JPS59187796A - 抗ヒト前立腺癌抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト前立腺癌に対する抗体の製造法、その抗
体およびそれを分泌する融合細胞（以下、ハイブリドー
マと称す〉に関する。

近年、癌はあらゆる疾患の中で死亡率の最も高い疾患に
なっており、社会的問題になっている。

その対策はあらゆる６面から検討されているが、未だ根
本的な解決法は見出されていない。日本に於いては胃癌
、肺癌、肝癌が多く、癌による死亡者全体の５０％以上
を占めているが、一方において、生活様式の変化から従
来は少なかった種類の癌も増加傾向にある。その中で前
立腺癌などの泌尿器系悪性腫瘍は年々増加の一途をたど
っている代表的な例である。その治療法どしては、手術
療法を主体とし、放射線療法、化学療法、免疫療法など
−〇　− が施行されているが、末期癌や進行病では限界があり、
早期診断、早期治療が最善の方法とされている。そのた
め、癌を早期に然も迅速に同定・診断する方法や従来と
異なった治療方法が求められているのが現状である。

一方、癌細胞表面に存在する癌関連抗原については、こ
れまでに膨大な研究がなされており、動物実験病ではそ
の存在が証明されているが、人癌では研究が充分でなく
、その存在は不明確である。

このような抗原の研究は同種抗血清や異種抗血清を用い
て行なわれてきたが、特異性を高めるために吸収操作を
繰り返づ゛と抗体価は低下し、実用に耐えられる抗血清
はなかなか得られなかった。

近年、細胞融合法によるモノクローナル抗体作製技術の
出現及び発展により、力価が高く、特異性に優れた抗体
の作製が可能となってきており、ヒ１〜リンパ球ザブセ
ット、ヒト白血病、ヒトメラノーマ、ヒ１へ結腸癌など
のヒト細胞表面抗原に対して反応するモノクローナル抗
体が得られたとの報告がなされている。ヒト前立腺癌に
関しでも、このようイ（特異１′１１の優れた抗体が得
られる４ｒらば、癌細胞の同定や診断、治療に役立つわ
（〕である。

しかし、細胞融合法によるモノクローナル抗体作製の技
法を用いれば特異抗体の作製は一般的に可能であるどさ
れているものの、癌細胞によってはその抗原性に変動が
あり、果して目的とする特異ＦＩの侵れｆｃ抗体が得ら
れるかどうかは現在のところ予知できないとされている
。さらに、ヒト前立腺癌に関してはその報告はほとんど
なく、まして実用化されている抗体もない。

本発明は、ヒト前立腺癌に対する抗体を細胞融合法によ
り作製し、その癌細胞に対して特異性の優れた抗体の作
製が可能であることを確認してなされたものである。こ
のようにしてｊｑられる本発明の抗体は、ヒト前立腺癌
の同定剤や診断剤、さらには治療剤として役立つもので
ある。

ヒト前立腺癌細胞に対する抗体の作製法は一般に下記の
工程から成る。

Ａ、抗体産生細胞を調製する工程： ヒト前立腺癌細胞に対する抗体産生細胞は、ヒトを含め
たいずれの動物種から得てもよく、またあらかじめ免疫
を行なうことは必須ではないが、これを行なうことにに
って目的とするハイブリドーマの採取効率を著しく上げ
ることができる。

ヒトの細胞を用いる場合には、前立腺癌の病歴のある者
や血清中の該細胞に対する抗体価が高い者を選ぶことが
できる。癌細胞の免疫においては、癌細胞そのものまた
はグルタルアルデヒド処理やマイトマイシン処理により
増殖性を失わせた細胞を用いてもよく、また細胞より該
表面抗原を適当な方法で分離、精製したものを用いても
よい。ま９− た免疫に際し、７０イン１〜完全または不完全アジコバ
ントのような助剤を免疫原に混入して用いることができ
る。免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射
、静脈内注射、庁内注射、筋肉内注射等いずれでもにい
が、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
または適当な間隔、好ましくは１週乃至５週をおいて繰
り返し行なってもよい。免疫した動物の血清中の該細胞
に対する抗体価を測定し、抗体価が充分高くなった動物
を抗体産生細胞のソースとして用いれば、その後の操作
の効率を上げることができる。融合には、最終免疫後３
〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を用いるのが好まし
い。該抗体産生細胞は形質細胞およびその前駆細胞であ
るリンパ球であり、これは個体のいずれの部位からＩＦ
、１てもよいが、一般には牌、リンパ節、末梢面または
これらの適宜の組み合わμから得ることができる。

［３，粧渥融合の工程： もう一方の親細胞であるインビトロにおいて長期継代培
養可能な細胞は、抗体産生細胞と融合して目的にかなっ
たハイブリドーマを生ずるものであればいずれでもよい
が、その確率の高いのは骨髄腫等の白血病細胞である。

由来の種も、ヒト、ラット、マウス等いずれでもよい。

後述するように、融合後混在する親細胞を除くためには
ヒボキ与ンヂングアニンホスホリボシルトランスフエラ
ーゼ欠損株細胞またはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用
いるのが好ましい。例えば、ヒト由来のＧＭ　１５００
−６Ｔ　Ｇ　−△１２．　ＲＰ　Ｍ　Ｔ　８２２６．マ
ウス由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｏ８．　Ｐ３−ＮＳ　Ｉ／
１−Ａｇ４−１．５ｐ２１０−ΔΩ１４．　Ｘ　６３−
Ａ　ｇ８，６５３等を用いることができる。

」二連の抗体産生細胞の由来する種と長期継代培養可能
な細胞の由来する種が同一であることば不可欠ではない
が、融合の効率、融合後の細胞の性質の安定性、生体内
で培養する際の簡便さ２ｉどの点から、一般には同一の
ちのを用いる力が右利である場合が多い。特に長期継代
培養可能な細胞として、マウス由来のＰ３．−Ｘ６３−
Δｇｆ１．　Ｐ３−Ｎ　Ｓ　Ｔ／１−Ａ（１４−１，Ｓ
１１２１０−Ａｇ１４またはＸ６３−Δ９８．６５３を
用いる場合には、抗体産生細胞を得る動物として、同系
マウスであるＢＡＬＢ／ｃまたはイの文箱マウスを用い
るのが右利である。融合に際しては、センダイウィルス
、ポリＴヂレングリ」−ル等の融合促進剤を用いるのが
よく、特にポリ１チレングリコール１０００．　＋５４
０．２０００．４０００１！たは６０００２’ｉ：どを
用いるのが好ましい。これを約３０〜５！１％含む溶液
中で融合を行なわせる。助剤として更にジメヂルスルホ
キシドを添加してＪ）よい。

Ｃ，ハイブリドーマの町Ｗ： 融合後の混合物中には、ハイブリドーマの仙、親１１１
１胞である抗体産生細胞とインビトロで長期継代培養可
能な細胞等が残存している。前者は通常長期間のイン１
１〜口の培養に耐えられないので問題はないが、後者は
目的とするハイブリドーマと共に増殖する可能性がある
のでこれを除くことが望ましい。このため後者として、
ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼまたはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用いて融合を
させた後、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびデミ
ジンを含む培地中で培養する。これによりハイブリドー
マのみを選択的に生育させることができる。親細胞とし
てヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼまたはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用いない場
合には、融合に先だって該Ｉ胞をエメヂンおよびアクチ
ノマイシンＤで処理して細胞の増殖性を失わせておくこ
とにより、ハイブリドーマを親細胞との混合物から選１
３− 択してもよい。

このようにして得たハイブリドーマは、一般には２種類
以上のり［］−ンを含むことが多く完全に同一の性質を
イｊする細胞の集団ではない。個々のクローンを分離し
たい場合には、クローン化を行なうことが必要である。

クローン化は、単一の特異性をもつ抗体を製造するため
には勿論であるが、多種類のり［］−ンが混在する系に
おいて長期間培養を行なっている間にしばしば起こるボ
ビコレーシジンの変化を防ぐ意味からも右列であり、行
なうことが望ましい。クローン化の方法としては、限界
希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法を用いることがで
きる。また螢光活性化細胞選別装置を用いてり［〕−ジ
ンの際の細胞の分離を行なうことも可能である。また、
長期間培養の間に起こる変異株の出現に対し、時々クロ
ーン化を行くｒうごとで元の細胞の性質をもった細胞を
保存することが−１Ａ　− できる。以上のような製造方法に従って作製したヒト前
立腺癌に対する抗体を分泌するハイブリドーマの例とし
ては、後述の実施例に示すようにＰ−００１，Ｐ−００
２，Ｐ−００３またハＰ−００４が挙げられる。

本発明のハイブリドーマは、対数増殖期において、凍害
防御物質として５％（Ｖ／Ｖ）のジメチルスルホキシド
を添加した生胎児面油中に１〜１０×１０　　個／ｍ＋
に懸濁して凍結することで長期間保存することができる
。その場合、凍結時の冷却速度は−１℃／分であること
が望ましく、また保存は一８０℃以下で行く【うのが好
ましい。

解凍はなるべくすみやかに行なうのがよく、融解後直ち
に細胞を培地で洗浄してジメチルスルホキシドをとり除
けば、そのまま通常の培地に懸濁して培養を再開するこ
とができる。但し解凍した時点での細胞の生存率が悪く
、増殖活性が著しく低い場合には、適宜マウス牌細胞な
どを加える必要がある。

Ｄ、紀水の製造： 抗体の製造にあたっでは、ヒト前立腺癌細胞に対する抗
体を産４−するハイブリドーマを、インビトロまたは生
体内（インビボ）で培養する。

インビトロの培養の場合には、本発明のハイブリドーマ
増殖のために適当な栄養培地、１＝とえば１０％（Ｖ　
／　Ｖ　）　（７）　生胎児血ｍ、５ｘｌＯＭ（ｆ）Ｂ
−メルカーゾトエタノール、１ｍＭのビルヒン酸ナトリ
ウムおよび抗生物質を含有したＲ　ＰＭ　Ｉ　１６４０
培地を用いることができる。また、ＲＰＭ　Ｉ　１６４
０培地に代えて、４，５ａ／ｌ−のグルコースを含むＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｅａｇｌｅ
’ｓ　　ＭＥＭ　（以下、Ｄ−ＭＦＭと略す）を用いて
もよい。細胞を増殖さする時の適当な初期濃度は、各々
のハイブリドーマによって異なるが一般に約１０９個／
ｍｌであり、培養中の細胞濃度は２Ｘ　１０’個／ｍ＋
を越えないことが望ましい。

また、本発明のハイブリドーマを生体に移植して固型ま
たは腹水型で増殖させ、その生体より体液、望ましくは
血清または腹水を採取することにより、該ハイブリドー
マが分泌する抗体を製造することができる。この方法に
よって得られる粗製抗体液は、不純物として宿主となっ
た生体由来の種々の物質を含むという欠点をもつ一方、
生体外（インビトロ）の培養によって得られる抗体液に
比べて著しく高濃度の目的抗体を含むという点で優れて
いる。ハイブリドーマを腹腔に移植して増殖さゼる場合
においては、移植の前、好ましくは３〜９週間前にブリ
スタン（２，６，１０，１４−テトラメヂルペンタデカ
ン）を腹腔内に投与しておくことにＪ：す、粗製抗体液
の収量を高めることができるが、この処置は必須ではな
い。なお、宿主として用いる生体は、移植するハイブリ
ドーマの親細胞１７− と同種同系の動物が望ましい。この場合には、通常、特
別の処置をｌノなくてもハイブリドーマはその牛体内で
増殖するが、ハイブリドーマと宿主の組織適合性抗原型
が一致しない場合、一般に宿主生体に抗リンパ球抗体投
与、Ｘ線照射等の処置をあらかじめ施しておくことが必
要である。移植後、細胞が生長してくるまでに通常１週
間から３週間を要する。

ハイブリトーンを生体外または牛体内で培養して抗体を
産生分泌ざぜる時に、放射性同位元素標識のロイシンま
たはりシン等の放射活性物質を培地中に添加または宿主
に投与することにより、分子内部に放射活性物質を含み
、化学構造が非標識物と全く変わらない抗体を製造する
ことができる。

本発明の製造方法に従って製造したヒト前立腺癌に対す
る抗体の例として、後記表−１に示すハイブリドーマが
分泌する抗体が挙げられる。その−１Ｑ　− 特巽性、免疫グロブリンクラスは後記表−２に示す通り
である。

本発明の抗体は、粗製抗体液のまま使用してもよいが、
硫酸アンモニウム分画法やイオン交換クロマトグラフィ
ーなど免疫グロブリン精製の常法に従って、或いは、ｐ
　ｒＯｔｅｉｎ　　Ａや抗原によるアフィニティクロマ
トグラフィー等により精製して用いることができる。

また、これらの抗体は必要に応じて混合して用いること
もできる。

以下、具体的な実施例を述べる。

長期インビトロ継代培養ヒト前立腺癌細胞８ＰＣ９３２
Ｘ１０　　個を、１００ｍｍ培養皿（Ｆ　ａｌｃｏｎ　
３００３）中で、イーグルスＭＥＭアール塩（以下ＭＦ
Ｍと略）に１０％（Ｖ／Ｖ）牛脂児血清おＪ、び抗生物
質硫酸カナマイシン（最終濃度６０１１１（１／　ｌ−
）を添加した培地で、３７℃、５％炭酸ガスを含む湿っ
た雰囲気中で培養した。３１］後、細胞をポリスマンＣ
剥離し、培養」−清を遠心で除ぎ、さらに、リン酸緩衝
生理食塩水（ｐｌ−１７，２、以下ＰＢＳど略）で遠心
分１１１１洗浄後、ＰＢＳに！！！濁させた。１枚の培
養■より約２×１０　　個の細胞が得られた。

（２）骨髄腫細胞の培養 マウス骨髄腫細胞５１１２１０−ΔＣＪ１４１０　　個
／ｍｌを、Ｄ−ＭＦＭに牛胎児血清１０％（Ｖ／Ｖ）、
ピルビン酸１ｍＭ、グルタミン２ｍＭおよび硫酸カナマ
イシン６０ｍａ／Ｌを添加した培地で培養し、３日ごと
に継代した。Ｓ　ｒ１２／　Ｏ−Ａ　＜１１／ｌは、細
胞融合を行なう前日に２．５Ｘ　１０　　個／ｍ＋に細
胞濃度を調整し、上記の培地で培養した。

（３）８ＰＣ９３細胞による免疫 雌性Ｂ　Ａ　Ｌ、　ｌ’３　／　ｃマウス（日本ヂャー
ルズリバー社、９週令）に０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁し
た上記（１）の８ＰＣ９３細胞１０　　個を２回、約３
週問おきに腹腔内に注射することで免疫した。

（／ｌ）細胞の融合 細胞の融合を１（６ｈｌｅｒおにびＭ　１ｌｓｔｅｉｎ
の方法に摩じて実施した（　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
ｓ　　：　Ｃ１ｉｎｉｃａｌＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｔ　ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　１９８０’
ｓ　ｅｄ。

ｂｙ　　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｒ，Ｍ、ｅｔ　ａｔ、、　
Ｅ、　Ｓ、　ＡｌａｎＲ，Ｌｔｓｓ、Ｉｎｃ、　Ｎ、　
Ｙ、、　１９８０．　ｐｐ３０１〜３２４　）。

最終免疫後４日目にマウスを層殺し、牌を取り出し、よ
くほぐした後、１５０メツシユのステンレスメツシュに
通し、４００ｘｇで遠心分離後、沈澱した細胞に０．７
４７％塩化アンモニウムを含むトリス・塩酸緩衝液（０
，０１７Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
、　　１ｌｌ−４７，６５）を加えて赤面２１− 球を除去し、遠心（４００ｘｇ　）で牌細胞を集めた。

ＭＥＭを加えて遠心分１１１ｆｔ　（４００ｘｇ　）を
行ない、細胞を新たなＭＥＭに懸濁する操作を３回繰り
返すことで洗浄し、最終的にＭＥＭに懸濁した。

５ｔ）２１０−Δｇ１４は培養容器にリビペツフイング
ではがし、遠沈管に移した。遠心分離（４００Ｘ！Ｊ　
）後、集めた細胞にＭＥＭを加えて懸濁、遠心分離（４
００Ｘｇ　）することで白酒を除去した後、ＭＥＭに再
懸濁した。上記牌１胞１０Ｘ１０７個ど５ｐ２１０−Ａ
　０１４　２Ｘ　１０７個を混合し、よくピペッティン
グした後、遠心分ｌ１１ｔ　（４００ｘｇ　）　Ｌ、た
。上清を除いた後、軽く遠沈管をたたくことで沈澱をほ
ぐした。ＭＦＭに３０％（Ｖ／Ｖ）のポリエチレングリ
コール（Ｐ　Ｆ　Ｇ　１０００）を加えたものを３７℃
に保温し、その０．６ｍｌをほぐした細胞に加えた。ゆ
るやかに撹拌後、５分間室温に冒いた。７Ｘｇで遠心を
２分間行なった後、ＭＥＭをゆっくりと５ｍ１添−’；
）’ｌ）− 加した。ゆるやかに撹拌後、４００Ｘ　ｇで５分間室温
で遠心した。上清をすて、沈澱に５ｍｌのＭＥＭを加え
、同様に遠心分離し、上清を除去した。沈澱した細胞に
５ｍｌの次の培地を加え、ピペッティングした。培地と
しては、ｌｌ−ＭＥＭに、１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清
、２ｍＭのグルタミン、５×Ｓ １０　　Ｍのβ−メルカプトエタノール、６０ｍｇ／　
Ｉ−の硫酸カナマイシンを加え、さらにグルコースを４
．５（＋／ｌ−となるように添加したものを用いた。

なお、この培地をＤ　−Ｍ　Ｆ　Ｍ　−Ｆ　Ｂ　Ｓと略
称する。

−、ｈ記１０ｍ１の細胞懸濁液に４０ｍ１のｒ）−ＭＥ
Ｍ−ＦＢＳを加え、ぞの２５ｍ１ずつを２５ｃｍ　２培
養フラスコ（コーニング社、Ｃ−２５１００）に分注し
、たてて３７℃で、炭酸ガス５％を含む湿った雰囲気中
で１晩ｊｐ養した。なお、培養は以下同様の条件で行な
った。翌日、軽くピペッティングをした後、遠心管に移
して、４０＋’ＩＸ　Ｇで遠心分離を行なった。上清を
除去した後、１×１０〜′Ｍヒボヤザンチン、４×１０
　　Ｍアζノブテリンおよび１．６Ｘ１０”Ｍチミジ−
７− ンを含むＤ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ　−にＩＴ（Ｓ（以下、ｌ−
１’ＡＴ培地と略す）　６０ｍ１に懸濁し、その０，１
ｍｌを９６ウエル培養用プレート（［二ａｌｃｏｎ　３
０７２）の各つ■ルに入れ、１週間培養した。その後、
２５μｍの１−ＪＴ培地を２０又は３０ごどに添加した
。ＬＩ　Ｔ培地としては１−ＩＡＴ培地からアミノプラ
ーリンを除いたものを用いｌこ　。

Ｂ、抗体産生ハイブリドーマの選択および増殖細胞融合
後、２週間めに酵素結合同相免疫測定法で、各ウニルー
ト油中の８ＰＣ９３細胞に対する抗体産生の有無を調べ
た。

ＲＰＣ９３１１１１胞をプレー１−　（Ｆ　ａｌｃｏｎ
　３０？２）に固定し、」二記各つ■ル中の培養上清４
０μｍと室温で２時間反応させた後、よ＜　Ｐ　ＲＳ　
’ｒ洗浄し、馬血清で１０００倍に希釈したペルＡ：ｔ
シダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｃａｐｐｅ
ｌ　Ｌ　ａｂ、　　Ｉ　ｎｃ、。

アメリカ、カタログ番号３２１１−０２３１）　　１０
０μｍと２時間反応させ、その後、よ＜ＰＢＳで洗浄し
た。

クエ＞Ｒ緩衝液（０，１Ｍ、　　ｌ）Ｈ４，５）　ニ基
質（０−フェニレンジアミン）を１１Ｈ／ｍ！および３
１％過酸化水素水を０．４μｍ／ｍ１加えた溶液を２０
０μｍ入れ、３０分発色反応を行なわせた。８ＰＣ９３
細胞と反応する抗体を含有する２ウエルにつきクローン
化を行なった。クローン化は、限界希釈法を用い、以下
の通りに行なった。

抗体産生陽性の２ウエルのハイブリドーマ１００個をそ
れぞれＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ中に懸濁し、一方、上記Ａ（
４）の融合に使用したと同様の方法で、ＢＡＩＢ／Ｃマ
ウスより牌細胞１０　　個をＤ−ＭＦＭ−ＦＢＳ中に調
整し、２種の細胞を混ぜ合せた。細胞密度５Ｘ１０６個
／ｍｌとなるようにＤ−ＭＦＭ−ＦＢＳを加え、０．２
ｍｌを９６ウエル培養プ２５− レート（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３０７２）の各ウェルに入れ
、培養した。培養開始１／１日後に、−に記の酵素結合
固相免疫測定法でハイブリドーマの抗体産生の有無を各
つ１ルにつき検問した。その結果、表−１に示した４株
を含め、総計３８株のハイブリドーマが得られ　ｌこ　
。

Ｃ０抗体の生産＝　（インビトロ培養による生産）ハイ
ブリドーマＰ−００１，Ｐ−００２，Ｐ−００３または
ｐ−００４を、２０％生胎児血清、　２ｍＭグルタミン
。

１ｍＭピルビンｉｌ、　　４．５ｇ／Ｌのグルコース、
　　５Ｘ１０　　Ｍのβ〜メルカプ１〜■勺ノールおに
び５０１１１Ｑ／Ｌの硫酸カナマイシンを含むＤ−ＭＥ
Ｍに、１×１０５個／ｍｌになるように懸濁させ、この
細胞懸濁液２５ｍ１を７５ｃｍ　ｉ絹織培養用フラス］
（］−ニング社、アメリカ）に分注し、３７℃で５％炭
酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を行なった。増殖
がほぼ定常に達した４目目に、培養上清を採取した。

−リＲ− この時の細胞数はいずれも約２×１０　　個／ｍ！であ
り、上清の抗体含量は各々３．１μ（Ｊ　／ｍｌ、　　
２．８μ０　／ｍｌ、　　２．８μｑ／ｍｌ、　　２．
５μ（Ｊ／ｍｌであった。

（インビボ培養による生産）ニブリスクン（２，６゜１
０．１４−テトラメチルペンタデカン）　　０．５ｍｌ
を腹腔内に投与後１０日から３０日口のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に、インビトロで増殖させたハイブリドー
マＰ−００１，Ｐ−００２，ｐ−００３またはＰ−００
／ｌを５×１０６個接種した。接種後２ないし３週日に
腹水を採取し、遠心分＠　（１０００Ｘσ、４℃、１５
分間）にＪ：り腹水上清を得た。各ハイブリドーマにつ
き１０匹のマウスから約３０ｍ１の腹水上清が得られ、
その抗体含量は各々２．５ｉｎｇ／　ｍｌ、　　２．０
ｍ（１／　ｍｌ、　　１．５ｍｇ／ｍｌ、　　１．８ｍ
Ｍｍ１であった。

これら４株の形状、大きざ、性状を表−１に示す。

なお、これら抗体を１群１０匹のＩＣＲマウスに２（１
／　ｋｏ経口、４００ｍｇ／　ｋ（Ｉ腹腔内または２０
０ｍ！＋／　ｋ（］静静脈内絡し、１４日間１察したと
ころ、これら抗体による死亡は全く認められなかった。

表−１ ２９一 実施例２　ヒ１〜前立腺癌細胞に対す今ヨ邑コ木の特ｆ
１インピ１へ［］で継代されている次の細胞を用いた。

ｌ　ｎｔｅｓｌ：ｉｎｅ　４０７　（ヒト胎児小腸細胞
株）　、Ｋ−５６２（ヒト白血病細胞株）、Ｂｒ１７（
ヒ１〜末梢面すンパ球株）および８ＰＣ９３（ヒ１〜前
立腺癌細胞株）。

実施例１で１ｑられた培養上清を用いて、２Ｌ記細胞と
の反応性を酵素結合同相免疫測定法により調べた。表−
２に示す如＜８ＰＣ９３に極めて特巽的な抗体が得られ
た。

Ｂ、！光抗体法による細胞染色 ハイブリドーマの１つｐ−００２が分泌する抗体を用い
て、８ＰＣ９３細胞を間接螢光抗体法で染色した。

８ＰＣ９３細胞を無螢光のガラススライドに固定し、培
養上清５０μｍと３７℃、４５分湿った雰囲気中で反応
さけた後、ＰＢＳに１％牛血清アルブミン、１０　ｍＭ
　　１−ＩＦＰＦｓ　（Ｎ−２−ＬニドＤキシエチルヒ
ベラジンーＮ゛−２−エタンスルホン酸）および０．１
％アジ化す１〜リウムを添加した溶液に、３分から５分
処理することで洗浄を３回行なった。フルオレッセイン
結合抗マウスＩ　（Ｊ　Ｇ　（Ｍ　１ｌｅｓ　−Ｙｅｄ
ａＬｔｄ、、イスラエル、　コート番ｇ　６５−１７１
　）を２０倍希釈した溶液５０μｍと、上記と同じ条件
でさらに４５分反応させた。洗浄も同様の手法で行なっ
た。乾燥させた後、炭酸緩衝・グリセリン液（０，０５
Ｍ。

Ｉ）Ｉ−１９，５，１０％グリセリンを含む）を重層し
、カバーグラスをのせ螢光顕微鏡（オリンパス、モデル
Ａ　Ｉ−ｆ−ＲＦ　Ｌ　−Ｌ　Ｂ　）で検鏡した。その
結果、８ＰＣ９３細胞表面で強い螢光が観察された。な
お、使用したフルオレツセイン結合抗マウスＴａＧは、
あらかじめ８ＰＣ９３細胞で６回吸収操作を行なっｌこ
　。

Ｃ０免疫グロブリンクラスの町ζ 抗体の免疫グロブリンクラスの同定を酵素結合同相免疫
測定法で行なった。ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫
グロブリン抗体として、抗免疫グロブリン（Ｉｏ）、抗
１（ｌ　Ｇ、抗１（Ｉ　Ｍ　（いずれもＣａＩｌｐｅｌ
　ｌ−ａｈ、　　Ｉ　ｎｃ、、アメリカ、カタログ番号
３２４１−０２３１．３２１１−００８１．３２１１−
０２０１　）を用いた。

検討した４種の抗体は、いずれも表−２に示したように
■ｇＧであった。

３１− 表−２ ＋：反応陽性、−二反応陰性 （組人弁！士今　　村　　　元 ３２− 第１頁の続き ０発　明　者　斎藤健− 東京都新宿区百人町３−２６−１ ２０４ ■発　明　者　小林端彦 東京都新宿区百人町３−２６−１ １０２ ０発　明　者　知久友子 流山土木１４１０−２ ■発　明　者　松永謙− 東京都新宿区百人町３−２６−１ −３０３ ０発　明　者　藤井孝美 東京都足立区東和５−１１−２１ ０発　明　者　吉汲親雄 国立市東２−１９−４６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞とインビトロにお
   いて長期継代培養可能な細胞とからハイブリドーマを作
   製し、該ハイブリドーマが分泌する抗体を採取すること
   からなるヒト前立腺癌細胞表面抗原に対する抗体の製造
   法。 〈２）　該抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞が牌細胞、リン
   パ節細胞、末梢面白血球またはそれらの混合物であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）　該抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞がマウス由来細
   胞であることを特徴とする特許請求の範囲第１項または
   第２項に記載の方法。 〈４）　該抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞がＢＡＩ−Ｂ／
   Ｃ７１クスまたはその交雑マウス細胞であることを特徴
   とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。 （５）　該長期継代培養可能なｌ１ｌｌ胞が骨髄腫細胞
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃〒第４
   頂のいずれかに記載の方法。 （６）　該長期継代培養可能な細胞が、チミジンキナー
   ゼまたはヒボキ勺ンチングアニンホスホリボシルトラン
   スフエラーゼ欠損株骨髄腫細胞であることを特徴とする
   特Ｆｒ請求の範囲第５項に記載の方法。 （７〉　該長ｔｉｌｌ紺；代培養可能な細胞がマウス由
   来細胞で゛あることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   乃至第６項のいずれかに記載の方法。 （８）　該長期継代培養可能な細胞がＰ　３−Ｘ　６３
   −Ａｇ３、Ｐ　３−Ｎ　Ｓ　Ｉ　／　１−Ａ　ｇ４−１
   ．５Ｄ２１０−Δ（７１，’ＩまたはＸ６３−△Ｑ　８
   　、６．５３細胞であることを特徴とする特許請求の範
   囲第７項に記載の方法。 （９）　該抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞が、ヒ１〜前立
   腺癌細胞で免疫した動物由来の細胞であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記載
   の方法。 （１０）　　該抗ヒ１へ前立腺癌抗体産生細胞と該長期
   継代培養可能な細胞を融合させる過程において、融合促
   進剤としてポリエチレングリコールを用いることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに記
   載の方法。 （１１）　　該ハイブリドーマを、ヒポキサンチン、ア
   ミノプテリンおよびデミジンを含有する培地中で」８養
   することに」：す、選択的に生育させることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載
   の方法。 （１２）　　該ハイブリドーマをクローン化して単一の
   クローンに分離することを特徴とする特ｈ′ｒ請求の範
   囲第１頂乃至第１１項のいずれかに記載の方法。 〈１３）　　該ハイブリドーマのクローン化に際し、限
   界希釈払、軟寒天法またはフィブリングル法を用いるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１２項に記載の方が１
   ゜ （１４）　　該ハイブリドーマをインビト【１で培養し
   て抗体を分泌させることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項乃至第１３１０のいずれかに記載の方法。 〈１５）　　該ハイブリドーマを生体内に移植して、そ
   の動物の体液から抗体を分離することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項乃金策１３項のいずれかに記載の方法
   １゜ （１６）　　該体液が血清または腹水であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 （１７）　　該ハイブリドーマを移植引る動物がマウス
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１５項または
   第１６項に記載の方法。 （１８）　　該ハイブリドーマを移植する動物がＢへＬ
   　Ｂ　／　ｃマウスまたはその交雑マウスであることを
   特徴とする特許請求の範囲第１７項に記載の方法。 （１９）　　該ヒ１〜前立腺癌細胞がヒト前立腺癌細胞
   株８ＰＣ９３であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項乃至第１８項のいずれかに記載の方法。 （２０）　　特許請求の範囲第１項乃至第１９項のいず
   れかに記載の方法で製造されたヒト前ｑ腺癌細胞表面抗
   原に対する抗体。 （２１）　　ハイブリドーマＰ−００１，Ｐ−００２，
   Ｐ−００３またはｐ−ｏｏ４より分泌されることを特徴
   とする特許請求の範囲第２０項に記載の抗体。 （２２）　　抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞とインビトロ
   において長期継代培養可能な細胞とから作製されるヒト
   而立腺癌細胞表面抗原に対する抗体を分泌するハイブリ
   ドーマ。 （２３）　　ハイフリト−ｖＰ−００１，Ｐ−００２，
   Ｐ−００３５− またはＰ−００／ｌであることを特徴とする特許請求の
   範囲第２２ｍに記載のハイブリドーマ。