JPS5912355A - 多層分析材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、多層分析材料に関するものである。

さらに詳しくは、本発明は、水性液体、特に生体に起因
する液体（生体液）に含有されている物質の分析のため
に利用される多層分析材料に関するものである。

水、液状食料品、および生体液（たとえば、全血、血し
よう、血清などの血液、りんば液、髄液、唾液、尿）な
どの水性液体に含有されてｌ／）る物質の定量分析法と
しては様々な原理に基づく方法か知られている。

そのような分析法としては、たとえば、試料液中の分析
対象の物質（被検物質、あるいは基質）の含有量に比例
した着色物質の生成反応もしくは変性反応を測定系にお
いて進行させて、その発色あるいは変色を測定する方法
などの方法が代表的な方法として知られている。そして
、この方法シ±溶液分析法としてのみでなく、乾式分析
法にも利用されている。すなわち、ｐＨ試験紙などのよ
うに紙あるいは吸収性の支持体に被検物質との接触によ
り発色あるいは変色する試薬を金縁させた形態の乾式の
分析用シートなどの分析材料がその例である。

また、上記のような乾式の分析シートの形態を基本的に
利用し、かつ、その構成を変えて各種の物質を定量する
ことのできるようにされた多層構成を有する分析材料、
すなわち多層分析材料、が一体型もしくは分、？７　ｏ
ｆ能型なと各種のタイプを含めて既に開発されており、
その改良についても様々な提案がされている。

この内、−・体型多層分析材料は、そのノみ木構成とし
てＩｊ％開層、試薬層および透明支持体を含むものであ
る。

試薬層は一般に、被検試料との接触、反応（錯体形成あ
るいは弱い相互作用なども含む）などにより発色あるい
は変色する指示薬、もしくは、指示薬および、被検試料
（基質）と接触した場合に反応（錯体形成あるいは弱い
相互作用なども含む）して、指示薬に対して発色もしく
は変色など生起させる反応性の物質を発生させる試薬（
本明細書では基質分解性物質と名付ける）を含有して°
いる。後者の場合において指示薬と基質分解性物質は単
一層からなる試薬層に混在させる場合もあるが、必要に
応じて、それぞれを別々の層、たとえば、指示薬含有層
および基質分解性物質含有層として二層に分離する。試
薬層を二層以上設ける場合には、必要に応じて、各層の
間に分離用の層を設けることもできる。

ＪＭ開層は一般に、試薬層の上面に設けられる多孔性の
層で、たとえば特開昭５５−１６４３５６り公報、特開
昭５７−１４０５３２号公報なとに開示されているよう
な織物、あるいは特開昭５３−２１６７７号公報、特開
昭５５−９０８５９号−公報なとに開示されているよう
な非繊維等方的多孔性物質などのような液体透過性の材
料から構成される。この展開層上に被検試料を含有する
水性液体試料を少量点着させると、その水性液体試料は
、展開層の面方向に点着量にほぼ比例した面積になるよ
うにして略円形に拡がり、展開層の中位面積に対して実
質的に均一な星を維持しながら、展開層の下側に設けら
れていて展開層と液体的に接触している実質的に均一な
厚さの試薬層中に浸入（この現象を「展開」という）し
、試薬層中に含有されている試薬との接触により発色も
しくは変色反応などが発生する。そして、一定時１ＩＪ
Ｉ経過後にその発色もしくは変色などを比色分析法また
は蛍光光度分析法により測定し、水性液体試料中の被検
物質の濃度を知ることが可能となる。

透明支持体は一般に、比色分析または蛍光光度分析に用
いられる可視光または紫外線に対して透明な樹脂材料を
フィルムまたはシート状に成形したもので、試薬層の下
側（展開層が付設されている側と反対側）に旧設される
。この透明支持体は、多層分析材料の支持体として機能
するが、試薬層の発色あるいは変色の分光分析を、多層
分析材料を分解することなく行なうことを可能にするよ
うに１通常は、光透過性の材料から形成されている。

このような基本構成を有する一体型多層分析材料につい
ては、既に様々な提案がなされている。

たとえば、特公昭４９−３３８００号公報、特開昭４９
−５３８８８号公報、特開昭５０−１３７１９号公報、
特開昭５１−４０１９１号公報、特開昭５２−３４８８
号公報、特開昭５３−８９７９６号公報、特開昭５３−
１３１０８９号公報などの刊行物には、支持体上に単層
または複層の試薬層が設けられ、さらにその上に非ｍ維
質等方的多孔性展開層が積層された構成からなる−・体
型多層分析材料が開示されている。

また、特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭５６−
７０４６０号公報、特開昭５７−６６３５９号公報など
の刊行物には、支持体上に単層または複層の試薬層が設
けられ、さらにその」−に織物製展開層か積層された構
成からなる一体型多層分析材料が開示されている。

また、特願昭５６−３４３７０号明細書には織物展開層
の代りに有機ポリマーｖＡｒａを含有する抄造紙からな
る展開層を有する構成の一体型多層分析材料が開示され
ている。

本発明は、多層分析材料（特に、一体型多層分析材料）
の試薬層もしくは試薬層に液体的に接触する層に含有さ
れる緩衝剤の改良に関するものであり、少なくとも展開
層、試薬層および透明支持体を含む多層分析材料におい
て、試薬層もしくは試薬層に液体的に接触する層にＮ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキ
シプロパン−３−スルホン酸塩およびＮ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジンーＮ’−３−プロパンスルホンＭ用
からなる群から選ばれる緩衝剤が少なくとも一種含有さ
れていることを特徴とする多層分析材料を提供するもの
である。

次に本発明を訂しく説明する。

水性液体、特に生体に起因する液体（生体液）に含有さ
れている物質の分析のために利用される多層分析材料の
代表的な種類としては、生体液中に含まれる含窒素化合
物の分析に利用される一体型多層分析材料がある。従っ
て、本発明を、含窒素化合物分析用の多層分析材料を例
にとって説明する。

たとえば、生体液中に含まれ、その含有形態。

含有量などが生体の健康状態の指針となる含窒素化合物
として、尿素窒素、クレアチニン、アンモニア、尿酸な
どが知られている。

この内、生体液中に含まれている尿素窒素、クレアチニ
ン、アンモニアの含有量を測定することは、腎臓病など
の疾患の診断、および疾患の経過のコンＩ・ロールなど
のおいて非常に重要とされてイル。そのような尿素窒素
、クレアチニン、アンモニアの測定を目的とした多層分
析材料は既に提案されており、その例としては、特開昭
５２−３４８８号公報、特願１沼５６−１７６２７４号
明細書、特願昭５６−１７６２７５号明細書に記載され
ている多層分析材料を挙げることができる。

一方、血液中に含まれている尿酸は、痛風、腎機能の障
害、白血病、高血圧などの症状において増加する傾向が
あり、これらの疾患の診断指標として有効であるとされ
ている。そのような尿酸の測定を目的とした多層分析材
料も既に提案されており、その例としては、特開昭５３
−２６１８８号公報（たとえば、尿酸をウリカーセで分
解して過酸化水素を発生させることにより尿酸の定量を
行なった実施例３）に記載されている多層分析材料１を
挙げることができる。

これらの含窒素化合物を測定する場合１通常は含窒素化
合物を酵素などで分解するなどにより、これを′Ｍ＃ア
ンモニアあるいは過酸化水素に変換し、このＭＭアンモ
ニアあるいは過酸化水素が、発色性もしくは変色性試薬
に接触することにより発生する発色もしくは変色などを
分光測定して被検物質の含窒素化合物の定量を行なう方
法を基礎としている。

そのような方法を基礎とする多層分析材料を、尿素窒素
の測定に利用される多層分析材料を例にとって次に説明
する６ 従来、この尿素窒素の測定は、一般に湿式法あるいは溶
液法と呼ばれる方法により行なわれている。この溶液法
としては、尿素をジアセチルモノオキシムと直接反応さ
せ、生成した化合物の色吸収を分光光度計で測定する方
法が知られている。

また、尿素にウレアーゼを作用させて、これを炭酸アン
モニウムに分解し、このアンモニアをＭ離させてネスラ
ー試薬と反応させるが、フェノールと次亜塩素酸塩を用
いて着色インドフェノールに変換し、それぞれ生成した
着色反応生成物を比色定量することにより間接的に尿素
量を測定する方法も知られている。これらの溶液法それ
自体は有用な方法であるが、高価な装置が必要であり、
その測定技術は熟練を要し、また測定時間が長いという
欠点もある。

これらの溶液法の欠点を改良し、尿素窒素測定の簡易化
および迅速化を図り、測定者による個人差をなくすため
に、近年、乾式法が種々提案されている（たとえば、奥
田清、臨床検査、２２巻。

１１号、１２０３〜１２１８　（１９７８年）参照；ま
た、ウレアーゼ活性を有する酵素系とｐＨ指示薬と障壁
形成体とを含有する尿素定量用組成物は特開昭５０−９
３４９４号公報に開示されている）。

乾式法を利用する分析材料の代表的な例としては、試薬
層を、ウレアーゼとアルカリ性緩衝剤とを含有する基質
分解性物質含有層と、ガス状アンモニアを検出する指示
薬含有層とを備え、両層の間にガス状アンモニアのみを
選択的に透過させるような選択透過層を挟む形態で一体
化した多層分析材料がある。

たとえば、特開昭５２−３４８８号公報には、選択透過
層としてセルロースプロピオネートバレレート、セルロ
ースアセテートブチレート、セルロースアセテートまた
はポリ（メチルメタクリレ−１・）からなる塗布量０．
１０〜３．５ｇ／ｍ’の均質な層で妨害物質、特に水、
に対して均一な不浸透性を備えている層（バリヤ一層）
が設けられている構成を有する一体型の多層分析材料が
開示されている。

また、特願昭５６−１７６２７４号明細書および特願昭
５６−１７６２７５号明細書には、透明支持体上に（ｉ
）カス状アンモニア用の指示薬層（１１）液体遮断層、
（ｉｉｉ）アルカリ性緩衝剤を含有し必要により基質と
反応してアンモニアを生成することの出来る試薬を有す
る試薬層、および（ｉｖ）展開層がこの順に一体に接着
積層され姓液体試料中のアンモニア又はアンモニア生成
基質分析用一体型多層分析材料において、液体遮断層が
使用条件下に液体試料および水を実質的に遮断しかつガ
ス状アンモニアを透過させる空気孔を構成する層として
メンブランフィルタ、織物または網状物を用いる事を特
徴とする液体試料中のアンモニア又はアンモニア生成基
質分析用−・体４り多層分析材料が開示されている。

上記のような多層分析材料の基質分解性物質含イｊ層層
は、親水性あるいは水溶性のバインダー中に、原木、ク
レアチニンのようなアンモニア生成基質と反応してアン
モニアを生成するウレアーセ、り、レアチニンディミナ
ーゼなとの酵黍を主体とする基質分解性物質、および基
質と試薬との反応を円滑に進行させ、かつ反応により生
成するアンモニアをガス状に効率よ＜’Ｅｔａさせるだ
めのアルカリ性緩衝剤などが含まれている。

一般に生物化学の研究の領域において、緩衝剤としては
、Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、　Ｒ。

Ｍ、Ｃ：、　Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ　編、第２版、
　　０ｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅＣＬＡＲＥＮＤＯＮ　
ＰＲＥＳＳ（１９６９）　ｐ、　４７６〜５０８、に記
載されているような各種の無機化合物よりなるものが使
用されている。しかしながら、それらのプ！に機化合物
よりなる緩衝剤は、多層分析材料の試薬層において緩衝
剤として使用するためには、緩衝作用を有する１）Ｈ領
域の範囲、および試薬層に均一に分散して基質と試薬と
の反応を円滑に進行させ、かつ反応により生成するアン
モニアなどを効率よく遊＃させる機能、あるいは指示薬
の発色もしくは変色などを再現性良く発現させる機能に
おいて充分満足できるとは言い難い。

以Ｊ二のような理由から多層分析材軸の試薬層において
作用する緩衝剤としては、通常ｒＴｒｉｓＪと呼ばれて
いるトリス（ヒドロキシメチル）アミ／メタンなどが一
般的に用いられている。しかしながら、こノＴｒｉｓは
、Ｂａｔｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　３３．１２８５（１９８０）
などに報告されているように空気中の炭酸ガスを吸収す
る傾向があるため、多層分析材料の保存性および測定値
の精度なとに問題がある。

このため、たとえば、多層分析材料の一種である成木窒
素分析用多層分析材料を開示した前述の特開昭５２−３
４８８号公報、特願昭５６−１７６２７４号明細書およ
び特願昭５６−１７６２７５号明細書の各々の実施例に
おいては、通常ＢｉｃｉｎｅとＯｆ′ばれるＮ、Ｎ−ビ
ス（２−ヒドロキシエチル）クリシンか用いられている
。ごのＢｉｃｉｎｅは、一般にグツド（Ｇｏｏｄ）の緩
衝剤として知られておりＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
Ｖｏｌ、、　Ｎｏ、２．４８７〜４７７　（１９６Ｂ）
に記載されている生物化学の研究において使用され得る
有機化合物系の緩衝剤の−っである。しかし、このＢｉ
ｃｉｎｅもまた、水、特に試薬層もしくは試薬層に液体
的に接触する層の支持構造体となる物質（バインダー）
、たとえは、ゼラチン、ポリアクリルアミドなど、そし
て基質分解性物質および／または指示薬などを含有する
水溶液に対する溶解性が低いとの欠点がある。

試薬層は、通常、そのような支持構造体と各種試薬を含
有する水溶液（または水分散液）を透明支持体の表面に
塗布することにより形成するが、そこに含有させる緩衝
剤の溶解性が充分でないと、試薬層の塗布操作時あるい
は、塗布層の乾燥時などにおいて緩衝剤の局部的な析出
などが発生し、均質な塗布層、すなわち均質な試薬層の
形成を妨げる結果となる。不均質な試薬層は、測定精度
を下げるなど、好ましくない影響を与えるため、そのよ
うな不均質な試薬層の生成を防ぐ必要がある。この理由
から、多層分析材料を製造する工程において、塗布操作
を行なうだめの試薬層形成用塗１ｊｉ溶１合の濃度、温
度、塗′Ｉ＋ｉ操作条件などを厳しくゞに理する必要が
あり、多層分析材料の製造上において大きな障害となる
。

本発明者は、公知の多数の緩衝剤を検討した結果、その
内で特に、一般式： ［］ （ただし、Ｍはリチウム、ナトリウム、カリウムなどの
アルカリ金属イオンあるいはアルカリ土類金属イオンを
表わす）を有するＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３〜スルホン酪（Ｈ
ＥＰＰＳＯ）塩、およ（たたし、Ｍは」二記と同義）を
有するＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３
−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）塩が、それぞれ多層
分析材Ｉｔにおける試薬層もしくは試薬層に液体的に接
触する層を形成するためのパインター溶油に溶解性が高
く、かつ、多くの多層分析材料の試薬層において緩衝剤
として使用するために適当な緩衝ＰＨ領領域あるｐＨ７
〜９の緩衝領域を有し、試薬層もしくは試薬層に液体的
に接触する層に均一に分散して、基質と試薬との反応を
円滑に進行させ、さらには、試薬層を基質分解性物質含
有層と指示薬含有層に分割した構成の多層分析材料にお
いては、基質分解性物質含有層にて分解反応により生成
するアンモニアなどを効率よく遊離させて指示薬含有試
薬層にそれを移動させる機能においても充分満足できる
ことを見いだし、本発明に到達したものである。

本発明の多層分析材料において緩挿１剤として用いるＨ
ＥＰＰＳＯおよびＥＰＰＳは、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０４　、３００〜３１０（
１９８０）に記載されている公知の化合物である。

本発明の緩挿（剤を含む多層分析材料は、Ｑｊｒに、ア
ンモニア生成基質と基質分解性物質との反応により生成
するアンモニア、あるいは過酸化水素生成基質と基質分
解性物質との反１心により生成する過酸化水素を４１１
１定することによりアンモニア生成）、（質あるいは過
酸化水素生成基質を間接的に測定するのに有利に使用す
ることができる。

そのようなアンモニア生成基質と基質分解性物質との紹
合せとしては、たとえば、尿素／ウレアーゼ（ＥＣ３，
５，１’、５）、　クレアチニン／クレアチニンデイミ
ナーゼ（ＥＣ３，５，４゜２１）、アミノ醇／アミノ酸
デヒドロゲナーセ（ＥＣ１，４，１，５）、　　アミノ
酸／アミノ酸オキシダーセ（ＥＣ１，４，３，２）、ア
ミノ酸／アンモニアリアーゼ（ＥＣ４，３，１に属する
酵素）、アミン／アミンオキシダーゼ（ＥＣ１，４，３
，４；１．４．３．６）、　　ジアミン／アミンオキシ
ダーゼ（ＥＣ１，４，３，４，１，４，３，６）、グル
コースおよび燐アミタート／燐アミダートヘキンース燐
トランスフェラーセ（ＥＣ２，７，１，６２）、ＡＤＰ
／刀ルパミン酸塩キナーゼ（ＥＣ２，７，２，２）およ
び燐酸カルバモル、酸アミド、ヌクレオシ（ζ／デアミ
ナーゼ（ＥＣ３，５，４に属する酵素）、ヌクレオチド
／デアミナーゼ（ＥＣ３，５，４に属する酵素）、グア
ニン／グアナーゼ（ＥＣ３，５，４，３）などを挙げる
ことができる。すなわち、「アンモニア生成基質」とは
、特定の試薬（基質分解性物質）と反応して、それ自体
からアンモニアを生成するか、あるいは複数個の反応系
を経由してアンモニアを生成するような化合物もしくは
化合物群を意味する。

また、過酸化水素生成基質と基質分解性物質との組合せ
としては、たとえば、尿酸／ウリカーゼ（ＥＣ１，７，
３，３）、サルコシン／サルコシンオキシダーゼ（ＥＣ
１，５，３，１）、Ｎ−メチルアミノ酸／Ｎ−メチルア
ミノ耐オキシダーゼ（ＥＣ１，５，３，２）、Ｎ６−メ
チル−Ｌ−リジン／Ｎ６−メチル−Ｌ−リシンオキシダ
ーゼ（ＥＣｌ　、　５　、３　、４）などを挙げること
ができる。すなわち、「過酸化水素生成基質」とは、特
定の試薬（基質分解性物質）と反応して、それ自体から
過酸化水素を生成するか、あるいは複数個の反１心系を
経由して過酸化水素を生成するような化合物もしくは化
合物群を意味する。

指示薬としては、′Ｍ＃アンモニアあるいは′Ｍ離通過
酸化水素反応（錯体の形成反応なども含む）して、その
吸収波長に変化を生じるような単一の化合物または複数
の化合物の組合わせ（以下、発色前駆体という）を用い
る。

遊離アンモニアと反応する発色前駆体の例としては、ロ
イコシアニン染料、ニトロ置換ロイコ染料およびロイコ
フタレイン染料のようなロイコ染料、ブロムフェノール
ブルー、プロムクレソールグリーン、ブロムチモールブ
ルー、キノリンブルーおよびロソール酸のようなｐＨ指
示薬；トリアリールメタン系染料前駆体；ロイコベンジ
リデン色素；ジアゾニウム塩とアゾ染料カプラー；塩基
漂白可能染料などを挙げることができる。

遊＃過酸化水素と反応する発色前駆体の例としては、ペ
ルオキシダーゼ（ＥＣｔ、ｔｉ、ｉ。

７）と３，３°、５．５”−テトラメチルヘンシジンと
の組合せ、ペルオキシダーゼと４．５−ヒス（ｐ−ジメ
チルアミノフェニル）−２−（３’、５゛−ジメトキシ
フェニル）イミダゾールとの組合せ、ペルオキシダーゼ
、フェノール類もしくはナフトール類（たとえば、フェ
ノール、１．７−シヒドロキシナフタレンなど）、およ
び４−アミノアンチピリン類（たとえば、４−７ミノア
ンチピリン、４−アミノ−２，３−ジメチル−１−（２
，４，６−ドリクロロフエニル）−３−ピラノリン−５
−オンなど）からなる組合せなどを挙げることができる
。

なお、指示薬は、基質もしくは基質の分解生成物と反応
して、その分光特性が変化するものであればよく、たと
えば、基質もしくは基質の分解生成物と反応して蛍光を
発生するなどの特性を有する指示薬を用いることもでき
る。

本発明の緩衝剤を含有する層は試薬層もしくは試薬層と
液体的に接触している層である。

試薬層は基質分解性物質および／または指示薬を含イ１
する層であり、中−の層あるいは二以」二の層から形成
される層である。試薬層を二以上の層とする場合は、た
とえば、基質分解性物質含有層と指示薬含有層のように
分けることもできる。また、試薬層を二以」二の層から
構成する場合には、たとえば液体遮断層をそれらの複数
の層の間に設けることもできる。

試薬層と液体的に接触している層とは、試薬層そのもの
ではないか、本発明の多層分析材料が被検液あるいは水
などの液体と接触した場合に、重ね合わされた層の間で
多層分析材料の中を、液体および液体中に溶解もしくは
分散している成分が通過することができ、その液体を介
して試薬層と接触する関係になり得る層である。たとえ
ば、多層分析材料の試薬層に積層された層あるいは展開
層などに緩衝剤を含有させておき、これを被検液と接触
させた場合にその緩衝剤が被検液を介して試薬層に移動
するようにしておくことができる。

基質分解性物質と指示薬とを試薬層に含有させる場合に
は、−緒に単一の試薬層に含有させるか、あるいは、そ
れぞれを基質分解性物質含有層と指示薬含有層（この場
合には、双方の層を総称して試薬層という）とに別々に
含有させる。あるｌ、％は本発明の緩衝剤、すなわちＨ
ＥＰＰＳＯ塩および／またはＥ　Ｐ　Ｐ　Ｓ　ｉｌｌは
、前者の単一層の場合には、その単一層に含有させ、後
者の場合には、ノ＆質分解性物質含有層の指示薬含有層
のいずれか一方のみ、あるいは基質分解性物質含有層と
指示薬含有層の双方に含有させる。

本発明の緩衝剤は緩衝目的の系をｐＨ７〜９の範囲に緩
衝するのに特に適している。従って、本発明の多層分析
材料が含有する緩衝剤の蟻は、分析系のｐＨを７〜９に
維持することを可能とする亀であることが好ましい。そ
のような１１１＋ｉ剤の好適な含有量は、多層分析材料
に含まれている試薬の種類、邦、そして分析対象系など
によ・り変動するが、一般には０．１〜２０　ｇ　／　
ｍ’　（緩衝剤含有層の面積当り）の範囲であり、好ま
しくは０．２〜Ｌｏｇ／ｒｎ’の範囲である。

試薬層は一般に、各種の試薬と水溶性／くインターとの
混合水性溶液あるいは分散液を透明支持体」二に塗布す
ることにより形成する。

本発明において使用することのできる水溶性／久インタ
ーの例としては、ゼラチン、変性ゼラチン、カゼイン、
変性カゼインなどの蛋白質系ポリマー類；アガロース、
変性アガロースなどの多糖類；メチルセルロース、エチ
ルセルロース、プロピルセルロースなどのアルキルセル
ロース類；ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン
、ポリビニルアルコール、ポリ無水マレイン酸などの合
成ビニル重合体またはこれらの共重合体を挙げることが
できる。

なお、試薬層には所望により、他の添加剤を添加するこ
ともできる。

本発明の多層分析材料の透明支持体は、このような多層
分析材料の構成要素として従来より一般的に知られてい
る各種の透明支持体を用いることができる。そのような
透明支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート
、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン
、セルロースエステル類、ポリアクリレート類なとの透
明性の高い合成樹脂からなる透明支持体を挙げることが
できる。なお、多層分析材料の展開層、試薬層などの透
明支持体以外の層が単独で、あるいは共同して自己支持
性を有する場合には、それらの層が単独もしくは共同し
て透明支持体を兼ねることもできる。

本発明の多層分析材料には必要により、特開昭４９−５
３８８８号公報に開示されている透析層、特開昭４９−
５３８８８号公報、特開昭５１−４０１９１号公報、特
開昭５５−２６４２８号公報、特開昭５５−２６４２９
号公報、特開昭５５−１６４３５６号公報などに開示さ
れている光反射層、光遮断層または光ブロンキング層、
特開「１／」５５−１６４３５６号公報、特開昭５７−
６６３５９号公ｆ’ｌｉ！、特願昭５６−３４３７０号
明細書などに開示されている展開層を接着するための接
着層、特開昭５１−４０１９１号公報、特開昭５３−１
３１０８９号公報、特開昭５４−２６７９３号公報、特
開昭５４−２９７００号公報などに開ノ１＼されている
媒染層、検出層また−は生成した着色物質のミグレーシ
ョン防止層などを、これらの公ＩＩＪもしくは明細書に
開示の方法に従って、ｍｌみ込むことにより、それらを
も多層分析材料の構成要素とすることができる。さらに
、生体液などの試料液に微少遣含有される被検物質の定
量用多層分析材料を目的とする場合には、実開昭５７−
４２９５１号公報に開示されている液体試料一定面積展
開型の液体試ネ゛１点着供給用ポーラス体（パッチ）を
展開層の代りに設けることもできる。

また、試薬層を二層以上から構成する場合にほの、それ
らの各層の間には、液体遮断層、たとえば、液体の透過
を遮断する一方、ガス状の′Ｍ遊離ンモニア、遊離過酸
化水素を透過させる透過孔を有するメンブランフィルタ
−または織り状もしくは編み状物なとからなる液体遮断
層層を設けることが好ましい。そのようなメンブランフ
ィルタ−にからなる液体遮断層については特願昭５６−
１７６２７５号明細書に記載があり、そして、織り状も
しくは編み状物などからなる液体遮断層については特願
昭５６−１７６２７４吋明細書に記載かある。また、前
述の特開昭５２−３４８８号公報に開示されているセル
ロースエステル類あるいはポリ（メチルメタクリレート
）からなり、塗布ｌ−０、ｌ　Ｏ〜３　、５　ｇ／ｍ’
、好ましくは０．２０〜１．Ｏｇ／ｍ’の均質層を液体
遮断層とすることも可能である。

これまでに述べたように本発明の多層分析材Ｉｔの試薬
層は、使用条件下において生体液などに含まれる多くの
基質を反応させて指示薬の発色あるいは変色などの分光
特性変化を引起こす反応に好適なｐＨ領域であるｐＨ７
〜９に緩衝領域を有し、該試薬層は均質に形成されるた
め、ノル質と試薬との反応が円滑に進行し、さらには、
試薬層をノに質分解性物質含有層と指示薬含有層とに分
割した場合、基質分解性物質含有層における反応により
生成するアンモニアなどの反応性物質を、効率よく遊離
させて指示薬含有層にそれを移動させる機能においても
充分満足できるものである。

次に本発明を実施例および比較例により説明する。

［実施例１〜５−　比較例］ 緩衝剤および／またはバインダーを下記のように各種変
えた試薬層形成用塗布液を写真材料用の無色透明なポリ
エチレンテレフタレー・ト（ＰＥＴ）フィルムベースに
塗布することにより、透明支持体と試薬層からなる多層
分析材料の構成部材（多層分析材料要素）を調製した。

この透明支持体と試薬層からなる部材の試薬層の表面に
、その表面に対して垂直な方向から相対湿爪７０％の空
気を風速５ｍ／秒の速度にて２４時間連続して吹イ１け
、その後、目視により試薬層からの緩衝剤の析出を観察
し、ついで、散乱晃積分ＡＩす先人へイズメーターで試
薬層のヘイズ度（にごり）を測定した。その結果を第１
表に示す。

［比較例］：９．Ｏｇ／ｍ’の脱イオンゼラチン、０．
２ｇ／ｍ’のパラノニルフェノキシポリグリシドール、
０．１７ｇ／ｍ’のエチレンジアミンテトラ酢酸四ナト
リウム、２　、２４ｇ／ｍ’　（１３。

７ミリモル／ｍ’）　ノＢｉｃｉｎｅ　［Ｎ　、　Ｎ−
’ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］、０．１１
５ｇ／ｍ′の燐酸水素二ナトリウム、０．９ｍｇ／ｍ’
のジチオエリスリトール、３６　、　ＯＯＯＵ／ｍ’の
ウレアーセ、および５４．　ｍ　ｇ　／　ｍ’のビスビ
ニルスルホニルメチルエーテルを含むｐＨ８，０で緩衝
させた塗！σ液からなる試薬層（層厚＋１０１０１Ｌと
ＰＥＴフィルムベースからなる構成部材。

［実施例１］　；比較例１において、　Ｂｉｃｉｎｅの
代りに、３　、４５ｇ／ｍ’　（１３、７ミリモル／ｍ
′）のＥＰＰＳφＮａ［Ｎ−２−ヒドロギシェチルピペ
ラジンーＮ′−３−プロパンスルポン醇すトリウム塩］
を用いた以外は同様に調製した塗布液からなる試薬層（
層厚：１０ルｍ）とＰＥＴフィルムベースからなる構成
部材。

［実施例２〕　：比較例１において、Ｂｉｃｉｎｅの代
りに、３．６８ｇ／ｍ″（１３，７ミリモル／ｍ′）の
ＨＥＰＰＳＯ−Ｎａ　ＥＮ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラシン−Ｎ”−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン
酸のナトリウム塩］を用いた以外は同様に調製した塗布
前からなる試薬層（層厚：１０　Ｊｔ　ｍ　）とＰＥＴ
フィルムヘースからなる構成部材。

［実施例３］　：比較例１において、Ｂｉｃｉｎｅの代
りに、２．０８ｇ／’ｍ’　（８，２２ミリモル／ｍ′
）のＥＰＰＳ−Ｎａと１．４７ｇ／ｍ’　（５，４８ミ
リモル／ｍ’、）ｃ７）ＨＥＰＰＳＯ’Ｎａと（７）　
ｙ＝合物［ＥＰＰＳ＠Ｎａ：ＨＥＰＰＳＯ・Ｎａ　（モ
ル比）＝６：４］を用いた以外は同様に調製した塗布液
からなる試薬層（層厚：１０ｐｍ）とＰＥＴフィルムベ
ースからなる構成部材。

［実施例４］　：比較例１において、脱イオンゼラチン
の代りに、同州のヒドロキシエチル変性アカロース（商
標名：　５ＥＡＰＲＡＱＵＥ、ＦＭＣコーポレーション
製）を用いた以外は同様に調製した塗布液からなる試薬
層（層厚：５用ｍ）とＰＥＴフィルムベースからなる構
成部材。

［実施例５］　：比較例１において、脱イオンゼラチン
の代りに、同量のポリアクリルアミド（平均分子量：５
００〜６００万）を用いた以外は同様に調製した塗布液
からなる試薬層（層厚：４μｍ）とＰＥＴフィルムベー
スからなる構成部材。

第１表 塗布直後　風乾後　　塗布直後　風乾後比較例　　僅少
　　顕著　　　　４．５％　　　３０％実施例 ■　　　　　　　ｓ　　　　　　イヘシ少　　　　　　
　　　０．３％　　　　　３．９％２　　　無　　　僅
少　　　　ｏ、ｏ　　　３．。

３　　　　　無　　　　　僅少　　　　　　　ｏ、３ｘ
　　　　　２．０％４　　　　　　　無　　　　　　イ
吊少　　　　　　　　　０．５％　　　　　５．２％５
　　　無　　　僅少　　　　ｏ、７ｙ、　　　？、！Ｊ
［実施例６］ 次のようにして多層分析材料を形成した。

（１）指示薬含有層の形成 ブロモクレゾールグリーン　　　ｓ、ｔｇ酢酸ビニル・
アクリル酸エステル共重合体ラテックス（セビアンＡ　
−５８２１、タイセル味商標）　　　　　　　　５１０
ｇクエン酸　　　　　　　　　　　　４．５３水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５０ｍ文の組
成からなる塗布液を乾燥膜厚８用ｍとなるように透明Ｐ
ＥＴフィルムベース（実施例１で用いたものと同一のも
の）」二に塗布した。

（２）液体遮断層の形成 ２％シリコーン（Ｉ・−レシリコーン５Ｈ−８０１１、
東し■商標）ヘキサン溶液に、セルロース・ジおよびト
リアセテートより製造されたメンブランフィルタ−（富
士ミクロフィルター　ＦＭ−１２０、厚さ１４０　ＪＬ
ｍ、空孔率７５％、平均孔体１．２用ｍ）を浸漬後、乾
燥した。

前記の指、示薬含有層（乾燥塗膜）の上に、」−記の処
理を行なったメンブランフィルタ−を圧着ラミネートロ
ールを用いて積層した。

（３）基質分解性物質含有層の形成 ９．０ｇ／ｍｌ’の脱イオンゼラチン、０．２ｇ／ｍ’
ノパラノニルフエノキシボリグリシドール、０　、１７
　ｇ／ｍ’ノエチレンジアミンテトう酢酸四ナトリウム
、３．４５ｇ／ｍ’（１３，７ミリモル／ｍ’）ｃ７）
ＥＰＰＳ　串Ｎａ、ｏ、１１５ｇ／ｍ’の燐酸水素二ナ
トリウム、０．９ｍｇ／ｍ’のジチオエリスリトール、
３６，０ＯＯＵ／ｍ’のウレアーゼおよび５４　ｍ　ｇ
　／　ｍ’のビスビニルスルホニルメチルエーテルを含
むＰＨ８，０で緩衝させた塗布液（実施例１で用いた塗
布液と同し）を」、記（２）で形成した液体遮断層の」
二に乾燥膜厚１０＃Ｌｍになるように塗布した。

（４）光反射層の形成 二酸化チタン粉末　　　　　　　　４０ｇゼラチン　　
　　　　　　　　　　４０ｇパラノニルフェノキシ ポリグリシドール　　　　　　１．５ｇ水　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　４００ｍ文の組成から
なる塗布液を前記の基質分解性物質含有層（乾燥塗膜）
の上に乾燥膜圧６ｇｍになる様に塗布した。

（５）接着層の形成 セラチン　　　　　　　　　　　　２５ｇ水　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　５００ｍ文パラノニ
ルフェノキシ ポリグリシドール　　　　　　１．５ｇの組成からなる
塗布液を前記の光反射層（乾燥塗膜）の上に乾燥膜厚２
ＪＬｍになるように塗布した。

（６）展開層の形成 に記の（１）〜（５）の工程により接着層まで一体積層
された分析材料要素にさらにパラノニルフェノキシポリ
グリシドールｏ、ｏ２ｆ＜量％水溶液を塗布し、これを
短時証加熱することにより膨潤させたのち、ブロード織
り綿布を圧着ラミネートして尿素窒素分析用の一体型多
層分析材料を製造した。

ここで製造した一体型多層分析材料に種々の尿素窒素含
有量を有するコントロール血清（それらの尿素窒素含有
量はウレアーゼ［株］インドフェノール法により本測定
と同時に測定した）１０ｇｕを点希し、３７°Ｃで６分
温置したのち、その発色の光学濃度を分光光度計を用い
て波＆６００　ｎ　ｍにて測定し、その測定値から検量
線を作成した。得られた検量線を第１図に示す。

すなわち、この一体型多層分析材料により尿素窒素含有
量と光学濃度とが優れた比例関係を示す検量線あり得ら
れていることが確認された。

［実施例７］ 基質分解性物質含有層形成用の塗布液の調製において、
３．４５ｇ／ｍ’（１３，７ミリモル／　ｍ’）のＥＰ
ＰＳ−Ｎａｃ７）代りに３．６８ｇ／ｍ’（１３，７ミ
リモル／ｍ′）のＨＥＰＰＳＯ−Ｎａを配合した以外は
、実施例６と同様にして塗布液（実施例２で用いた塗布
液と同じ）を調製した。

上記の塗布液を用いて基質分解性物質含有層の形成を行
なった以外は、実施例６と同様にして尿素窒素分析用の
一体型多層分析材料を製造した。

ここで製造した一体型多層分析材料に種々の尿素窒素含
有量を有するコントロール血清（それらの尿素窒素含有
量はウレアーゼ・インドフェノール法により本測定と同
時にＡ１１定した）１０．文を点着し、３７°Ｃで６分
温置したのち、その発色の光学濃度を分光光度計を用い
て波長６００ｎｍにてｌ’１ｌ１１定し、その測定値か
ら検量線を作成した。得られた検量線を第２図に示す。

すなわち、この一体型多層分析材料により尿素窒素含有
量と光学濃度とが優れた比例関係を示す検量線が得られ
ていることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、それぞれ本発明の実施例の多層
分析材料を用いてコントロール血清中の尿素窒素の測定
を行なった際に得られた検量線である。 特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　ゴ
Ｔ理士　　　柳川泰男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ。少なくとも展開層、試薬層および透明支持体を含む
   多層分析材料において、試薬層もしくは試薬層に液体的
   に接触する層にＮ−２〜ヒドロキシエチルピペラジン−
   Ｎ゛〜２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸塩およ
   びＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン〜Ｎ’−３−プ
   ロパンスルポン酸塩からなる群から選ばれる緩衝剤が少
   なくとも一種含有されていることを特徴とする多層分析
   材料。 ２゜多層分析材料が一体とされていることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の多層分析材料。 ３゜該緩衝剤の一部もしくは全部が多層分析材料の試薬
   層に含有されていることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項もしくは第２項記載の多層分析材料。 ４゜該緩衝剤の含有量が、使用条件下においてその緩＃
   ｉ系をｐＨ７〜９に維持することのできる都であること
   を特徴とする特許請求の篩囲第１項乃奎第３項のいずれ
   かの項記載の多層分析材料。 ５゜緩衝剤が、Ｎ−２−ヒｌ；　ｏキシエチルピペラジ
   ン−Ｎ′−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸塩
   およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３
   −プロパンスルホン酸塩の混合物であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかの項記載
   の多層分析材料。 ６゜試薬層か、基質分解性物質と指示薬とを含有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第５項のいず
   れかの項記載の多層分析材料。 ７゜試薬層が、それぞれ独立した基質分解性物質含有層
   と指示薬含有層とからなることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項乃至第６項のいずれかの項記載の多層分析材
   料。 ８゜基質分解性物質含有層と指示薬含有層との間に液体
   遮断３層が設けられていることを特徴とする特許請求の
   範囲＃５７項記載の多層分析材料。 ９゜基質分解性物質含有層にＮ−２−ヒドロキシエチル
   ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−スル
   ホン酸塩およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジンー
   Ｎ°−３−プロパンスルホン酸塩からなる群から選ばれ
   る緩衝剤の少なくとも一種が含有されていることを特徴
   とする特許請求の範囲第６項もしくは第８項記載の多層
   分析材料。 ｌＯ，基質分解性物質が酵素であることを特徴とする特
   許請求の範囲第６項乃至第９項のいずれかの項記載の多
   層分析材料。 １１、基質分解性物質が、アンモニア生成基質と反応し
   てアンモニアを生成させることのできる酵素であること
   を特徴とする特許請求の範囲第６乃至１０項のいずれか
   の項記載の多層分析材料。 １２゜アンモニア生成基質が尿素であり、該基質と反応
   してアンモニアを生成させることのできる基質分解性物
   質がウレアーゼであることを特徴とする特許請求の範囲
   第１１項記載の多層分析材料。 １３゜アンモニア生成基質がクレアチニンであり、該基
   質と反応してアンモニアを生成させることのできる試薬
   がクレアチニンデイミナーゼであることを特徴とする特
   許請求の範囲第１１項記載の多層分析材ネ゛ｌ。 １４゜基質分解性物質が、過酸化水素生成基質と反応し
   て過酸化水素を生成させることのできる酵素であるこ２
   を特徴とする特許請求の範囲第６乃至１０項のいずれか
   の項記載の多層分析材料。 １５゜過酸化水素生成基質が尿酸であり、該基質と反応
   して過酸化水素を生成させることのできる試薬がウリカ
   ーセであることを特徴とする特許請求の範囲第１４項記
   載の多層分析材料。