JPH0323151B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はイムノアツセイ等において用いられる
高い特異性と低い交叉性とを有する抗体を産生す
る能力を有するクローンおよびその作成法に関す
る。 ホルモン等の生体内活性物質を高感度でかつ特
異的に測定する分析法としてイムノアツセイ法が
知られている。この方法は、競合的な抗原／抗体
反応を利用するもので、一定量の抗体と可変量の
抗原とを用いる分析法である。たとえば、ラジオ
イムノアツセイ法は一般に次の４つのステツプか
ら成り立つている。 (1) 標識抗原及び特異抗体の作成。 (2) 非標識抗原存在下における標識抗原と特異抗
体との反応。 (3) 標識抗原と抗体との反応物からの標識抗原の
分離。 (4) 放射活性の測定、次いで標準曲線を用いる定
量。 標識抗体と非標識抗原とを用いることもでき
る。 ステツプ１が最も重要で測定に用いる試薬とし
ての抗体は、被検物質（抗原）に対して厳密な特
異性を有することが要求される。しかし、この要
求が満たされない場合がある。すなわち非常に高
い特異性を有すると考えられるイムノアツセイに
おいてさえも、用いられる抗体が被検物質と類似
構造を有する他の物質と交叉反応を生じる場合が
あり、これがイムノアツセイの難点の１つとなる
場合がある。 このような難点を克服する公知手段は次の二つ
の方法に大別される。すなわち (1) 物理化学的方法を利用して、被検物質の試料
から各種の交叉反応性物質を除去した後に測定
する。 (2) 抗血清中の交叉反応性抗体を免疫吸着剤を用
いてあらかじめ吸収して除去する。または検出
物質に対し出来るだけ高い特異性を有する高度
に精製された抗体を測定に用いる。 目的物質に対して最高の特異性を有する抗体を
得るために、動物宿主に投与する前に担体蛋白質
に抗原を化学構造上適当な部位において、結合さ
せることによつて、抗体によつて認識されるべき
抗原の、特異抗原決定基部位を単体蛋白の表面に
露出させることが提案されている。特異抗原決定
基部位が露出されると、低交叉反応性抗体の産生
が誘起される。 しかし現在までに行なわれてきたこの種のアプ
ローチは、一般に複雑な手法と合成過程を必要と
する欠点がある。しかも交叉反応性抗体の産生を
避けることができない場合もある。この種の困難
は、イムノアツセイ法の限界を規定している。 本発明は、Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンとの
共重合体（以下Ｄ−GLという）の使用によつて、
交叉反応性抗体の量を減少することができ、しか
もある種の物質（たとえば被検物質）に対して優
れた特異性を有する抗体を得ることができるとい
う知見に基いている。この共重合体（Ｄ−GL）
は、Ｂ細胞（抗体産生前駆細胞）に作用して効果
的な免疫無応答性（寛容性）を誘発する。すなわ
ちＤ−GLと結合された抗原を動物に投与した場
合、一般に生体内のＤ−アミノ酸は容易に代謝さ
れないし、またＤ−GLは生体内のＴ細胞の免疫
応答性を実質的に誘起しない。従つて、Ｄ−GL
と結合された抗原を動物に投与した場合、抗原と
Ｄ−GLの結合物はＢリンパ球表面の免疫グロブ
リン受容体と結合し、これによつて、これらの細
胞内に不可逆的な無応答性（寛容性）を誘起す
る。 従つて本発明は、所望の抗原決定基をもつ第１
抗原に対して当該抗原決定基以外の部分で構造的
に類似する一つ以上の抗原決定基をもつ第２抗原
と共有結合されたＤ−グルタミン酸とＤ−リジン
との重合体を哺乳動物に投与し、これによつて、
上記第２抗原に対する効果的な免疫無応答性を上
記哺乳動物に誘起した後に、上記哺乳動物を第１
抗原で免疫し、所望の抗体産生能をもつ細胞を生
成し、上記細胞を上記哺乳動物から分離し、これ
を培養する方法によつて得られた、上記第１抗原
に対する高い特異性と上記第２抗原に対する低い
交叉性とを有する抗体を産生する能力をもつクロ
ーンを提供する。 本発明により、上記抗体を産生する能力を有す
る一定の遺伝的構造をもつ細胞（以下クローンと
いう）を哺乳動物の生体内に産生することができ
る。従つて、本発明によるＤ−GLと交叉反応性
抗原との結合物を哺乳動物に投与することによ
り、交叉反応性抗原に対して実質的に有効な免疫
無応答性を誘起し、次にこの哺乳動物を所望の抗
原すなわち特定の免疫決定基を含有する抗原で免
疫することによつて低交叉反応性で特定の決定基
に対して高い特異性を備えた抗体を産生すること
ができる。 上述の高い特異性を有する抗体を、精製抗体の
形で、または上記抗体を含有する抗血清の形で産
生することができる。また哺乳動物の生体からと
り出したクローンを抗体産生に利用することもで
きる。すなわち所望によりクローンを適当な腫瘍
細胞との融合（ハイブリツド化）によつて永久に
生き続けさせ、このクローンから抗体を産生する
こともできる。従つて、一度クローンが得られる
と、もとの生きた哺乳動物がいなくても所望の抗
体を産生することができる。 従つて、本発明により、上記の方法で得られた
クローンを利用する上記抗体の製法が提供され
る。よく知られたように、適当なクローンが入手
できれば、これを適当な腫瘍細胞と結合すること
により、融合細胞（ハイブリドーマ）を容易に得
ることができる。たとえば、ある種のクローンと
骨髄腫瘍細胞（myeloma cells）の癒合細胞（ハ
イブリドーマ）は文献中に、たとえばケーラー
（Kohler）等［ネーチユア（Neture）、256巻、
495−497（1975）、およびユーロピアンジヤーナ
ル、オブ、イミユノロジー（Eur.J.Immunol.）、
６巻、511−519（1976）］により；ミルスタイン
（Milstein）等［Nature.266巻、550−552（1977）］
により；そしてウオルシユ（Walsh）［Nature、
266巻、495（1977）］により記載されている。 次いで該ハイブリツド細胞を他の動物に移植す
ると、該動物性体内（例えばマウスの腹水中な
ど）で増殖を続け、大量の特異抗体を産生する。
従つてこのハイブリツド細胞は所望の抗体の新た
な源泉となり得る。 次に本発明は、前述の方法により得られた抗体
またはこの種の抗体を含有する抗血清を利用した
イムノアツセイ法を提供する。上記抗体は上記物
質に対して特異性を有しているので、従つて、ア
ツセイは抗体と上記物質との反応によつて行なわ
れる。 この場合、アツセイされるべき物質は抗原とし
て作用するのである。本発明によるイムノアツセ
イ法を、ラジオイムノアツセイ法、非アイソトー
プイムノアツセイ法（たとえば酵素、遊離基、細
胞、ウイルス、金属イオン、蛍光体、化学的発光
体等で標識を行つた方法）で行なうことができ
る。本発明によるアツセイ法は、交叉反応性抗原
の存在化にも行なうことができる。 本発明の目的に利用されるＤ−DLは分子量が
約27000から約120000のものがよい。Ｄ−グルタ
ミン酸とＤ−リジンのモル比は70：30〜30：70の
ものが利用され、たとえばＤ−グルタミン酸：Ｄ
−リジン＝60：40のものである。この種の共重合
体は、例えばMiles−Yeda（米国）社から市販さ
れているが、一方、常法により、Ｄ−グルタミン
酸−γ−メチルエステルのＮ−カルボン酸無水物
とε−Ｎ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−リジンの
Ｎ−カルボン酸無水物とを適当なアミンの存在下
共重合し、次いで保護基をとりはずすことによつ
て調製することもできる。 イムノアツセイ用抗体産生に、たとえば多数の
天然物を用いることができる。好ましい材料の例
はステロイド類、及びそのグルクロン酸抱合体お
よび硫酸抱合体、カテコールアミン類、ペプチド
類及びそのサブユニツトならびに関連化合物（フ
ラグメント）その他の各種薬剤等である。 具体的なステロイドの例は、テストステロン
（以下Ｔと略す）、5α−ジヒドロテストステロン
（以下DHTと略す）、アンドロステロン
（Androsterone）、エチオコラノロン
（Etiocholanolone）、プロゲステロン
（Progesterone）、17α−ハイドロキシプロゲステ
ロン（17α−hydroxyprogesterone）、プレグネノ
ロン（Pregnenolone）、デヒドロエピアンドロス
テロン（Dehydroepiandrosterone）、エストラジ
オール（Oestradiol）、エストロン（Oestrone）、
エストリオール（Oestriol）、アルドステロン
（Aldosterone）、デオキシコルチコステロン
（Deoxycorticosterone）、コルチゾール
（Cortisol）、コルチゾン（Cortisone）、コルチコ
ステロン（Corticosterone）、11−デオキシコー
チゾール（11−deoxycortisol）、胆汁酸｛グリコ
コール酸（glycocholic acid）、コール酸
（Cholic acid）、デオキシコール酸
（Deoxycholic acid）、リトコール酸
（Lithocholic acid）など｝及びその抱合体であ
る。 カテコールアミン類の例は、ドパーミン
（Dopamine）、ノルエピネフリン
（Norepinephrine）、エピネフリン
（Epinephrine）である。 ペプチドホルモン類の例はガストリン
（Gastrin）、コレシストキニン−パンクレオチミ
ン（Cholecystokinin−pancreozymin）、インシ
ユリン（Insulin）、プロインシユリン
（Proinsulin）、Ｃ−ペプタイド（Ｃ−peptide）、
グルカゴン（Glucagon）、卵胞刺激ホルモン
（FSH）、黄体ホルモン（LH）、ヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン（HCG）、ソマトスタチン
（Somatostatin）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）
およびこれらのサブユニツトならびに関連化合物
などである。 薬剤の例はβ−遮断剤のプロプラノロール（ｌ
−Propranolol）など、鎮痛剤のＬ型またはＤ型
のシクラゾシン（Cyclazocine）などである。 例えば抗Ｔ抗体または抗血清が常用の免疫法で
作成される場合、DHTの構造はＴの構造に酷似
しているので、DHTは交叉反応性抗原として作
用する。同様に、抗DHT抗体または抗血清が作
成される場合、Ｔは交叉反応性抗原として作用す
る。このようにして、各種ステロイドは他のステ
ロイドに対する交叉反応性抗原として作用するの
である。 上記の物質は一般的にハプテンの類である。す
なわち、これらの物質は抗体と結合することは出
来るが、生体に投与される前に担体と結合されな
い限り免疫応答を誘起する能力がないか、または
弱い免疫応答した誘起できないかである。従つて
抗体産生を誘起するためには、上記物質を適当な
担体上に結合させなければならない。たとえば、
ある種の抗原に対して特異的な抗体（たとえば抗
テストステロン抗体、以下抗Ｔ抗体と称する）を
誘起するためには、この抗原を適当な担体と結合
して免疫に用いなければならない。しかし、こう
して得られたＴクローンおよび抗体は類似構造を
有する物質（例、DHT）と強い交叉反応性を有
するのが普通のことである。本発明によれば、Ｄ
−GL共重合体と交叉反応性抗原（この場合には
DHTである）との結合産物で動物を処理するこ
とにより、上記の交叉反応性を有する抗DHTク
ローンおよび抗体の生成を特異的に抑制すること
ができる。 また、所望の抗原に類似したペプチドとＤ−
GLとの共有結合物を用いて動物を処理すること
によつて、所望の抗原の特定の決定基と反応し得
る抗体が得られることも解つた（この場合、上記
ペプチドの構造の一部は所望抗原の構造の一部と
共通である）。この一例は、消化管ホルモンの一
種であるコレシストキニン−パンクレオチミン
（以下CCK−PZと略す）のＣ−末端の８つのアミ
ノ酸からなるオクタペプチドの抗体である。尚参
考のためにガストリン（ヒト）、CCK−PZおよび
関連化合物の構造式（アミノ酸配列）を示す。

【表】 コレシストキニン−パンクレオチミン
（Cholecystokinin−pancreozymin）（CCK−PZ）
は主に小腸から分泌され、膵臓の酵素分泌を刺激
し、胆嚢収縮を起こす消化管ホルモンで、33個の
アミノ酸からなるポリペプチドである。その生物
活性はＣ−末端の８つのアミノ酸部分（CCK
octapeptide、以下CCK−８−Ｐと略す）に存在
することが知られている。また、CCK−８−Ｐ
のＣ末端５個のアミノ酸配列は胃において酸分泌
を刺激するホルモンであるガストリンのＣ末端５
個のアミノ酸配列と同じである。従つて、従来の
抗CCK−８−Ｐ抗体はガストリンと高い交叉性
を示すことが知られている。 一方、CCK−８−Ｐおよびその反応性リセプ
ターは脳にも存在することが近年見出された。こ
のホルモンの神経伝達物質（neurotransmitter）
としての機能を調べることや胃腸管の疾患との関
係のあるこのホルモンの分泌と作用を知ることが
望まれている。従つて、CCK−８−Ｐに特異的
に反応する抗体の提供が重要である。 本発明によると、Ｄ−GLとペンタガストリン
（すなわちガストリンとCCK−８−ＰのＣ末端の
５個のアミノ酸）の共有結合物を動物に投与する
ことによつて、ペンタガストリンおよびまたはガ
ストリン様化合物と交叉反応する抗体を産生する
クローンを不活性化した後、上記動物をCCK−
８−Ｐ−KLHで免疫することによつて、CCK−
８−Ｐと特異的に反応し得る抗体を生産し得るク
ローンおよびこの種の抗体を得ることができる。 従つて本発明によると、所望の抗原のＣ端側フ
ラグメントとしてのペンタガストリンとＤ−GL
との共有結合物を用いて動物を処理した後に、こ
の動物をガストリンで免疫することにより、クロ
ーン（CCK−PZと交叉反応するクローン）の産
生を抑制すれば、ガストリンに対して特異性を有
する抗体を得ることができる。 下記の実施例から分るように、ペプチドの分別
（fragmentation）によつて、全ペプチドから特
定の抗原決定基を容易に除去することができない
場合でも、Ｄ−GLと交叉反応性ペプチドとの共
有結合物を免疫動物に投与することによつて、所
望の特異的抗体を得ることができる。 例えば、アタツシら（Atassi et al）により、
リゾチームの抗原決定基の組成が“Surface
stimulation model”に基づく合成ペプチドを使
つて証明されている〔Atassi、M.Z.
Immunochemistry15巻909−936頁（1978年）〕。 その場合の如く、抗原決定基が不規則な間隔で
存在するアミノ酸によつて形成されるような場
合、たとえば抗原決定基がABCDなるアミノ酸
で形成されているとすると、全く異なつたアミノ
酸配列を有するペプタイドでもたまたま立体的に
共通の抗原決定基Ｂ−Ｃを形成する部分があつた
場合、アミノ酸Ｂ−Ｃを含む抗原決定基をＤ−
GLと結合して得られた物質を動物に投与し、こ
れによつてアミノ酸Ｂ−Ｃを含む抗原決定基との
交叉反応性をもつクローンを消去すると、この結
果、抗原決定基Ａ−Ｄに向かつた特異的クローン
を選択的に増加させ、特定の部位に向かつた抗体
のみを産生増巾することができる。 上記抗原とＤ−GLとの結合物は、(1)上記抗原
とＤ−GLを直接結合する方法あるいは(2)抗原と
Ｄ−GLとを架橋して間接的に結合する方法によ
つて調製される。架橋物としては、Erlangerら
によるオキシム化合物、サクシニル化合物および
クロルカルボン酸化合物〔例えば、B.F.
Erlanger et al.J.Biol.Chem.228．713（1957）］、
カルボキシメチルチオエーテル誘導体
〔Weinstein Ａ et al.Steroids20、789（1972）〕、
カルボキシメチルエーテル誘導体〔P.N.Rao et
al、J.Steroid Biochem.９、539（1978）〕などが
用いられる。 結合法としてはカルボジイミド法
（Carbodiimide Method）、無水物法（Mixed
Anhydride Method）、シヨツテンバウマン法
（Schotten−Baumann Method）、イソキサゾリ
ウム法などがあげられる。 なお、−NH₂基が上記化合物に導入されれば、
グルタアルデハイド法を用いて結合することがで
き、又−NH₂基または−SH基が導入されればｍ
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ・サク
シニミド−エステル、サクシニミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル−シクロヘキサン）−１−カ
ルボキシレート、サクシニミジル−４−（Ｐ−マ
イレミドフエニル）ブチレート等またはＮ−サク
シニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネート、Ｎ−サクシニミジル−（４−アジドフ
エニルジチオ）プロピオネート等が用いられる。 その他ペプチド化学において常用されるペプチ
ド類の他物質との結合方法は、全て、Ｄ−GLと、
抗原との結合に利用できる。 また本発明で用いられる免疫抗原は通常はハプ
テンであるので、抗原を通常の免疫方法で常用さ
れる適当なキヤリアーと結合した後に用いられ
る。 好適なキヤリアーとして例えば、スカシガイの
ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin、
以下KLHと略す）、種々の異種動物、例えばヒ
ト、ヤギ等の血清γ−グロブリンやアルブミンな
どが例示される。 これらのキヤリアーと抗原、そのサブユニツト
または関連フラグメントとの結合方法は、交叉性
抗原そのサブユニツトまたは関連フラグメントと
Ｄ−GLとの結合方法と同様で直接結合させるか、
適当な中間物で架橋して結合する方法が用いられ
る。後者の場合Ｄ−GLと交叉反応性抗原の結合
に用いたと同じ中間物と方法が用いられる。 免疫方法は常法による。動物によつて抗原（ハ
プテンとキヤリアとの結合物）の生理食塩水溶液
を腹腔内もしくは足蹠と背中に、初回は完全フロ
インドアジユバンドと共に、２回目は不完全フロ
インドアジユバントと共に投与する。その後、マ
ウスでは生理食塩水のみでよい。ウサギのような
大動物では完全フロインドアジユバントと不完全
フロインドアジユバントを交互に投与することが
できる。 投与量は抗原とキヤリアーの結合比、キヤリア
ーの分子量等によるが、通常は小動物例えばマウ
スで１／μｇ／〜100μｇ／１匹、ウサギ等の大
動物では0.1mg〜１mg／１回／１匹を２〜５回、
２−４週間毎にくり返し投与する。 交叉反応性抗原と、Ｄ−GLとの結合物を通常
は第１回の免疫操作の２−３日前に投与する。も
ちろん抗原の種類によつては、第１回、第２回の
免疫処理后でも抗原とＤ−GLとの結合物を投与
してもよい。 交叉性抗原とＤ−GLとの結合物の投与量はマ
ウスのような小動物では、100μｇ〜500μｇ、ウ
サギ等の大動物では２−10mgが好ましい。この投
与量は交叉反応性を示す抗原（ハプテン）のＤ−
GLに対する結合量、結合位置や中間に介在する
化合物の種類等により多少変化する。 実用的には、抗原とＤ−GLとの結合物は生食
溶液として腹腔内に投与される。 交叉反応性抗原とＤ−GLとの結合物の結合様
式は免疫用抗原とキヤリアとの結合様式と同一で
あることが好ましいので、同一の中間物を交叉反
応性抗原とＤ−GLとの結合および抗原とキヤリ
アとの結合に用いることが好ましい。 上記の如く、Ｄ−GLと交叉反応性抗原との結
合物を動物に投与することにより、特定の交叉反
応性抗原に特異的に強力な免疫学的無応答性を誘
起することができる。その後、特定の所望の抗原
決定基を含む所望の抗原で免疫する。これによつ
て、低交叉反応性でかつ目的とする特定の抗原決
定基に対して極めて高い特異性を有する抗体を産
生し得るクローン、抗体もしくは該抗体を含有す
る抗血清を得ることができる。 前述の知見はマウスのような小動物ばかりでな
くウサギのような大動物に於いても確認された。
動物種が違えば結果も違うと予想されるにも拘ら
ず、小動物でも大動物でも同じ結果が得られたこ
とは実用的にとても重要である。何故ならばウサ
ギのような大動物を使用すると、マウスのような
小動物よりも、もつと大量の抗体を得ることがで
きるからである。 ＴとDHTのような、構造類似の化合物を識別
し得る抗体の作成は従来困難であつたが、本発明
によつて、一つの抗原を他の交叉反応性抗原から
識別し得る抗体を産生し得る多数のクローンを選
択的に得ることができる。特異性抗体を産生する
クローンの生体内での頻度が増加する結果、特定
のクローンを摘出、単離することが実際に可能と
なる。公知文献によると、特定の、抗原を分別す
る能力を有するクローンを動物から取り出せる確
立は約百万分の１ないし一千万分の１であり、従
つてこの種の摘出および単離は事実上不可能とさ
れていた。しかし、本発明によつて得られる特異
的抗体産生能を有するクローンは、交叉反応性決
定基を含有する抗原で免疫した場合においてさえ
も、所望の抗原決定基と構造上類似の交叉抗原決
定基との差を特異的に識別することができる。本
発明の方法は、この種の特異抗体を高い確立で生
成することを可能にし、従つて、この種の特異性
抗体産生能を有するクローンの生成の確立も高め
ている。 Ｄ−GLと低交叉反応性抗原との結合法、結合
される抗原の種類等を適当に変形することによつ
て、本発明の方法を、すべての抗体生産法に適用
することができる。 次に本発明は、試料中に含有された特定物質の
量が不明である場合に、この物質を簡単に定量す
る方法を提供する。この方法は後記方法によつて
得られた抗体または抗血清を用いることを特徴と
している。 下記の実施例において用いられた試薬および分
析法は次の通りである。 (1) DHT−３−（ｏ−カルボキシメチル）オキシ
ム（以下DHT−３−CMOと略す）の合成法。 (イ) 反応式： (ロ) 使用原料 ³H−DHT（Radiochemical Centre、
Amersham） 6μci（DHTとして0.015μｇ） DHT（Sigma Chemical Co.、アメリカ）
0.3ｇ（１ｍmole） （ｏ−カルボキシメチル）ヒドロキシルア
ミン・ヘミハイドロクロライド（東京化成工
業株式会社） 0.3ｇ（2.7ｍmole） 2N−NaOH 1.25ml エタノール 15ml (ハ) 操作 上記原料を還流器付丸底容器に入れ３時間
加熱還流後反応液に精製水45mlを加え、更に
希NaOH液にてPHを８にした。この液を分
液ロートに移し、酢酸エチル約30mlを加えて
振とうし、次いで酢酸エチル層を分液して除
き、未反応DHTを除去した。次いで水層に
氷を加えて冷却し、希塩酸で酸性（約PH４）
にし冷酢酸エチルを加え生成したDHT−３
−（ｏ−カルボキシメチル）オキシムを抽出
し、該酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで
脱水後、酢酸エチルを蒸発除去し残渣を熱メ
タノールから再結晶し、目的物を得る。 (2) テストステロン−３−（ｏ−カルボキシメチ
ル）オキシム（以下Ｔ−３−CMOと略す）の
合成法。 ³H−DHTに代えて³ Ｈ−Ｔ、DHTに代え
てＴを夫々同モル量用いる他は(1)と同様の操作
を行なつて目的物を得た。 (3) hapten−Ｄ−GLの合成法 (イ) DHT−３−（ｏ−カルボキシメチル）オキ
シム−Ｄ−GL（以下DHT−３−Ｄ−GLと略
す）の合成法（Erlanger等による混合酸無
水物法に準拠する） 反応式： (a) 使用原料 DHT−３−CMO.（トレーサーとしての
³HラベルしたDHT−３−CMOを含む）
20mg 乾燥ジオキサン （１ml＋５ml） tri−ｎ−ブチルアミン 20μ クロルギ酸イソブチルエステル 10μ 精製水 ６ml Ｄ−GL（Mw49000） 30mg 1N−NaOH 150μ (b) 操作 DHT−３−CMO20mgを無水ジオキサン
（ジオキサンにモレキユラーシーブ5Aを加
え脱水したもの）１mlに溶解し、攪拌下に
tri−ｎ−ブチルアミン20μを加え11℃に
保ちつつ５分間攪拌した。次いでクロルギ
酸イソブチルエステル10μを加え11℃に
保ちつつ１時間攪拌下に反応する。別にＤ
−GL30mgを精製水６mlに溶解し、1N
NaOH150μを加え混和し、この液にジ
オキサン５mlを徐々に加えた。 このＤ−GL溶液を攪拌下上記反応液に
一度に加えた。10分後、PHを調べ、1N−
NaOHを極く少しずつ加えてPHを6.5〜7.0
に戻し、約２時間10℃前後で攪拌を続け
る。次いでこの反応液を４℃で一夜水にて
透析し、翌朝希塩酸で約PH4.5に調節する
と沈澱が析出した。この液を４℃で７時間
放置し沈澱を完了した。次いでこの液を遠
心分離し（４℃、3000rpm、20分間）上清
は捨て、沈澱物に精製水10c.c.を加え、1N
−NaOHでPHを約7.0に調整して沈澱物を
溶解する。この溶液を４℃で精製水で１液
透析し、次いで凍結乾燥した。 トレーサーとして加えた³H−DHT−３
−CMO1mg当りの放射活性と反応生成物１
mgの放射活性よりＤ−GL1モル当りに結合
したDHTの数を算出した。得られた反応
生成物のDHT対Ｄ−GLのモル比は30：１
であつた。 Erlanger等による混合酸無水物法の原
報〔J.Biol.Chem.228、713（1957）〕より算
出したBSAに対する水およびジオキサン
の量ではＤ−GLを添加した時にゲル状に
なるために、水およびジオキサンを多量に
加え、Ｄ−GLが反応液中でゲル状になる
のを防ぎ、かつ反応が適当に進むようにジ
オキサンと水の量を決めた。この工夫によ
り混合酸無水物法でＤ−GLとオキシムの
結合が可能となり且つ、充分の量のオキシ
ムがＤ−GLに結合するのを可能にした。 (ロ) テストステロン−３−（ｏ−カルボキシメ
チル）オキシム−Ｄ−GL（以下Ｔ−３−Ｄ−
GLと略す）の作成 Ｔ−３−オキシム（トレーサーとしての
³HラベルＴ−３−オキシムを含む）を用い
る他は前記と同様の操作を行つてＴ−３−Ｄ
−GL37mg（Ｔ：Ｄ−GLのモル比は30：１）
を得た。 (4) hapten−KLHの合成法 (イ) DHT−３−（ｏ−カルボキシメチル）オキ
シム−KLH（以下DHT−３−KLHと略す）
の作成法 (a) 使用原料 DHT−３−CMO（トレーサーとして
³Hラベルのオキシムを含む） 12mg 無水ジオキサン 0.5ml＋2.5ml tri−ｎ−ブチルアミン 10μ クロルギ酸イソブチルエステル 5μ 精製水 ４ml KLH（Mw100000） 150mg 1N NaOH 75μ (b) 操作 上記原料を用いて前記同様の操作を行な
つてDHT−３−KLH54.7mg（DHT：
KLHのモル比は10：１）を得た。 (ロ) Testosterone−３−（ｏ−
carboxymethyl）oxime−KLH（以下Ｔ−３
−KLHと略す）の作成法 Ｔ−３−CMO（トレーサーとして ³Hラベル
のオキシムを含む） 40mg 無水ジオキサン ２ml＋５ml tri−ｎ−ブチルアミン 40μ iso−ブチルクロルギ酸 20μ 精製水 10ml KLH 300mg 1N NaOH 300μ を用いて前記と同様の操作を行つてＴ−３−
KLH197mg（Ｔ：KLHのモル比は８：１）
を得た。 (5) Radioimmunoassey操作法 試 薬 (1) ³H−Ｔ標準液 １，２， ³H−Ｔ（58Ci／ｍmol）をエタ
ノールで希釈し、20000dpm／10μ（Ｔと
して45Pｇ）含むエタノール溶液を作成す
る。 (2) ³H−DHT標準液 5α−ジヒドロ−１，２，４，５，６，７
− ³H−Ｔ（114Ci／ｍmol）をエタノールで
希釈し、40000dpm／10μ（DHTとして
45Pｇ）含むエタノール溶液を作成した。 (3) 0.05Mトリス緩衝液PH8.0（0.05％BSA、0.1
％BGGを含む） (4) 飽和硫酸アンモニウム溶液 (5) 非放射ラベルのＴ標準液 (6) 非放射ラベルのDHT標準液 操作法(1) 抗テストステロン抗血清の力価の測定 上記 ³H−Ｔ標準液10μをガラスチユーブ
に入れ、蒸発乾固した。これにトリス緩衝液で
段階希釈した抗血清0.2mlを加え混和する。２
時間室温で放置後0.2mlの飽和硫酸アンモニウ
ム溶液を加え混和した。次いで遠心分離
（3000rpm、10分間）した。上清0.2mlをバイア
ルに移し、シンチレーター（PPO2.0ｇをトル
エン１に溶解しもの）２mlを加え、放射活性
を測定した。 操作法(2) 抗テストステロン抗血清のDHTとの
交叉反応性の測定 上記 ³H−Ｔ標準液各10μを二系列のガラ
スチユーブに入れ、一つの系には非放射ラベル
のＴ標準液を他の一つの系には非放射ラベルの
DHT標準液をそれぞれ加え、非ラベルステロ
イドをそれぞれ段階的に量を増して加え、次い
でそれぞれを蒸発乾固した。0.2mlの抗血清
（トリス緩衝液で希釈し）をガラスチユーブ中
の ³H−Ｔ（45pｇ）の60％と結合し得る濃度に
して上記ガラスチユーブに加え混和する。２時
間温室で放置後、上記操作法(1)と同様の操作を
行なう。 交叉反応性はアブラハムの方法〔Abraham
G.E.：J.Clin.Endocr.29（1969）866−870〕に基
き算出する。 操作法(3) 抗DHT抗血清の力価の測定 ³H−Ｔ標準液に代えて、 ³H−DHT標準液
を用いる他は、前記操作法(1)と同様の操作を行
ない測定した。 操作法(4) 抗DHT抗血清のＴとの交叉反応性の
測定 ³H−Ｔに代えて、³H−DHTを用いる他は、
前記操作法(2)と同様の操作を行ない測定した。 実施例 １ マウスにおける低交叉反応抗テストステロン
特異抗体の作製 C57BL／６系８−10週雌マウス１群４−５匹
を３群用いた。第１群は対照群でDHT−３−Ｄ
−GLを投与しないで生理食塩水を投与した。第
２群は500μｇのDHT−３−Ｄ−GLを、Ｔ−３−
KLHによる初期免疫３日前に、マウスの腹腔内
に投与した。各群にＴ−３−KLH（100μｇ／匹）
の生理食塩水溶液を完全フロインドアジユバント
と共に腹腔内に投与した。３週間後同量のＴ−３
−KLHの生理食塩水溶液を不完全フロインドア
ジユバントと共に各マウスに投与した。５、７、
９、17週後には、同量のＴ−３−KLHの生理食
塩水溶液を各マウスにそれぞれ投与した。第３群
には、DHT−３−Ｄ−GL（500μｇ）をＴ−３−
KLHによる第２回（初回から３週間後）、第３回
（初回から５週間後）免疫の各３日前に夫々投与
した。２週間毎に採血を行ない抗体価および交叉
反応性を測定した。結果の一部を表１に示す。交
叉反応性はアブラハム法で測定した。

【表】 表１から明らかな如く、第２群は対照群の第
１群に比べ抗体価はやや低いものの対照群とよ
く似た様相の抗体産性を示していることが判か
る。一方第３群では全経過にわたつて有意な抗
体産生が認められなかつた。 又、DHT−３−Ｄ−GLで前処理をうけた第
２群では対照群に比べ、DHTとの交叉反応性
が著明に低下していることが判かる。 又、表１の結果を個々のマウスについてその
抗体の抗体価と抗体の交叉反応性の関係を夫々
プロツトして調べると抗体価と交叉反応性の間
に相関々係は認められなかつた。一般的にみて
DHT−３−Ｄ−GLで前処理した場合、DHT
との交叉反応性は低下し、それと抗体価の低下
との間に相関関係は認められなかつた。すなわ
ち交叉反応性が低いと抗体価が低いといつた関
連性も認められない。これらの事実から明らか
なように、DHT−３−Ｄ−GLの事前投与によ
り、DHTと交叉反応性を示すクローンを除去
してやると、その次のＴ−３−KLHでの免疫
によりテストステロンに関してより高い特異性
を有する抗体生産能を有するクローンの生成が
選択的に強化される。このように低交叉性の抗
体を選択的に産生することは本発明の実用上の
有利さを示すものである。 実施例 ２ マウスにおける低交叉反応性抗ジヒドロテス
トステロン特異抗体の作製 本実施例２に於いても、C57BL／６系雌マウ
ス１群５〜７匹８週令を５群用いた。第１群は対
照群でＴ−３−Ｄ−GLで前処理しないで、DHT
−３−KLHで初回免疫を行ない、初回から３週
後に第２回免疫、初回から５週後に第３回免疫、
次いで２週毎に追加免疫を行なう。他群のマウス
の免疫時期、方法はコントロール群と同じであ
る。第２群はDHT−３−KLHでの初回免疫前３
日前に各500μｇのＴ−３−Ｄ−GLを各マウスの
腹腔内に投与した。第３群は別の対照群で、各
500μｇのDHT−３−Ｄ−GL500μｇをDHT−３
−KLHでの初回免疫前３日前に各マウスの腹腔
内に投与した。 第４群と第５群の各マウスをDHT−３−KLH
によつて第１回免疫し、その３週間後に第２回免
疫し、第２回免疫の３日前に各500μｇのＴ−３
−Ｄ−GLおよびDHT−３−Ｄ−GLをそれぞれ
腹腔内投与した。 以上５群について初回免疫７週後より２週間毎
に採血し、血清中の抗体価、交叉反応性を調べ
た。初回免疫後13週目の結果を第２表に示す。

【表】 注１）＊１、＊２共に表１の脚注に同じ。
表２の結果は実施例１で示されたのと同様にＴ
−３−Ｄ−GLの前投与により、第２群で示され
るごとく低交叉反応性抗DHT抗体の産生が認め
られた。 初期免疫後にＴ−３−Ｄ−GLおよびDHT−３
−Ｄ−GLで処理された第４および５群では抗
DHT抗体の有意義な産生は認められなかつた。 DHT−３−Ｄ−GLで前処理後、DHT−３−
Ｄ−KLHで免疫された第３群においてつくられ
た抗DHT抗体のＴとの交叉反応性は対照群と同
様に高かつた。また抗体価は第２、３群と同様で
あつた。このことによりＴ−３−Ｄ−GLで処置
すると、Ｔとの交叉反応性の低い抗DHT抗体が
得られることがわかる。 実施例 ３ ウサギ（家兎）の抗Ｔまたは抗DHT抗体の
作製 本実施例に於いては体重約３Kgの雌家兎１群２
匹６群用いた。 第１群のウサギの初回免疫は、完全フロインド
アジユバントで乳化したDHT−３−KLH（各
100μｇ）で行ない、その３日前にＴ−３−Ｄ−
GL（各10mg）を複腔内投与した。初回免疫の３週
間後にDHT−３−Ｄ−KLH（各200μｇ）を不完
全フロインドアジユバントと共に皮下注射するこ
とにより、第２回免疫を行なつた。それ以後１ケ
月毎に、完全フロインドアジユバントと不完全フ
ロインドアジユバントとを交代に用いて、DHT
−３−Ｄ−KLH（各200μｇ）による第３、４回免
疫を行なつた。第２群は対照群で、Ｔ−３−Ｄ−
GLを投与しないで、DHT−３−KLHで第１群
と同様に免疫した。第３群はDHT−３−KLHの
第２回（３週間後）、第３回（７週間後）投与に
よる免疫の夫々３日前に各10mgのＴ−３−Ｄ−
GLをウサギの腹腔内に投与した。 第４群は各10mgのDHT−３−Ｄ−GLをＴ−３
−KLHでの初回免疫前３日前にウサギの腹腔内
に投与した。 第５群は対照群でDHT−３−Ｄ−GLを投与せ
ず、Ｔ−３−KLHで第４群と同様に免疫を行な
つた。 第６群はＴ−３−KLHによる第２回（初回免
疫の３週間後）、第３回（初回免疫の７週間後）
免疫の夫々３日前に各10mgのDHT−３−Ｄ−GL
を各ウサギの腹腔内に投与した。採血を各免疫後
10日目に行なつた。その結果、第３群および第６
群では全経路にわたつて有意な抗体産生は認めら
れなかつた。 対照群である第２群からの抗DHT抗体および
第５群（コントロール群）から得られた抗テスト
ステロン抗血清は、免疫に用いたハプテンに対し
ても、又交叉反応性のハプテンに対してもほぼ同
程度の反応性を示した。すなわち第２群の抗
DHT抗体のテストステロンに対する交叉反応性
は100％、又第５群の抗テストステロン抗体の
DHTに対する交叉反応性は95.2％であつた。し
かし第１群および第４群では交叉反応物質に対し
て有意に低い反応性を示した。すなわち第１群の
抗DHT抗体のテストステロンに対する交叉は
11.9％、また第４群の抗テストステロン抗体の
DHTに対する交叉は22.0％であつた。 実施例 ４ ウサギ抗Ｔ特異抗体および抗DHT特異抗体
を用いたヒト血中ＴおよびDHTの測定 (1) 上記実施例の第１および第４群のウサギでそ
れぞれ低交叉反応性の抗Ｔ特異抗体及び抗
DHT特異抗体が得られたので、これらの抗体
のヒト血清中のＴ及びDHTの検出法への実用
性を検討するために、ヒト血清にそれぞれ既知
量のテストステロンおよびDHTを添加して、
上記抗血清を使つたラジオイムノアツセイで測
定されたＴおよびDHT量と実際に添加した量
との関係をしらべてみた。血中テストステロン
レベルの測定の際にはより実際の場合に則し、
プール血清（血清Ｔ値の低い女性の血清を用い
た。）１mlにT1、２、4nｇ、あるいは
DHT0.1、0.2、0.3nｇをそれぞれ加え、抽出操
作過程における回収率を測定するためにさらに
³H−T2000dpmあるいは ³H−DHT2000dpm
を加え混和した。各試料ごとにヘキサン：エー
テル（３：２）３mlを加えVortexミキサーに
て１分間振とうした。振とう後試験管を、ドラ
イアイス−アセトン浴に10秒間つけ、有機溶媒
層を別の試験管に移した。有機溶媒はエバポレ
ーターでとばし、残渣にエタノール２mlを加え
混和し、このエタノール溶液を各抗血清を用い
ての阻害曲線の測定可能範囲に相当するような
量ずつ小試験管に移し、蒸発乾固し、DHT−
Ｄ−GL前処理によつて得られた低交叉反応性
抗Ｔ抗体を用いてラジオイムノアツセイにて測
定した。一方、前記のエタノール溶液0.5mlを
バイヤルに移し、エタノールを蒸発させ、シン
チレーターを残渣に加えてカントをはかり、抽
出操作過程における回収率算出に用い、ラジオ
イムノアツセイによつて得られた値を補正し
た。また血中DHTレベルを測定する際にはヒ
ト女性プール血清１mlにDHT0.2、0.5nｇまた
はT0.2、0.5nｇをそれぞれ加え、抽出操作過程
における回収率を測定するために ³H−
DHT2000d.p.m.あるいは ³H−T2000d.p.m.を
加えよく混和した。ヘキサン：エーテル（３：
２）３mlを混合物に加え、前述と同様にして抽
出を行ない、抽出残渣に２mlのエタノールを加
え、このエタノール溶液の一部を小試験管に移
し、その量を各抗血清によるDHTの阻害曲線
の測定可能範囲にはいるように調整し、蒸発乾
固し、テストステロン−Ｄ−GL処理によつて
得られた低交叉反応性抗血清を用いてラジオイ
ムノアツセイにて測定した。一方エタノール溶
液0.5mlバイヤルに移し、エタノールを蒸発さ
せ、シンチレーターを残渣に加えてカウントを
はかり、抽出操作過程における回収率算出にも
ちいラジオイムノアツセイによつて得られた値
を補正した。 その結果は、低交叉反応性抗Ｔ抗体を使つて
正常女性血清にＴを１、２、4nｇ添加した場
合、その添加前の正常血清のＴ価は0.30nｇで
あつたが、それぞれの添加後の対応するＴ価は
1.15nｇ、2.30nｇ、4.60nｇであつた。 なお、同様な実験系にＴに代えてDHTを
0.1、0.2および0.3nｇを加え、測定されたテス
トステロン量へのDHTの影響をみると無添加
血清のレベルと殆んど同じであつて、有意な影
響のないことがわかつた。 一方、正常女性血清にDHTを0.2および0.5n
ｇを加えて血清中のDHT量を低交叉反応性抗
DHT抗体を用いて測定した結果は添加前の正
常血清ではDHT0.21nｇが測定されたのに対
し、それぞれのDHTを添加後では0.41および
0.72nｇのDHTが測定され、それぞれの値は添
加されたDHTとよく一致した。なお、同様な
実験系にDHTの代りにＴを0.2、0.5mgを加え、
測定されてくるDHT量へのＴの影響をみると
無添加血清のレベルと殆んど同じであつて、有
意な影響のないことがわかつた。 この結果は実施例３の低交叉反応性抗血清を
使用すると血清中のＴ或いはDHTレベルが正
確に測定されることを示す。 (2) 交叉反応性抗原と特異性抗原との混在系にお
ける測定 低交叉反応性ウサギ抗DHT抗体を用いてヒ
ト血中のDHTを測定する。 女性プール血清0.1mlに表３の如くDHTとＴ
の量をそれぞれ（5nｇ、10nｇ）、（10nｇ、5n
ｇ）、あるいは（10nｇ、10nｇ）ずつ加え測定
は上記(1)の例に従つた。その結果各量の交叉反
応性抗原であるＴが試料に含まれていても測定
されるDHTの量はそれぞれの場合について、
5.67nｇ、10.17nｇおよび9.20nｇであつた。こ
のことにより前記実施例３で得られた低交叉反
応性抗DHT抗体は、たとえ交叉反応性抗原で
あるＴが多量に含まれていてもDHTを正確に
検出することができることがわかつた。

【表】 また同様に血清0.1mlにテストステロンと
DHTを表４の如くそれぞれ（5nｇ、10nｇ）、
（10nｇ、5nｇ）、および（10nｇ、10nｇ）ずつ
加え、低交叉反応性ウサギ抗ステトステロン抗
体を用いてステトステロン量を測定した所、
夫々の場合について6.80nｇ、10.3nｇおよび
10.59nｇのステトステロンの価であつた。 このように低交叉反応性抗テストステロン抗
体の場合にも、交叉反応性であるDHTの存在
下でテストステロンを正確に測定することがで
きる。

【表】 (3) 実際のヒト検体の測定（直接法） 直接法とはＴとDHTを前もつて分離する操
作を何も行なわないで分析する方法を意味す
る。一方比較の為に従来法即ちペーパークロマ
トグラフイーでＴとDHTを夫々分別した後に
測定する方法による測定値を示す。 (3.1) 血清中のＴの測定 (イ) 共通の処理 0.1mlの男性血清サンプルまたは0.5mlの
女性血清サンプルをそれぞれ試験管にと
り、 ³H−Ｔを3000d.p.m.を抽出過程又は
抽出、クロマトグラフ分画過程における回
収率測定のために加えよく混和した。 さらに男性血清サンプルには純水0.5ml
を加える。ヘキサン：エーテル（３：２）
を３ml加え、Vortexミキサーで１分間振
とうした。試験管をドライアイス−アセト
ン浴に10秒間浸し、血清部分を凍結させ、
有機溶媒層を別の試験管に移し、有機溶媒
をエバポレーターでとばした。 (ロ) 直接法 男性血清サンプルの各残渣にエタノール
0.4mlを加え混和した。このエタノール溶
液を50〜400pｇの範囲に入れるために、
正常範囲では100μを、また第５表の１、
２、３号のような高テストステロン血清の
場合には50μを各小試験管に移した。抽
出操作過程における回収率測定の為に
100μをバイヤルに移し、蒸発乾固残渣
にシンチレーターを加えカウントした。 女性血清サンプルには上記ヘキサン−エ
ーテル抽出残渣にエタノール0.7mlを加え、
溶液0.5mlを小試験管に移した。抽出工程
の回収率測定のために100μをバイヤル
に移し、蒸発乾固後、残渣にシンチレータ
ーを加えカウントした。共に小試験管に移
したエタノール溶液のエタノールを窒素ガ
ス気流下蒸発除去し、残渣をラジオイムノ
アツセイに用いた。 (ハ) ペーパークロマトグラフイー法 上記の直接法と同様にして得られたヘキ
サン−エーテルによる抽出残渣にクロロホ
ルムを50μ加え、ペーパーに塗布した。
この操作を合計３回行つた。別に同様のペ
ーパーに標準マーカーとしてテストステロ
ン10μｇを塗布した。ペーパーをBushA
（シクロヘキサン：メタノール：水＝10：
８：２）の溶媒を含むクロマトグラフ・タ
ンクにセツトした。２時間後、BushAの
上層を加えて16時間展開した。展開後標準
マーカーとしてのテストステロンのスポツ
トを254nｍのU.V吸収で検出した。この標
準マーカーのスポツトに相当する検体用ペ
ーパーの部分の長さを３cmカツトし、エタ
ノール３mlで抽出した。エタノールを窒素
気流下で蒸発除去した。そして以下直接法
と同様に操作し、ラジオイムノアツセイに
用いた。 (ニ) ラジオイムノアツセイ Ｔ標準曲線の作成のためＴ・エタノール
溶液（Ｔとして０、20、50、100、200、ま
たは400pｇ含む）を各２本ずつ試験管に
とつた。これらの小試験管とサンプルを含
む小試験管に、 ³H−Ｔ・エタノール溶液
（20000dpm／10μ）10μをそれぞれ加
えエタノールを蒸発除去した。家兎抗Ｔ抗
血清を ³H−T20000dpm（Ｔとして45pｇ）
を60％結合しうるような濃度（Bo＝60％）
にするために、0.05Mトリス緩衝液〔PH
8.0、0.05％BSA（ウシ血清アルブミン）、
0.1％BGG（ウシ血清γ−グロブリン）を
含む〕で希釈し、各小試験管に0.2mlずつ
加え、vortex mixerで混和した。別に、
³H−T20000dpmのみを含む小試験管２本
にトリス緩衝液各0.2mlを加え、混和し、
Bo＝100％用とする。各溶液を２時間室温
で放置し、飽和硫安水溶液0.2mlを加え混
和した。3000rpmで10分間遠心分離し、上
清0.2mlをバイヤルに移し、シンチレータ
ー２mlを加えカウントした。そして測定さ
れたカウントをＢ／Bo（％）に換算した。 (3.2) 女性血清中のDHTの測定 血清サンプル量、抽出及びペーパークロマ
トグラフによるDHTとＴの分離操作は女性
血清サンプル中のＴの測定に用いられたもの
と同様に行つた。DHTの検出は１％ｍ−ジ
ニトロベンゼン・エタノール溶液と2.5N水
酸化ナトリウム・エタノール溶液の等量混合
溶液の噴霧によつておこなつた。 DHTのラジオイムノアツセイはDHT・エ
タノール標準液と³H−DHT・エタノール溶
液（40000dpm／10μ）を用いてＴのラジ
オイムノアツセイ法と同様に行つた。 直接法および常法によるペーパークロマト
グラフイー共に、ラジオイムノアツセイによ
つて得られた値を回収率によつて補正した。
直接法の場合にはＴ又はDHTの回収率は95
〜100％の範囲内にあり、測定値にバラツキ
がなかつたので、 ³H−Ｔ又は ³H−DHT添
加による回収率補正は通常の場合不要と考え
られる。結果を第５表、第６表に示す。 結果と解析

【表】

【表】 上表から明らかな如く、両測定法の測定値はそ
れぞれ明瞭な一致を示している。

【表】 上表から明らかな如く、両測定法の測定値はよ
い一致を示している。 以上の実験事実から明らかな如く、本発明によ
り提供される低交叉反応性抗体を用いる直接法に
より、交叉反応性抗原の存在下でも簡便正確に目
的物質を測定することができる。従来法のペーパ
ークロマトグラフイーのように、交叉反応性抗原
をあらかじめ分別する必要もなく簡単に目的物を
測定することができる。本発明により、交叉反応
性抗原とＤ−GLとの結合物で動物を前処理する
と、これによつて、交叉反応性抗原に対する免疫
無応答性を誘起し、その結果、特異性抗体および
上記抗体生産能を有するクローンとを得ることが
できる。この方法は、Ｔ−３−Ｄ−GLやDHT−
３−Ｄ−GLを用いた前述の例に限定されるもの
ではなくて、次の実施例５に示されるように、他
の例にも応用することができる。すなわち実施例
５では、ＴおよびDHTとの担体の結合部位を変
えているが、この場合にも、実質的に同様な結果
が得られる。この例では、ＴおよびDHTをふた
たびモデル抗原として使用し、それらと担体との
結合部位を３位から15位に変え、これによつて、
担体分子の表面に露出するハプテンの構造を変え
ている。 実施例 ５ 15β−カルボキシエチルメルカプトテストステ
ロン（以下15β−CEM−Ｔと略す）及び15β−カ
ルボキシエチルメルカプト−5α−ジヒドロテス
トステロン（以下15β−CEM−5α−DHTと略す）
とKLHまたはＤ−GLとの結合物を用いて得られ
る抗血清の性質について 15β−CEM−ＴはRao、P.N and P.H.Moore
Jr：ステロイド28（1976）P101、15β−CEN−
5α−DHTはRao.P.N.、A.H.Khan and P.H.
Moore.Jr：ステロイド29（1977）P.17に夫々記
載の方法によつて合成したものを使用した。15β
−CEM−ＴとＤ−GL又はKLHとの結合方法お
よび15β−CEM−5α−DHTとＤ−GL又はKLH
との結合はそれぞれ前記DHT−３−CMOまたＴ
−３−COMとＤ−GL又はKLHとの結合と同様
の方法で行つた。夫々得られた結合物をＴ−15−
Ｄ−GL、Ｔ−15−KLH、DHT−15−Ｄ−GL、
DHT−15−KLHと略する。 本実施例に於いては、C57BL／６系雌マウス
（８−10週）１群７匹を６群用いた。 第２群はDHT−15−Ｄ−GLを500μｇ／１匹初
回免疫３日前にマウスの腹腔内に投与した。 第１群は対照群でDHT−15−Ｄ−GLを含まな
い生理食塩水を同様に投与する。 第３群は別の対照群でＴ−15−Ｄ−GLを500μ
ｇ／１匹を、Ｔ−15−KLHによる初回免疫の３
日前に腹腔内に投与した。 第１、第２、第３群共にＴ−15−KLH（100μ
ｇ／マウス）で初回免疫を行ない、３週間後に第
２回免疫、第２回以後２週間毎に追加免疫を行な
つた。第４、５、６群はDHT−15−KLHで免疫
された。 一方、第５群にはＴ−15−Ｄ−GL500μｇ／１
匹をDHT−15−KLHでの初回免疫３日前に腹腔
内に投与した。第５群と同様に、第４群（対照
群）のマウスにＴ−15−Ｄ−GLに代えて生理食
塩水を投与した。 第６群は別の対照群でDHT−15−Ｄ−GLを
500μｇ／１匹を、DHT−15−KLHによる初回免
疫の３日前に腹腔内に投与した。 以上の如き、６つの群について初回免疫７週後
より、２週間毎に採血し、血清中の抗体価と交叉
反応性とを調べた。抗体価の最も高い初回免疫か
ら第13週後に得られた抗血清での結果は以下の通
りである。 第１、２、３群から得られた抗Ｔ抗血清の性
質。 ³H−T45pｇを50％結合し得る抗血清の希釈倍
数の逆数で表わすと対照群（第１群）の抗体価は
1600〜9000の間にあり、また第２群の抗体価は
1000〜3500の間にある。Ｔ−15−Ｄ−GLを投与
した第３群では抗体産生は認められなかつた。 一方、Abrahamの方法（前述）によつて求め
た場合第１群のマウスの抗血清の、DHTに対す
る交叉反応性は4.1〜8.2％の範囲にあり、DHT−
15−GLで処理した第２群マウス抗血清の交叉反
応性は0.27〜0.94％の範囲にあつた。この数字は
今迄文献に報告された抗テストステロン抗血清の
DHTとの交叉反応性の価よりも良好である。従
つて、本発明による抗血清のDHTとの交叉反応
性は実際に無視することができよう。 従来報告された抗Ｔ抗血清のDHTとの交叉反
応性の最低値は1.81％である。この数値を得るた
めにRao等は15β−CEM−Ｔ−BSAを用いた〔P.
N.Rao and P.H.Moore Jr.ステロイド28
（1976）〕。本実施例でも同じく15β−CEM−Ｔ誘
導体を用いている。本実施例の第１群から得られ
た交叉反応性は、上記の最低値におよそ等しいの
である。 第４、５、６群から得られた抗DHT抗血清の
結果は以下の通りであつた。 ³H−DHT45pｇを50％結合し得る抗血清の希
釈倍数の逆数で表わすと、第４群（対照群）の抗
DHT抗体価は1500〜5600の範囲にある。 Ｔ−15−Ｄ−GLを投与した第５群の対応する
抗体価は1000〜7600の範囲に入る。 DHT−15−Ｄ−GLを投与した第６群では抗体
産生は認められなかつた。 Ｔ−15−Ｄ−GLで処理した第５群のテストス
テロンとの交叉反応性はアブラハム法によると、
6.5〜19.0％の範囲にあつたが、対照群（第４群）
の交叉反応性は48.3〜68.5％の範囲にあつた。 この結果は、Ｔ−15−Ｄ−GL処理（投与）に
よつて有意にテストステロンとの交叉反応性が抑
えられていることを示している。 またDHT−Ｄ−GLを投与した第６群に抗体産
生が認められない理由は、DHT抗体産生能を有
するクローンが、DHT−Ｄ−GLの投与により特
異的に不活性化されたためであると考えられる。 下記の実施例６−９（ペプタイドの例）におい
て用いた試薬および分析法は次の通りである。 (1) ハプテン−Ｄ−GLの合成 ペンタガストリン−Ｄ−GL結合物の作成Liu
らの方法〔バイオケミストリー
（Biochemistry）、第18巻、p690（1979）〕に準
拠して合成した。 (イ) Ｓ−アセチルメルカプト−サクシニル
（acetyl mercapto−succinyl）−Ｄ−GL（以
下Ac−Ｓ−Ｄ−GLと略す）の合成 Ｄ−GL（分子量4.9万）40mg（1.166μmol）
を900μの0.125Mリン酸緩衝液（PH7.2）に
溶解し、1N NaOHでPHを7.2に調整する。
この溶液にＳ−アセチルメルカプトコハク酸
無水物のジメチルホルムアミド（以下DMF
と略す）溶液（酸無水物200mgを１mlのDMF
に溶解する）50μＨ（57.4μmol）を加えて
30分間室温で攪拌する。反応中PHを7.2に保
つた。反応後、反応液をセフアデツクスＧ−
25のカラムに通して0.01M Na₂−EDTAを
含むリン酸緩衝食塩液（PH7.2）で溶出して
反応生成物と未反応の試薬とに分離した。 この反応生成物を含む溶液100μに0.5M
Ｎ−ヒドロキシアミン（PH7.3）水溶液100μ
（50μmol）を加え、37℃で20分間インキ
ユーベートした。エルマン（Ellman）らの
方法〔アーカイツク バイオケミー・バイオ
フイジイーク（Arch.Biochem.Biophys.第82
巻P70（1959）〕によりＤ−GLに導入された
Ｓ−アセチルメルカプト基の数を算出した。
即ち、この反応溶液50μに脱酸素した
0.01Mの〔５，5′−ジチオビス（２−ニトロ
安息香酸）のメタノール溶液〕0.1mlを加え、
PH8.0のトリス緩衝液１ml中で20分間反応さ
せ、次いで412nｍの吸光度を測定する。 Ｄ−GL1分子当りに導入されたＳ−アセチ
ルメルカプト基の数は約15であつた。（以下、
この作成されたアセチルメルカプト−サクシ
ニル−Ｄ−GLをAc−S₁₅−Ｄ−GLと表示す
る）尚回収率は約77％である。Ｄ−GLが
280nｍでの吸収をもたないため、Ｄ−GL誘
導体を含む画分の回収率は吸光度測定により
求められない。 従つてＮ−サクシイミジル−３−（４−ヒ
ドロキシフエニル）プロピオネートとＤ−
GLを反応させ、この反応産物をモニターと
してセフアデツクスＧ−25−カラムに流し、
吸光度（280nｍ）を測定することにより回
収率を求めた。 (ロ) ｍ−マレイミドベンゾイル−ペンタガスト
リン（以下、MB−ペンタガストリンと略
す）の作成 ペンタガストリン11mg（16.1μmol）を
0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）9.5mlに溶解し、
これにｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル（以下、
MBSと略す）25.3mg（80.5μmol、１mlの
DMFに溶かしたもの）を一度に加え攪拌を
する。薄層クロマトグラフ〔展開溶媒シクロ
ヘキサン：酢酸エチル（１：１）、容量比〕
により反応が充分進んでいることを確認の
上、反応開始から25分後に反応液にジクロル
メタン３mlを加え、充分振とうした後、遠心
分離する。 上層の緩衝溶液を別の試験管に移す。下層
のジクロルメタン層に少量のリン酸緩衝液を
加え振とうし、遠心分離後、上層を先の溶液
に加える。 MBS−ペンタガストリンを含む緩衝液部
からほぼ完全に未反応のMBSが除かれたこ
とを薄層クロマトグラフにより確認した。 一方、窒素気流により脱酸素された２−メ
ルカプトエタノール水溶液20μ（70n mol）
に、上記のMBS−ペンタガストリンを含む
緩衝液20μを加え、室温で20分間反応させ
た後、エマン法により消費された２−メルカ
プトエタノールのモル数を求めた。このモル
数がペンタガストリンに導入されたマレイミ
ドベンゾイル基に相当する。ペンタガストリ
ン１分子当りに導入されたマレイミドベンゾ
イル基（M.B）は0.9であつた。（以下この化
合物をMB_0.9−ペンタガストリンと表示す
る。） (ハ) ペンタガストリン−Ｄ−GL結合物の作成
前記(イ)項で調製したAc−S₁₅−Ｄ−GL溶液
と(ロ)項で調製したMB_0.9−ペンタガストリン
溶液を混合し、次の通り反応させた。窒素気
流下で充分脱酸素後、5Mヒドロキシルアミ
ン水溶液（PH7.3）500μを混合物に加え、
室温で攪拌をつづけた。１時間後、反応液の
一部分をとり、エルマン法によりチエツクし
たところ、未反応SH基は存在しなかつた。 このことは、MB−ペンタガストリンと反
応しなかつたSH基が存在していないこと、
すなわちＤ−GL上のすべてのSH基は、MB
−ペンタガストリンと反応したことを意味す
る。 ヒドロキシルアミン水溶液を加えてから２
時間後に２メルカプトエタノール（最終濃度
１ｍＭ）を加え、さらに20分攪拌した。 この反応液を透析膜（セロフアン膜）を用
いて0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）にて約24
時間透析した。（透析後得られた溶液を直接
もしくは希釈して使用した。） この様にして作成されたペンタガストリン
−Ｄ−GL結合物のＤ−GLに対するペンタガ
ストリンのモル比は15：１であつた。（以下
ペンタガストリン₁₅−Ｄ−GLと表示する。） (2) CCK−８−Ｐ−キーホールリンペント ヘ
モシアニン（CCK−８−Ｐ−KLHと以下略称
する）の作成 (イ) Ｓ−アセチル−メルカプトサクシニル−
KLH（以下Ac−Ｓ−KLHと略称する）の作
成は、前記(1)(イ)項記載のAc−Ｓ−Ｄ−GLの
作成と同様に行なつた。 合成に先立つて、KLH70mgを1.4mlの１％
K₂CO₃溶液に溶解し、0.125Mリン酸緩衝液
（PH7.2）で透析した。この溶液の280nｍでの
吸光度を測定することにより、KLHの量を
算出した。 このKLH溶液0.7ml（KLHとして26.0mg、
分子量を約10万とすると、260n molに相当
する。溶液のPHは7.2である。）に、Ｓ−アセ
チルメルカプトサクシニツクアンハイドライ
ド6.5μmolを加え、(1)(イ)項と同様の操作で合
成した。KLH1分子に対して結合したＳ−ア
セチルメルカプト基の数は6.8であつた。（以
下アセチル−S_6.8−KLHと表示する。） (ロ) ｍ−マレイミドベンゾイル−CCK−８−
Ｐ（以下MB−CCK−８−Ｐと略称する。） MB−ペンタガストリンの作成と同様の方
法で作成した。 フラグメント縮合法により合成した0.42mg
（385n mol）のCCK−８−Ｐを0.2Mリン酸
緩衝液0.5mlに溶解し、600μｇ（1.9μmol）の
MBSと反応させた。反応には1.2mgのMBS
を100μのDMFに溶解したMBS溶液50μ
を用いた。 得られた生成物のCCK−８−Ｐ：MBの比
は１：1.0であつた。（以下MB_1.0−CCK−８
−Ｐと表示する。） (ハ) CCK−８−Ｐ−KLH 上記(2)(イ)項で得られたアセチル−S_6.8−
KLH溶液2.3ml（75.9r mol）と上記(2)(ロ)項
で得られたMB_1.0−CCK−８−Ｐ溶液を混合
し、0.5M NH₂OH0.3c.c.（0.15ｍmol）を加
え、(1)(ハ)項同様の操作をくり返した。 得られたCCK−８−ＰとKLHの比は約
５：１であつた。 (3) CCK−８−Ｐ−牛血清アルブミン（Bovine
serum albumin）（以下CCK−８−Ｐ−BSAと
略称する） (イ) Ｓ−アセチルメルカプトサクシニル−
BSAの作成 BSA25mg（351n mol）とＳ−アセチルメ
ルカプトサクシニツクアンハイドライド1.5
mg（8.8μmol）を用いて(1)(イ)項と同様の操作
を行ない合成した。 BSA：Ｓ−アセチルメルカプト基の比は
7.6：１であつた。 (ロ) MB−CCK−８−Ｐの作成 CCK−８−P0.5mg（457n mol）を0.5mlの
0.1Mリン酸緩衝液PH8.0に溶解しこれを700μ
ｇのMBS2.29μmolと反応させた。反応には
MBS1.4mgを100μのDMFに溶かした溶液
50μを用い、(1)(ロ)項と同様の操作で合成し
た。 MB：CCK−８−Ｐの比は1.0：１であつ
た。（以下MB_1.0−CCK−８−Ｐと表示す
る。） (ハ) CCK−８−Ｐ−BSAの作成 前記(3)(イ)項の液1.9ml（84n mol）と(3)(ロ)
項で得られた液を混合し、0.5M
NH₂OH0.35c.c.（175μmol）を加え、(1)(ハ)項
と同様の操作を行なつた。 得られたCCK−８−Ｐ：BSAの比は約
５：１であつた。以下CCK−８−P₅−BSA
と表示する。 (4) ペンタガストリン−BSAの作成 (イ) MB−ペンタガストリンの作成 ペンタガストリン0.5mg（750n mol）を0.5
mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）に溶解し、
これをMBS1.05mg（3.3μmol）と反応させ
た。反応にはMBS2.1mgを100μのDMFに
溶かした溶液50μを用い、前記(2)(ロ)項同様
の操作を行なつた。 MB：ペンタガストリンの比は1.0：１で
あつた。 以下MB_1.0−ペンタガストリンと表示す
る。 (ロ) ペンタガストリン−BSAの作成 (3)(イ)項同様にして得られた溶液2.54ml
（112n mol）と(4)(イ)の液を混合し、0.5M
NH₂OHの0.4c.c.（200μmol）を加え、(1)(ハ)項
と同様の操作を行なつた。 得られたペンタガストリン−BSAのペン
タガストリン：BSAの比は５：１であつた。
以下ペンタガストリン₅−BSAと表示する。 (5) 前記(1)項において、分子量34300のＤ−GLに
代えて分子量11.5万のＤ−GLを用いて、(1)項
と同様の反応量にて操作を行なつて、ペンタガ
ストリン₃₃−Ｄ−GLを得た。このものの分子
表面上でのＤ−GLに係合された抗原決定基
（ペンタガストリン）の密度は同様であつた。 実施例 ６ (イ) 免疫スケジユールと血清採取 各グループ６匹ずつの（C57BL／6J×
DBA／２）F₁マウスを免疫した。 全群の各マウスを各10μｇのCCK−８−Ｐ−
KLH（各0.2mlの完全フロインドアジユバント
エマルジヨン）で免疫し、３週間後、各10μｇ
のCCK−８−Ｐ−KLH（各0.2mlの不完全アジ
ユバントエマルジヨン）でさらに免疫した。 第２回免疫の２週間後、各10μｇのCCK−８
−Ｐ−KLHを水酸化アルミニウムゲル（アル
ミニユウム２mg）に吸着させたもので、追加免
疫した。 追加免疫の２週間後および４週間後、各10μ
ｇのCCK−８−Ｐ−KLHを含む0.2ml生理食塩
水でさらに免疫した。 免疫は全て腹腔内投与でおこなつた。第２群
の全マウスに、初回免疫の３日前に各マウス当
り300μｇのペンタガストリン₁₅−Ｄ−GLを含
む0.5c.c.の生理食塩水を腹腔内投与した。第１
群（コントロール）の各マウスに生理的食塩水
0.5ml（ペンタガストリン₁₅−Ｄ−GLを含まず）
のみを投与した。 第３群のマウスは、２回目の免疫の３日前
と、３回目の免疫の３日前に、各300μｇのペ
ンタガストリン₁₅−Ｄ−GLを含む0.5c.c.の生理
食塩水溶液を腹腔内投与した。 各免疫個体からの血清の採取は後眼窩静脈叢
より行なつた。 (ロ) 抗体力価の測定 抗体力価の測定は、ラジオイムノアツセイ
法により行なつた。 固相ラジオイムノアツセイ用ポリビニール
丸底マイクロプレートの各ウエルに抗原
（CCK−８−Ｐ−BSAまたはペンタガストリ
ン−BSA）10μｇ／mlを含有する0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.2で0.15MのNaClを含む）を、
10μずつ加え、室温で２時間インキユベー
トすることにより、該抗原をポリビニール板
の表面に結合させる。この後、各ウエルの溶
液を捨て、ウエルを水道水で４回充分洗い落
とす。その後、水分を充分切つて、１％
BSAを含む生理食塩水200μを各ウエルに
加え４℃で一夜放置することによつて、ポリ
ビニールの蛋白結合能をBSAで完成にマス
クした。 その後、各ウエルの溶液を捨てウエルを水
道水で４回充分洗い流し、水分を充分切つ
て、次いでイムノアツセイに用いた。 各抗血清を１％BSA−PBSで希釈して、
その0.1mlを上記のプレートのウエルに加え
る。４℃で一夜放置後、水道水で３回充分洗
い流し、2M NaCl−PBSで６回洗浄し、最
後に水道水で洗い、充分水を切る。 ¹²⁵Iで
ラベルした免疫吸着剤を用いて特異精製した
ウサギ抗マウスIgG抗体を１％BSA−PBSで
希釈後0.1mlを各ウエルに加え、一夜放置し
た。この操作によりポリビニール上の抗原と
反応する抗体があればこれと結合し、この抗
体は ¹²⁵I−ウサギ抗マウスIgG抗体の結合度
によつて知ることができる。各ウエルのアイ
ソトープ溶液をピペツトで取り除き、水で各
ウエルを充分洗つた後、各ウエルを熱ニクロ
ム線にて切り離し、各ウエルの放射活性を測
定した。 (ハ) 結果 各採血時の各グループごとにプール血清の
抗体量を測定し、抗体量のもつとも高かつた
第１回免疫後11週目の抗体について、さらに
測定した。 得られた結果は第１図の如くである。標準
血清として用いたのはグループ１の第１回免
疫後７週目のプール抗血清であつた。第11週
後に各マウスから得られたサンプル中の抗体
量を、標準抗血清に含まれた抗体量を１とし
て、比率で現わした。 標準として用いられたプール抗血清は、次
の様な力価をもつものであつた。 下記のCCK−８−Ｐを用いた液相ラジオ
イムノアツセイ系において600倍希釈のこの
プール抗血清はコレシストキニン（CCK−
33）の0.0015p molを結合することができ
た。 ペンタガストリン₁₅−Ｄ−GLを投与しな
かつたマウスより得た抗体（第１群、図１で
は○印で表わす）はCCK−８−Ｐに反応す
る程度とほとんど同じ程度にペンタガストリ
ンと交叉反応性を示した。ペンタガストリン
₁₅−Ｄ−GLを投与したマウスより得た抗体
（第２および第３群。図１では、それぞれ▲
印および●印で表わす）のペンタガストリン
と交叉反応する抗体の力価が非常に低いこと
が判つた。 特にペンタガストリン₁₅−Ｄ−GLを初回
免疫後（２回目の免疫３日前と３回目の免疫
の３日前）に投与したグループ３のマウスか
ら得た抗体のペンタガストリンとの交叉反応
性は著しく低くかつた。 以上の結果から、本発明により、CCK−
８−Ｐに特異的なアミノ酸配列に対して即
ち、

【式】に対して特異的な抗 体が得られたことが分つた。 実施例 ７ CCK−８とペンタガストリンとが共存する液
相イムノアツセイ系を用いて、上記方法で得られ
た抗体の交叉反応性を次の通り測定した。 Bolton−Hunter試薬を用いて ¹²⁵IでCCK−８
−Ｐをラベルした〔（H.Sankaraら、J.Biol.
Chem.、第254巻、9349〜9351頁、1979年）、以下
このラベルした化合物を ¹²⁵I−BH−CCK−８と
略す。〕。各小試験管に0.02Mリン酸緩衝液（PH
8.0、0.1％ゲラチンを含む）各50μで溶解した
種々の量の非ラベルCCK−８−Ｐを加えてCCK
−８−Ｐの標準曲線作成用系列を作り、別の系で
は、各試験管に種々の量のペンタガストリンを含
む緩衝液各50μを加えてペンタガストリン標準
曲線作成用系列をつくつた。それぞれの場合通常
のマウス血清で希釈した抗血清50ｍμを試験管
に加え、さらに ¹²⁵I−BH−CCK−８（約
5000cpm）を含有する同じリン酸緩衝液50μを
加え、試験管をボルテツクス・ミキサーで振とう
混和し、次に４℃に24時間保つた後、同じリン酸
緩衝液で希釈（１：２）したウサギの抗マウス
IgG Fab抗体50μを試験管に加え、混和し、４
℃に24時間保つた。 その後3000rpmで試験液を25分間遠心分離し
た。上清をアスピレーターで吸い取り、沈澱物の
放射活性をカウンターで測定した。CCK−８−
Ｐ標準液およびペンタガストリン標準液のかわり
に同じりん酸緩衝液を用いて全 ¹²⁵I−BH−CCK
−８の放射活性（カウント、Boを100として）を
測定し、種々の濃度のCCK−８−Ｐ或はペンタ
ガストリン存在下に抗体と ¹²⁵I−BH−CCK−８
との結合率（Ｂ／Bo％）を算出した。 ¹²⁵I−BH−CCK−８と抗体との結合を50％阻
害するのに必要な種々のペプタイドのモル量は次
の通りであつた。 グループ１では、CCK−８は1.1p molでペン
タガストリンは20.1pmolであつた。従つて
Abrahamの方法で算出した交叉反応性は5.5％
（1.1／20.1×100）であつた。 ペンタガストリン₁₅−Ｄ−GLを初免疫前に投
与したグループ２では、交叉反応性は2.7％（4p
mol／150p mol×100）であつた。ペンタガスペ
ンタガストリンとの交叉反応性は認められなかつ
た。すなわち上記抗体を用いた場合50％阻止に必
要なCCK−８−Ｐは1.7p molであつたが、
10000p molのペンタガストリンを用いても阻止
は認められなかつた。ペンタガストリンはグルー
プ３のマウスで産生された抗体と実際に反応する
ことができなかつた。 ウスで産生された抗体と実際に反応することが
できなかつた。 上記の結果より、ペンタガストリン₁₅−Ｄ−
GLの投与によつて得られたグループ３のマウス
の抗体を使う場合、共存するペンタガストリンの
有意な影響を受けないで、サンプル中CCK−８
−Ｐを特異的に測定することが出来ることがわか
つた。 実施例 ８ 実施例６において用いたマウスに代えて家兎を
用いて同様の免疫操作を行なつた。但し、100μ
ｇのCCK−８−Ｐ−KLMを含む完全または不完
全フロインドアジユバントエマルジヨンと10mgの
ペンタガストリン₁₅−Ｄ−GLを含む生理食塩水
10mlを用いた。得られた結果はマウス使用の場合
とおよそ同様であつた。 実施例 ９ 実施例６において用いたペンタガストリン₁₅−
Ｄ−GLに代えて、分子量115000のペンタガスト
リン₃₃−Ｄ−GLを用いる他は、同様の操作を行
なつて、実施例６とおよそ同様の結果が得られ
た。 実施例 10 抗CCK−８−Ｐ特異抗体産生能を有するク
ローンの産生。 (イ) 作成法 実施例６(A)記載の方法により免疫され第１群
（対照群）と第３群（ペンタガストリンＤ−GL
処理群）のマウスからそれぞれ2X10⁸個の脾細
胞を取り出した。それぞれを2X10⁷個の骨髄腫
細胞P3−X63−Ag80−U1（P3−U1）とポリエ
チレングリコール4000中で常法により融合し
た。細胞塊をPEG4000（９ｇ）とHANKS（20
ml）との混合液（PEG溶液という）で解きほ
ぐして細胞懸濁液を作つた。細胞懸濁液を室温
で８分間静置し、次にMEM（15ml）を５分間
かけて加えた後、MEMを加えて全量を50mlと
した。懸濁液から細胞を取り出し、50mlの10％
FCS−RPM1中で処理し、１ml／穴の培養プレ
ートを用いて37℃で１夜培養した。85−95％の
湿度の空気中に７％のCO₂を含む培養器を用い
た。次の２日間、毎朝HAT培地（１ml）を吸
出し、新鮮なHAT培地（１ml）と交換した。
次の２週間、同様な交換を３日おきに行なつ
た。その後、培養物を取り出し、実施例6B記
載の固相ラジオイムノアツセイ法で抗体の産生
を調べた。抗体産生が認められた融合細胞を限
界希釈法（10％FCS−RMPI使用）によりクロ
ーニングした。こうして得られたクローンによ
り産生された抗体の特異性を実施例6B記載の
相ラジオイムノアツセイ法で調べた。 (ロ) 結果 第１群（対照群）のマウスの脾細胞を用いる
ことにより18個の抗CCK−８−Ｐ特異抗体産
生能を有するクローンが得られた。これらの得
られたすべてのクローンはCCK−８−Ｐとペ
ンタガストリンとの両者に反応した。従つて、
CCK−８−Ｐのペンタガストリン部分に特異
的なモノクローナル抗体が得られたことが認め
られた。他方において、第３群の脾細胞を用い
ることにより、15個の抗CCK−８−Ｐ特異抗
体産生能を有するクローンが得られた。これら
の15個のクローンのうち、12個の産生した抗
CCK−８−Ｐ特異抗体はペンタガストリンお
よび関連するペプチドと反応せず、CCK−８
−Ｐに特異的であつた。しかし、残りの３個の
クローンによつて産生された抗体はペンタガス
トリンとの交叉反応性を有した。従つて、本発
明によるペンタガストリン−Ｄ−GLで処理さ
れたマウスの脾細胞を用いることにより、常法
で処理された脾細胞を用いるよりも、もつと多
数の、所望の、抗CCK−８−Ｐ特異抗体産生
能を有するクローンが得られる。得られた
CCK−８−Ｐ特異抗体はペンタガストリンと
の交叉反応性を示さなかつた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明による抗体が低交叉性であること
を示す図で、横軸はペンタガストリンと反応する
抗体量を表わし、横軸はCCK−８−Ｐと反応す
る抗体量を表わす。○印は、ペンタガストリン₁₅
−Ｄ−GLを投与しなかつたマウス（第１群）よ
り得た抗体を表わす。▲印は、初回免疫前にペン
タガストリン₁₅−Ｄ−GLを投与したマウス（第
２群）より得た抗体を表わす。●印は、初回免疫
後にペンタガストリン₁₅−Ｄ−GLを投与したマ
ウス（第３群）より得た抗体を表わす。それぞれ
の単位はグループ１のマウスの初回免疫後７週後
のプール血清中に含まれるそれぞれの抗体量を便
宜的に1.0とした時の抗体含量の比率を表わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 所望の抗原決定基をもつ第１抗原に対して当
   該抗原決定基以外の部分で構造的に類似する一つ
   以上の抗原決定基をもつ第２抗原と共有結合され
   たＤ−グルタミン酸とＤ−リジンとの重合体を哺
   乳動物に投与し、これによつて、上記第２抗原に
   対する効果的な免疫無応答性を上記哺乳動物に誘
   起した後に、上記哺乳動物を第１抗原で免疫し、
   所望の抗体産生能をもつ細胞を生成し、上記細胞
   を上記哺乳動物から分離し、これを培養する方法
   によつて得られた、上記第１抗原に対する高い特
   異性と上記第２抗原に対する低い交叉性とを有す
   る抗体を産生する能力をもつクローン。