JPS58991A - 糖蛋白質の抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト尿中に存在する２種類の抗腫瘍性物質の
抽出と精製およびそれらについての抽出および精製法に
関するものである。更に詳細には、本発明は、合成ケイ
酸マグネシウムゲルへの吸着とそれに続く溶出操作によ
ってヒト尿より抽出可能な２種類の抗腫瘍性画分、すな
わち低分子投プチドと高分子蛋白質に関するものである
。

通例、本発明によれば、ヒト尿を合成ケイ酸マグネシウ
ムの吸着剤層を通過させると、投プチド画分および蛋白
質画分の両両分は数種の未同定物質とともに吸着される
。その後、吸着剤層を残留銀を除去するため冷蒸留水で
洗浄する。所望する各抗腫瘍性画分、すなわちペプチド
゛および蛋白質画分はケイ酸マグネシウムより遂次溶出
される。

低分子投プチビ両分を微アルカリ性の水性アセトンを用
いて最初に溶出し、ついで高分子蛋白質画分を微アルカ
リ性の水、アセトンおよびグリセリン混液な用いて溶出
する。低分子ペプチド両分は、アセトンを除くため真空
中で濃縮し、その後残渣のペプチド水溶液をさらに限外
ｒ過により精製する。蛋白質画分はアセトンおよびグリ
セリンを除（べく透析後、限外ｆ過およびゲル１過法に
よって精製する。

本発明の目的は、ヒト尿より抽出可能かつ著明な抗腫瘍
活性作用を有する物質を提供することである。本発明の
別の目的はヒト尿より顕著な抗腫瘍活性を有する物質の
抽出法を提供することである。本発明のその他の様々な
目的および利点は下記の記載から明らかとなる。

抗腫瘍性ペプチドがヒト尿中に存在することについては
、プルチンスキー等の一連の報告（Ｐｈｙｓｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　、　５巻４３６頁（１９７３
年）；６巻４５７頁（１９７４年）；８巻１３頁（１９
７６’年）；８巻２７５頁（１９７６年）〕に開示され
ている。これらの投プチドは、種々のヒト腫瘍細胞系に
対し抗腫瘍作用を示すが正常細胞の生長は妨げない。こ
の尿ベプチ白ま尿の８０％エタノール抽出物を、自由流
動電気泳動、投−パークロマトグラフィーおよび最後に
分取薄層クロマトグラフィーによってｆｌｖ製する。

フロリジン社（−”ンシルバニア州ピッツバーグ所在）
によって製造された合成ケイ酸マグネシウムであるフロ
リシルは、スローアンが米国特許第３．７１１，３７７
号明細書（１９７３年１月１６日発行）および第３，８
８４，７６４号明細書（１９７５年５月２０日発行）に
開示した様に、ヒト尿中の生物活性物質の吸着剤として
使用されている。両特詳明細書にはヒト尿から線維素溶
解蛋白質酵素のフロリシルへの吸着法および本蛋白質酵
素のフロリシルよりの溶出法が開示されている。

本発明によれば、抗腫瘍性ペプチドおよび抗腫瘍性蛋白
質の両画分は、ヒト尿からフロリシルのような吸着剤に
吸着される。これら抗腫瘍性画分の各々は、フロリシル
より別々に溶出される。抗腫瘍性はプチドは微アルカリ
性の水性アセトンで最初に溶出され、ついで抗腫瘍性蛋
白質は、微アルカリ性のアセトン−グリセリン−水混液
で溶出される。ヒト尿由来の各抗腫瘍性画分は、ヒト正
常複相細胞に対しては無作用でありながらヒト腫瘍細胞
の生長を抑制する。さらには、当該蛋白質画分は、ヌー
ド９マウスに移植したある種のヒト腫瘍細胞の生長をも
抑制する。

ヒト尿より抽出、精製【また抗腫瘍性にプチドの化学的
、生物学的性状は以下に示すとうりである：（１）当該
はプチドの分子量はアミコンダイアフロー膜を使用した
限外ｆ適法で求めると約６００である。

（２）当該ペプチドは９０℃１０分間の熱処理に対し安
定である。

（３）当該ペプチドの抗腫瘍活性は、乾燥画分を無水メ
チルアルコール或は無水エチルアルコールで処理すると
ほぼ完全に失れる。これらどちらか−方のアルコール処
理後の、乾燥画分は抗腫瘍性薬としては本質的に作用し
ない。

（４）抗肺瘍活性ペプチド画分ｙｎ−ブチルアルコール
：酢酸：ピリジン：水（３０：６：２０：２４）の展開
溶媒系でペーパークロマトグラフィーな行うときのＲｆ
値は０．４〜０６０間である。

（５）　　抗腫瘍活性はプチド画分は、以下のヒト腫瘍
細胞系に対し抗腫瘍活性を示す：即ち乳がん、黒色肺肝
がん、膀胱がんおよび肺がん。これらに対する抗腫瘍活
性は、試験管内での組織培養法を用いて評価される。

抽出精製した抗腫瘍性尿（ＡＮＵ）蛋白質の化学的、生
物学的性状は以下に示すようである；（１）当該ＡＮＵ
−蛋白質の分子前は２０．０００−４０．０００ダルト
ンの間である。

（２）　　ＡＮＵ−蛋白質は糖質を含有し、９０℃２０
分間の熱処理に対し安定、水飽和のフェノールに可溶か
つ４℃４８時間のＰＨ２といった酸性条件においても安
定といった性質を有する。

（３）　ＡＮＵ−蛋白質画分は、以下の腫瘍細胞系の生
長を抑制する：即ち乳がん、黒色腫、膀胱がん、子宮頚
部がんおよび肺がん。− （４）　　ＡＮＵ−蛋白質は、ヒト複相細胞系に対して
は無毒性である。

（５）　　ＡＮＵ−蛋白演は、マウス腫瘍細胞系および
マウス正常細胞系に対しても無作用であるから、ヒト腫
瘍細胞系に対し特異的な抗腫傷薬である。

（６）　　ＡＮＵ−蛋白質は、ヒト腫瘍細胞系、例えば
ヌードマウスに移植した５ＥＰ−２ヒト肺がん細胞系の
生育を抑制しかつ退行させる。

（７）ＡＮＵ−蛋白質は、ヒト肺細胞系ＷＩ−３８に転
仇したヒト膵がん細胞系のＰＡＮＣ／３或はＳＶ４０’
（ｆｆ抑制しない。

（３）　　ＡＮＵ−蛋白質には、抗ウィルス作用はない
。

本発明の一実施態様において、吸着剤として使用する１
５−３０メツシユおよび３０−６０メツシユ、０２種類
のフロリシルは浮選法で微細なフロリシルを除去し、か
つ使用前、室温で数時間ＰＨ３’−４の希アスコルビン
酸液に懸濁し調整する。

ヒト排泄音を大量に集めるが、この場合、ホウ酸の結晶
およびバラ−ヒドロキシ安息香酸ブチルエステルを細菌
の繁殖防止の目的で収集容器中へ加える。集収した約１
リツトルの尿は、フロリシルを入れたシャーシー地の二
段重ねの袋を室温にて通過させる。このとき上段には１
５−３０メツシユの７０リシル約０．５ポンド、下段に
はろ０−６０メツ７ユの７０リシル約０．５ポンドを入
れておく。

メツ７ユの異るフロリシルを別々に用いるのは目詰りを
防止するためである。スローアンが米国特許第３，７７
１，３７７号明細書に開示したように、ヒト排泄尿がそ
の場で蓄尿瓶で集収され、そして、フロリシル顆粒がト
レー上にのせられている場合、パラ−ヒト９０キシ安息
香酸ブチルエステルと共にホウ酸粒を詰めたシャーシー
地の袋を前述した７０リシルを含有する２個の袋の上方
に配置する。

尿をフロリシルと十分に接触させて目的物質を吸着させ
た後、当該７０リシルを約３リツトルの冷蒸留水（４℃
）で洗浄する。以下の溶出および精製の全操作は約２−
４℃の温度で実施する。

抗腫瘍性ペプチド画分は、ＰＨ９−９，５で約１．５　
Ｄ。

ミリリットルの冷却した水性アセト／（１５％）で溶出
する。この溶出画分は１．冷却した２規定塩酸でＰＨを
７−７５に調整後、真空下でアセトンを除去し濃縮する
。この濃縮液を分子量約１，０００以上の物質を捕捉す
乞アミコングイアフロ−ＵＭ２Ｍ１！。

ついで分子量約６００以上の物′１を捕捉するアミコン
ダイアフローＵＭＱ５膜を用いて限外ｆ過し精製する。

当該、ｆ過処理した画分はさらに標準的なバー　／ξミ
ークロマトグラフィー精製する。

最初にペプチド画分を溶出後、抗腫瘍性蛋白質画分はフ
ロリシルよりＰＨ９−９，５に調整した３０％グーリセ
ロールを含む水性アセトン（１５％）で浴出する。溶出
した蛋白質画分は２規定塩酸でＰＨ７−７，５に調整後
、分子、量約２ｏ、ｏｏｏ以上の物質を捕捉するアミコ
ンダイアフロー〇Ｍ２［］膜を用いた限外ｆ’過によっ
て濃縮する。所望する抗腫瘍性蛋白質は当該膜を通過し
ない。ここに得た蛋白質溶液を水に対して透析した後、
凍結乾燥する。凍結乾燥した蛋白質は、さらに０．１モ
ルリン酸緩衝液で中性に緩衝化した七フアクリルＳ−２
００でのクロマトグラフイーで精製する。精製抗腫瘍性
蛋白質の収量は尿１リットル当り約３００ｕ、９であり
かつ濃度は尿中まり約５００倍に濃縮された。精製ＡＮ
Ｕ−蛋白質は培養ｆｉ　１　ミＩＪ　ＩＪットル当り１
ｕ、？蛋白質以下でも抗腫瘍性を発現する。

ヌードマウスでの実験は以下の如〈実施した；４週令か
ら６週令のＮＩＨ無胸腺（ｎｕ／ｎｕ　）　マウスにヒ
トがん細胞系ＨＥＰ２をマウス当り１０７個の細胞を皮
下に移植する。移植４日後、マウスを数群に分割し、溶
解した１ｕ９の精製或は粗ＡＮＵ−蛋白質を３日に１度
の割合で皮下投与する。対照には１０％胎仔牛血清を含
む０．１　ミＩＪ　ＩＪットルの溶媒を投与する。腫瘍
の生長は６−４週にわたり観察する。本実験の終了時、
腫瘍の体積を測定後、組織学的に検討した。各群は最低
８匹のマウスを使用した。さらに腫瘍を移植せず溶媒に
溶解したＡＮＬＩ−蛋白質のみを投与したものについて
も対照群として追加した。粗ＡＮＵ−蛋白質投与では、
有意な腫瘍体積の萎縮（平均４．１ｍ３から１．８ＣＩ
１１３へ）が認められた。半精製ＡＮＵ−蛋白質の投与
では８例中４例に腫瘍の全搬的な退行現象が、また残り
の動物には腫瘍サイズの有意な退縮が認められた。

試験管内での抗腫瘍活性の試験は以下の如〈実施した； 試験する各細胞系の細胞約１０５個Ｙ５ミ’Ｊ’Ｊノト
ルの培養液とともに細胞培養フラスコ（ファルコンａ３
０１５フラスコ、面積２５ｃｍｒＩＬ２）に接種した；
さらに当該蛋白質画分はリン酸塩で緩衝化した生理食塩
水に溶解し培養液中の細胞へ加えた。培養は５％炭酸ガ
ス気流下３７°Ｃにて９６−１４４時間実施した；対照
のフラスコは緩衝′ｒｊ、（７）みを加えた。

本試験期間の終了時、細胞をＥＤＴＡ−）　＋７プシ／
液（ギブコ社製）で処理しフラスコより剥離し計数した
。

ＡＮＵ−蛋白質はヒト乳がん、黒色腫、膀胱がん、子宮
頚部がんおよび肺がん細胞系の生長を抑制した。

以上、本発明の好ましい実施態様について記載したが、
本発明はここで記載した開示内容のみによって限定され
るものではなく、むしろ、添付した特許請求の範囲で規
定されるような本発明の精神および範囲内に営まれる全
ての変法および変型もその対象となることが認識される
べきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量が約２０，０００〜４０，０００ダルトンで
   あり抗腫瘍活性を示す糖蛋白質を含む糖蛋白質画分を該
   糖蛋白質画分含有ヒト尿より抽出する方法であって、該
   方法は、ヒト尿をケイ酸マグネシウム吸着剤と接触させ
   、前記吸着剤に吸着されなかった尿を洗浄除去し、そし
   て前記糖蛋白質画分を水性ア、七トンとグリセリンの混
   液で前記吸着剤から溶出することからなることを特徴と
   する前記抽出方法。 ２、上記吸着剤から前記未吸着尿を特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 ３、抗腫瘍ペプチド画分を上記糖蛋白質画分に先んじて
   上記吸着剤より溶出する特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。 ４、上記ペプチド画分を水性アセトンで溶出する特許請
   求の範囲第６項に記載の方法。 ５、上記ペプチド画分をＰＨ約８．５〜９５で約１５％
   の水性アセトンを用いて溶出、する特許請求の範囲第６
   項に記載の方法。 ６、上記糖蛋白質画分ｉＰＨ約８．５〜９５で、グリセ
   ロールを約６０％含有する約１５％の水性アセトンを用
   いて溶出する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７　上記吸着剤は、約１５〜６０メツシユの粒径な有す
   る顆粒よりなることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ８、上記糖蛋白質の溶出画分を限外ｆ適法を用いて潤製
   および濃縮することからなる特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ９、該画分なさらに蒸留水に対し更に透析することから
   なる特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０、該糖蛋白質画分をさらに凍結乾燥することからな
   る特許請求の範囲第９項に記載の方法。 １１、上記シリカゲルにヒト尿をほぼ室温において接触
   させる特許請求の範囲第１項に゛記載の方法。 １２、上記糖蛋白質画分を温度約２〜４℃において溶出
   する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １３　　ヒト尿をケイ酸マグネシウムと接触させ、未吸
   着尿を前記吸着剤より洗浄除去し、水性アセトンとグリ
   セリン混液を用い該吸着剤より溶出することによってヒ
   ト尿から抽出される、ヒト腫瘍細胞系に対して抗腫瘍活
   性を示す分子量約２０，０００ダルトン〜約４０，００
   ０ダルトンの糖蛋白質。