JPS5899497A - 新規なオリゴ糖、その製造法及びビフイドバクテリウム菌の増殖促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ビフィドバクテリウム菌の増殖促進活性を有
する新規なオリゴ糖及びその製造法に関する。

ビフィドバクテリウム菌（以下ビフィズス菌と称する）
は人間の腸内ｄ生育する有用菌であって、それが人間に
及ぼす生理学的及び栄養学的な各棟の有効作用が報告さ
れている。例えば、腸内腐敗の抑制作用、（タミンＢｌ
及びＢ２の合成作用、更にはタンパク實代−に対する作
用等が知られている０ したがって、人間の体内におけるビフィズス菌の増殖を
促進することが上述したごとき作用を向上させるうえで
３１景となる。

従来、ビフィズス菌の増殖を促進する物質（以下ビフィ
ズス増殖因子と称する）については、古くから多くの研
究がなされており１その増殖因子としてＮ−アセチルグ
ルコサミン、人参エキス。

ラクチュロース等が報告されている。しかしこれらのビ
フィズス増殖因子はｉｎ　ＶｉｔｒＯでは効果がみられ
るも、　　ｉｎ　ｖｉｖｏでの効果については未確昭で
あるか又は極めて不十分な結来しか得られていない。

なお、近年ビフィズス増殖因子としてオリゴ糖が注目さ
れてきており、乳糖又は乳糖含有管にアスペルギルス・
オリゼの生産したβ−ガラクトシターゼを作用させるこ
とにより得られる、一般式ａａｔ　−（ａａｔ　）ｎ−
Ｇｔｃ　（式中Ｇａｔはガラクトース残基、ｅｔｃはグ
ルコース残基、ｎは１〜４の整数を表わす）で示される
オリゴ楯をビフィズス増殖因子として用いることが提案
されている（籍開昭５５−１０４８８５号）。

本発明者は、ビフィズス増殖因子゛としてのオリゴ糖の
作用について検討した結果、下記に示す耕現なオリゴ糖
が生体内のビフィズス１に対しても優れた増殖促進作用
を示すことの知見を得て本発明をなすに至った。

したがって、本発明は、ビフィズス増殖因子としての新
規なオリゴ糖及びその製造法を提供することを目的とす
る０以下本発明の詳細な説明するＯ本発明に係るオリゴ
糖は下目す式（１）を有する新規な物質である。

オリゴ楯は乳糖にβ−ガラクトシダーゼを作用させると
舞に起こるガラクトース転移反応（ガラクトシド結合の
転移）によって生成するものであって、現在までのとこ
ろの次のようなオリゴ楯が分離％確緒されているＯ β−Ｇａｔ−（１−）２　）　−Ｇｔｃ　、β−Ｇａｔ
　−（１−ｅ　３　）　−ＧｔＣｒβ−Ｇａｔ　−（１
−＋６　）　−ＧｔＱ　、β−ａａｔ−（１−＋３　）
　−Ｇａｔ、β−Ｇａｔ−（１−ｓ）−〇ａｔ＊　β−
Ｇａｔ−（１−＋６　）−β−Ｇａｔ−（１−＋　４　
）　−Ｇｔａ及びβ−ＧａＡ　−（１−＋６　）−β−
Ｇａｔ−（１−＋６　）　−ｅｔｃ　（式中Ｇａｔはガ
ラクトース、ｅｔｃはグルコースを表わす）等０又前述
したように電近ＧａＡ−（Ｇａｔ）ｎ−Ｇｔｃ　　（式
中ｎは１〜４の整数）で示されるオリゴ糖が報告されて
いる（％開昭５５−１０４８８５号）。

これら公知のオリゴ糖と前記式（１）を有する本発明に
よるオリゴ楯との差異は、前者は全てグルコース或はガ
ラクトースが直鎖状に結合しているのに対して、後者は
上記式（１）にみられるごとく、グルコースに２分子の
ガラクトースが枝分れして結合している点にめる＠すな
わち、本発明によるオリゴ糖はグルコースの４位と６位
の炭素に２分子のガラクトースが結合している点で前掲
の公知オリゴ槍と横這上相−する新規なオリゴ糖と百い
侍る０次に本発明によるオリゴ楯の構造について説明す
る。

（イ）分子量 質量分析針による測定では分子量５０４を示し、その結
果から本オリゴ糖は３分子のヘキソースからなる３楯類
であると推定される。

（ロ）　　　構成糖 本オリゴ糖を、０．５Ｎ−ＨＯｔで１００　℃で４時間
加水分解して得られる生成糖のモル比は、グルコース：
ガラクトース−１：２であるところから、本オリゴ棚は
１分子のグルコースと２分子のガラクトースからなる３
糖類でおることがｓ紹された。

（ハ）構成糖の結合態様 本オリゴＳをｓ　０−ＩＮ　　ＨＯｔで１００　Ｃで２
０分間部分加水分解し、得られる分解混合物を薄層クロ
アトグラフィにより解析したところ、添附の第１図のご
ときパターンを示した。この結果から、本オリゴ楯につ
いてＯ−β−Ｄ−ガラクトシルークトシル−（１→６）
−Ｄ−グルコースの２１１類の２抛類が確認された。

上記（イ）乃至（ハ）の結果から１本発明によるオリゴ
糖は前記式（Ｉ）を有するＱ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−［０−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−（１→６　）　：）−Ｄ−グルコ−ステアルと同定し
得る。

又本オリゴ抛は下記のごとき理化学的性質を示す＾ｌ）
溶剤に対する溶解性： 水に易溶、アセトン、アルコール、クロロホルム、ペン
ゼ／に不溶で、含水アルコールに―浴である。

２）呈色反応ニ アニリン・フタル酸反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰
性である。

３）塩基性、敵性、中性の区別； 中性 ４）色−： 乾燥粉末化し九ものは白色を呈する。

次に、本発明によるオリゴ糖の製造法について説明する
。

本発明の製造法ではまず、乳糖又は乳糖含有物にβ−ガ
ラクトシダーゼを作用させてガラクトース転移反応を行
わせてオリゴ糖の混合物からなる反応混合物を生成する
。ここで出発原料として用いる乳糖は市販のものでよく
、又全乳、脱脂乳、ホエーのごとき乳糖含有物も出発原
料として用い得る。

上記出発物質に作用させるβ−ガラクトシダーゼはその
起源は特に限定する必要がなく、又高度に精製されたも
のでなくてもよく、粗酵素の状態でも使用し得る。

上記乳糖又は乳糖含有物にβ−ガラクトシダーゼを作用
させるには、出発原料物質の乳糖濃度を５〜５０％にし
たものを基質とし、これにＰＨ２〜８、＃へ濃［０，１
〜２００％位／ｄで１０〜６０℃の温度下で酵素を作用
させるのが適当である。

なお、上記酵素を作用させるための反応時間はオリゴ糖
の収量に大きな影譬を及ぼすので、最適反応時間は実験
により確認することが必要である。

すなわち、上記酵素の作用により生成する反応混合物中
のオリゴ糖を高速液体クロマトグラフィにより定量しな
がら、反応時間をＭａ！：する。

上配＃素反応により出発物質にガラクトース転移反応が
起ってオリゴ糖混合物が生成する。

本発明では上記酵素反応が終った時点で反応液を９０℃
以上で２〜３０秒間加熱することにより酵素を失活させ
た後、活性炭に通液して該反応液中の３抛類以上のオリ
ゴ糖のみを吸着させる。

この吸着処理は上記反応混合物中の未反応の乳糖類、分
解により生成した単糖類及び上記転移反応により生成し
た種々のオリゴ糖を除去して目的とするオリゴ糖の濃度
を高めるためのものであるから、上記活性炭への通液に
際しては反応混合物中の３抛類以上のオリゴ糖のみを実
質上吸着するようにコントロールする必要がある。その
ためには活性炭１時に対して上記反応混合物中の３糖類
以上のオリゴ糖が５０〜１００１！の割合になるように
活性炭カラムへの皺反応混合物の通液量をコントロール
する。なお、上記範囲より低い量で通液すると反応混合
物中の２糖類も活性炭に吸着され、一方この範囲より高
い量で通液すると目的とするオリゴ糖の一部が吸着され
ずに溶出するので留意する必要がある。

上記吸着処理に用いる活性炭は通常市販されているもの
でよく、又活性炭にセライトのごときｒ過助剤を混合し
て用いてもよい。また、活性炭は適量の水を加えてスラ
リー状となしたものをカラムに充テンした後、これに十
分量の水を通液して水で平衡化した状態で用いることが
好ましい。

次に、上述のごとくして活性炭に吸着させた３糖類以上
のオリゴ糖を溶出する。この溶出には通常エタノールを
１５乃至５０％の濃度で用いるとよく、これにより目的
とするオリゴ糖が効率よく溶出できる。

このようにして得られる溶出液には本発明の目的とする
オリゴ糖が含有されているが、その他の３糖類以上のオ
リゴ糖も混在しているので、本発明では更に次のような
工程を加えて精製する。

すなわち、上記溶出液を減圧濃縮した液、又は該液を乾
燥（例えば噴霧乾燥）して粉末化したものを温水に溶解
した液に再度β−ガラクトシダーゼを作用させて目的と
するオリゴ糖以外のオリゴ糖を分解する、次いでこのよ
うにして酵素分解して得られる液を再び活性炭カラムへ
通液して目的とするオリゴ糖のみを活性炭に吸着させ、
この吸着オリゴ糖を前記と同様にして溶出して精製され
た本発明のオリゴ糖を得る。

このようにして得られた溶出液は減圧濃縮し、必要に応
じて更に乾燥して粉末化する。

得られる粉末は白色を呈し、約９０％の０−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−（１→４）−（ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−（１→６））−Ｄ−グルコースを含む。

本発明により上述のごとくして得られるオリゴ糖はビフ
ィズス菌に対して下記に示した試験結果にみられるよう
Ｋ、優れた増殖促進効果を示す。

なお、本発明によるオリゴ糖は粉末形態でも又上記濃縮
液の形態でもビフィズス増殖因子として用い得る。

ビフィズス菌に対する増殖試験： 試験方法 １０匹を一部とするカニクイザルを供試動物として用い
、その各々に乳糖を５重量％添加した市販育児用粉乳を
３週間与えた後、本発明によるオリゴ糖（粉末形態）を
５重量％添加した育児用粉乳を更に３週関与え、その開
缶サルの糞便を採取して便中のビフィズス菌の割合を測
定した。なお、比較のために、本発明における第２段階
の活性炭吸着処理とそれに引続いて行われる浴出処理を
施さない、３．ｌｌｉ類以上のオリゴ棚混合物（粉末形
Ｉ＆りを上記と同様にして他の群のサルに与えて糞便中
のビフィズス−の割合を測定した。結果は添付の第２図
のとおりである。纂２図にみられるごとく、乳糖を添加
して与えた期間中の素質中のビフィズス鉋に比しオリゴ
抛混合智及び不発明のオリゴ糖を添加して与えた期間中
の糞質中のビフィズス１の割合は着しく上昇しており、
更に本発明のオリゴ糖を添加して与えたものではオリゴ
槍混合物を与えたものに比しビフィズス−の増殖が明ら
かに向上している。

すなわち、本発明のオリゴ糖は生体内でもビフィズス菌
の増殖細道に極めて優れた効果を奏するものであり、又
人間の腸管内に生育する楡々のビフィズス菌、例えばビ
フィドバクテリウム・プリーへ、ビフィドバクテリウム
・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフ
ィドバクテリウム・アドレスセンチイス、ビフイドバク
テリウム・インファンテイス等の広範囲な種類のビフィ
ズス菌に対して高い増殖活性を示す。

したがって、本発明によるオリゴ糖は粉乳、醗酵孔のご
とき乳製品に配合したり、又整腸剤のごとき薬剤の成分
として添加して用いることができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例 １０ゆの乳糖を１５−の温水に溶解した溶液にクエン酸
を加えてＰＨを４．５に調整したものに、β−ガラクト
シダーゼ４５，０００単位を加えて４０℃で２時間反応
させた。得られた反応混合液を１０５℃で２秒間加熱し
て酵素を失活させた後、直径５０１Ｘ嶌さ４−の活性炭
のカラム（活性炭２５ゆとセライト１２．５ｋｇ混合し
たものを尿でスラリー形態にしたもの）へ２ｋｌｉ＋／
時間の流速で通液した。

この時活性炭１時に対する３糖餉以上のオリゴ糖はｓａ
ｙとなっている。次いで十分量の水を通液して上記反応
混合液中の単糖類と２糖餉を溶出した後、２０％濃度の
エタノールを用いて上記活性炭に吸着されているオリゴ
糖を溶出した。得られた溶出液を減圧濃縮後、噴霧乾燥
して白色の粉末（粗製品）を得た。この粉末には本発明
のオリゴ糖である０−β−Ｄ−ガ２クトピラノシルー（
ｌ→４）−（０−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
６））−Ｄ−グルコースが約２０重量％含まれていた。

次いで上述のようにして得られた粉末の１００ＩＩを温
水ｓｋｇに溶解し、この溶液にβ−ガラクトシダーゼＺ
ｏｏ単位を加えて４０℃で２時間反応させたつ 得られた反応液を酵素の失活処理をした後ｌＯ１０ｍＸ
１０の活性炭カラム（活性炭とセライトの２＝１の混合
物）に通液してオリゴ糖を吸着させた。

次いでこの吸着オリゴ糖を２０％濃度のエタノールを用
いて溶出し、得られた溶出液を減圧濃縮した後、凍結乾
燥して２０１１の白色粉末を得た。

この粉末中には約９０重量％の０−β−Ｄ−ガラクトピ
アノシル−（１→４）−（０−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シルー（１→６））−Ｄ−グルコースを含有していた。

上述のようにして得られた本発明のオリゴ糖粉末を２％
（重量）添加した育児用粉乳なｇ整し、これを生後３ケ
月以内の乳児３０名に投与したところ、それらの糞便中
の全菌数に占めるビフィズス菌の比率の増加は、乳糖２
％（重１ｉ）を添加したものに比較し【約２倍であるこ
とが認められたつ

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるオリゴ糖の部分加水分解物の薄層
クロマトグラフィのノ（ターンを示したものであり、第
２図は本発明によるオリゴ糖の生体内におけるビフィズ
ス菌の増殖促進作用をグラフ片師ＩＩＩＩ　　　　ｒｌ
　　　　差　　　１第１図 第２図 ｊｌ−１−Ｂｅ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 を有する０−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（ｌ→４）
   −（０−β−Ｄ−ガラクトピ２ノシルー（１→６）〕−
   〕Ｄ−グルコーから成るオリゴ糖。 （２）乳糖又は乳糖含有物にβ−ガラクトシタ゛−ゼを
   作用させてガラクトース転移反応を行わせてオリゴ糖言
   有の反応混合物を生成する工程、上記反応混合物を活性
   炭カラムに通液して該反応混合物中の３糖類以上のオリ
   ゴ糖混合物を活性炭に吸着させ、次いで吸着した上記オ
   リゴ糖混合物を溶出する工程、この溶出したオリゴ糖混
   合物に更にβ−ガラクトシグーゼを作用させて分解反応
   を行わせる工程、得られる反応生成物を活性炭カラムに
   通液して目的のオリゴ抛を吸着させ、次いで吸着したオ
   リゴ楯を溶出することを特徴とする特許請求の範囲第（
   １）狽６己載のオリゴ糖の製造方法。 （３）上記オリゴ！ｌ！ｌ言有の反応混合＊を、水で平
   衡化した活性炭カラムに、活性炭ＩＶ４に対して上記反
   応混合物中の３糖類以上のオリゴ抛が５０乃至１００ｔ
   の割付にあるごとく、通液する特許請求の範囲第（２）
   項記載の製造方法□（４）％許請求の範囲第（１）項に
   記載のオリゴ楯を活性成分とするビフィドバクテリウム
   酸の増殖促進剤。