＣＫ結合率（Ｂ
／Ｂｏチ）を算出した。 １ｖｒａｚ−ＢＨ−ＣＣＫ−８ト抗体とノ結合を５ｏ嘔
阻害するのに必要な種々のイブタイドのモル量唸次の通
りであった。 グループ１では、ＣＣＫ　−８は１．ｌｐｍｏｌで４７
りガストリンは２０．１　ｐｍｏｘであっ九。従ってム
ｂｒａｈａｍの方法で算出した交叉反応性は５．５−（
１，１／２０．Ｉ　Ｘ　１００　）であった。 インタガストリン、、−Ｄ−ＧＬを初免疫前に投すなわ
ち上記抗体を用いた場合５０１阻正に必要なＣＣＫ　−
９％、、ｉｊ　ｌ　、７　ｐｍｏｂであったが、　１０
．ＯＯＯＰｍｏｌのインタガストリンを用いても阻止は
認められなかった。インタガストリンはグループ３のマ
ウスで音生された抗体と実際に反応することができなか
った。 上記の結果よ抄、ハンタガストリンｉｌｌ　−”−ＧＬ
の投与によって得られたグループ３のマウスの抗体を使
う場合、共存するはンタガストリンの有童鍍な影譬を受
けないで、サンプル中のＣＣＫ−７３−Ｐを特異的に測
定することが出来ることがわかった。 実施例８ ５ｊ！讃例６Ｋかいて用いたマウスに代えて家兎を用い
て同様の免疫操作を行なった。但し。 １００、＃ｌＪＦの０ＯＫ−ｆＪ　−Ｐ　−ＫＴ、ｒＭ
１ｆ含む完全オ九は不完全フロインドアジュパントエｉ
ルジ曹ンと１０＃のペンタガストリン、、−Ｄ−ＧＬ　
　を含む生肩食塩水１０ｓ＋ｊを用い友。得られ九結果
はマウス使用の場合とおよそ同様であった。 実施例９ 実施例６において用い九ペンタガストリン、。 −Ｄ−ＧＬｉ（代えて、分子量ｘｉｓ、ｏｏｏのペンタ
ガストリン、、−１）−（）Ｌを用いる他は、同様の操
作を行なって、実施例６とおよそ同様の結果が得られた
。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明による抗体が低交叉性であることを示す図
で、横軸はペンタガストリンと反応する抗体量を慶わし
、縦軸は００Ｋ　−５１−Ｐと反応する抗体量を褒わす
。 ０印は、ペンタガストリン、、−Ｄ−ＧＬを投与しなか
つえマウス（第１群）より得九抗体を表わす。 ム印は、初回免疫前にペンタガストリン１．、−Ｄ−Ｇ
Ｌを投与したマウス（第１１より得九抗体を表わす。 ・印は、初回免疫後にペンタガス）ｌＪｙ、、−］）−
Ｇｌ−を投与したマウス（第３群）よ勤得九抗体を表わ
す。 それぞれの単位はグループ１のマウスの初回免疫後１週
後のプール血清中Ｋｔｌれるそれぞれの抗体量を便宜的
Ｋ１．＠とした時の抗体含量の比率を嵌わす。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　第１技原に対し高い特異性を有し、壕九上記
   第１抗原と構造的Ｋ１１ｌ似し九一つ以上の抗原決定基
   を有する第１抗原に対して低い交叉性を有する目的とす
   る抗体を作成する方法において、Ｄ−グルタギン酸とり
   一リジンとの共重会体と上記第コ抗原との共有結合物を
   哺乳動物に投与し、これによって上記第２抗原に対する
   効果的な免疫無応答性を上記動物に誘起し先後に上記動
   物を上記第１抗原で免疫することを特徴とす為改良され
   た抗体の作成方法。
2. （２）　　抗体が上記抗体を會有する抗血清の形である
   特許請求範Ｈｉ記噴の方法。
3. （３）　　杭体が上記抗体量生能を有するり四−ノから
   得られ九杭体であＪ１４１１許請求１１１１／記載の方
   法。
4. （４）哺乳動物がマウス、ラット１に九社モルモットで
   ある特許請求範８１１コ、Ｊのどれかに記載され先方法
   。
5. （５）　　哺乳動物がウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブ
   タま九はウシである特許請求範Ｕｓ　ｔ　ｓ　コ、Ｊの
   どれかに記載され先方法。
6. （６）用いられるシグルタ建ン酸とＤ−リジンとの共重
   会体の分子量が約Ｊｔ、ｏｏｏから約ｉｊｏ、ｏｏ。 である特許請求ＩＩＩＩｌかもｊまでのどれかに記載さ
   れ先方法。
7. （７）用いられる共重舎体におけるＤ−ダルタ（ン酸と
   Ｄ−リジンとの毫ル比が約７５：Ｊ＃から約ＪＯニア０
   であゐ特許請求範ＩＩｌから４１てＯどれかに記載畜れ
   先方法。
8. （８）　　他Ｏ抗原（第コ抗原）がステロイド、カテコ
   ールアミン、ペプチド、薬剤またはこれらのすプエエッ
   トあるいは７ツダメントで参番畳許請求１１１１ｉ／か
   ら７ｔでＯどれかＫｌ！＄−［れた方法。 （鴫　ステ賛イドがテストステレフ％Ｉａ−ジヒドロテ
   ストステｐン、アンドロステ■ン、工ｆｔ；ラノーン、
   〕四ゲステ四ン、／７α−ハイトロキシプロゲステロン
   、グレグネノ四ン、デヒト關エビアンドロステロン、エ
   ストラジオール、エストロン、エストリオール、アルド
   ステロン、デオキシコルテコステロン、コルチゾール、
   コルチゾン、コルテコステロン、／／−ｆオキシコーチ
   ゾール、駆汁駿（グリココール酸、プール酸、デオキＳ
   ／：ｙ−ル酸、リド；−ル酸）及びそＯ抱合体である特
   許請求＊ｖｓｒ記載の方法。 （ｌ呻　カテコールア建ン類が、ドバーミン、ノルエピ
   ネフリン、エピネフリン１１九はその鱒導体であゐ特許
   請求範ｓｔ記載の方法。 ａｌヘフチドがガストリン、プレシストキニンーパンク
   レオヂ（ン、インシュリン、プ冒インシエリン、０−ペ
   プタイド、グルカゴン、卵胞刺歇申ルモノ（νａｍ）、
   黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨４性ゴナドトロピン（ｉ
   ｃｅ）、ソｉトスタチン、甲状腺刺激ホルモン（〒８１
   １）、これらのサブユニット★たは関連するペプチドで
   ある特許請求１１ｆｉｆ記載の方法。 ａ２　　薬剤が１−グμプラノｐ−ルまた祉り蓋ま九は
   Ｄｌｌのシクラゾシンである特許請求範Ｉｌｒ記載の方
   法。 α葎　公知方法によって抗血清から抗体を特徴する特許
   請求範囲Ｊから７Ｊまでのどれかに記載され丸方法。 α◆　公知方法によって抗体産生能を有するクローンを
   哺乳動物から分離する特許請求範囲Ｊから／Ｊｆｉでの
   どれかに記載された方法。 ａ啼　特許請求ＩＩｍ！−から／Ｊｆｉでのどれかに記
   載された方法によって得られえ抗体を含有する抗血清。 舖　特許請求範＠Ｊ記載方法によって得られかつ特許請
   求１１１！／ｆｆｉ載の抗体生産能を有するクローン。 鰭　善許請求範ｔｒｉｐ−載の方法によって得られかつ
   特許請求Ｉ［ＩＩ／記載の抗体生産能を有するクローン
   。