JPS59190663A - 過酸化物活性化物質測定用組成物及び試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、試験試料中の過酸化物活性化物質測
定用分析試験、並びに特に、高い保存安定性を有する。

かかる測定のための改良試験組成物および試験具に関す
ると共に、該改良組成物および試験具の製造方法および
使用方法に関する。

多くの分析方法が、尿、糞便懸濁液および胃腸内容物の
ような生物学的試料中の過酸化物活性化物質の存在を検
出するために利用することができる。ヘモグロビンおよ
びその誘導体は酵素ペルオキシダーゼと類似した挙動を
するので、それら４ｉかかる′°過酸化物活性化”物質
の典型例である。

かかる物質はまた、偽ペルオキシダーゼとも呼Ｉｆれて
いる。すなわち、それらは、過酸化物類と、ベンジジン
、Ｏ−トリジン、３．３’　、５，５°−テトラメチル
ベンジジン、２，７−ジアミツフルオレンまたは類似の
物質のような指示薬化合物との間のレドックス反応の触
媒として働き、それによって変色のような検出可能な応
答を生ずるという点で酵素に類似している。したがって
、試験試料中の潜血の存在を測定するための方法のほと
んどは偽ペルオキシダーゼ活性に基づく。

呈色指示薬を過酸化物によって酸化する際の酵素様触媒
作用に基づいた分析試験法が、ここ何年にわたって発展
してきている。これらには、湿式化学法すなわち溶液法
およびいわゆる゛浸漬−読取り°′型試薬含有細片試験
具を用いる方法がある。　前者のうち、典型例は、リチ
ャード・エム拳ヘンリー（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｍ、　Ｈｅ
ｎｒｙ）等、Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１ｎｉｃａｌＣｈｅ　Ｐ
ｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　
、第２版、（ハーゲルスタウン、メリーランド：ハーバ
−およびロー（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ、　Ｍａｒｙｌａ
ｎｄ　：　Ｈａｒｐｅｒａｎｄ　Ｒｏｗ）　、　ＩＦ７
４）　１１２４−’１１２５頁に述べられている。この
方法では、氷酢酸（緩衝剤）、ジフェニルアミン（指示
薬）および過酸化水素を用いる。

かかる湿式法は分析上の有用性を立証してきたが、それ
にも拘らず、それらは試薬の安定性が低く感度が適切で
ないというような欠点を有する。

過酸化物活性化物質の測定のための別の方法で、現在多
くの臨床検査技師に好まれているものでは゛浸漬−読取
りパ固相試薬細片試験具を用いる。かかる試験具の典型
的なものは、ヘマスチックス（ＨＥＭＡＳＴＩＸ＠）の
商標名で、マイルス・ラホラトリーズｅインコーボレー
テッドのエイムダ０テイビジヨン（ＡＩＩＩｅｓ　Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、Ｉｎｃ、）より市販されているものである。それ
らは木質的に、プラスチック細片または把手に固着され
た多孔性の紙マトリックスよりなる。このマトリックス
は有機ヒドロペルオキシド、例えば、クメンヒドロペル
オキシドと指示薬化合物の緩衝化混合物で含浸される。

ヘモグロビン、ミオグロビン、赤血球または他の偽ペル
オキシダーゼのような分析対象物を含有する液体中に浸
漬すると、マトリックスに青色が発現し、その強さは試
料中の過酸化物活性化物質の濃度に比例する。かくして
、マトリックスに発現した色を標準カラーチャートと比
較することにより、検査技師は、半定量的に、試料中に
存在する分析対象物の量を測定することができる。

試薬細片を用いる方法は湿式化学法に比べて多くの利点
を有しており、試薬調製も付属装置も必要としないので
遥に使いやすく；また試薬が乾燥した固体状態なので試
薬の相対的安定性が大きく、結果として精度、感度およ
び経済性が改良される。しかしながら、多くの従来の、
現在利用しうる試薬細片試験具は保存寿命が限定される
という重大な欠点がある。すなわち、製造後長期間にわ
たる保存安定性が欠如し、試験具を使用する際、過酸化
物活性化分析対象物の存在に対する反応性が著しく減少
する結果となる。すなわち、試薬細片のような分析具は
、通常、製造直後には使用されず、使用までの保存期間
がまちまちであるために、かつ、従来の試薬細片の製造
と使用との間の期間があまりに長く、反応性が著しく失
われる結果となり、誤った負の試験結果を導くために、
高い保存寿命は著しい長所となりうる：保存寿命が長け
れば長いほど、分析結果の信頼性は高いものとなる。

過酸化物活性化物質、例えば、尿中の潜血またはヘモグ
ロビンを測定するための従来の固相試薬細片試験具では
、通常には、指示薬系として、有機ヒドロペルオキシド
、例えば、クメンヒドロペルオキシドによる、ポリフィ
リンを触奴とするベンジジン系指示薬、例えば、ｏ−）
リジンまたは３．３’、５．５’−テトラメチルベンジ
ジンの酸化を利用する。しかしながら、このような従来
の試験細片は、長い保存期間中または高温での保存中に
反応性を喪失する傾向が特にあることが知られており、
この現象は、細片の１またはそれ以上の試薬成分の蒸発
または化学分解に因るものと信じられている。雰囲気温
度で保存されたこのような従来の試薬細片において、反
応性の実質的低下が観察されるばかりでなく、高温での
保存によって、これらの低下は実質的に強調され、かつ
、低下の割合も加速されるようである。試薬細片中の反
応性の低下についての説明として可能なものは次のもの
である：（１）試薬組成物の主成分が分解または蒸発し
て、成分濃度が適切な反応性を維持するのに必要な最低
濃度以下に落ちる；お゛よび（２）細片中の２またはそ
れ以上の成分が有害的に相互反応して、反応性のないま
たは妨害性のある１またはそれ以上の新しい種を生成す
る。

試薬組成物、およびそれから製造される過酸化物活性化
物質測定用の固相細片試験具の反応性を安定化する試み
は種々のアプローチをたどってきている。例えば、アダ
ムス・ジュニア　（Ａｄａｍｓ　。

Ｊｒ、）等の米国特許第３，０９２，４８３号は体液中
の潜血を検出するだめの改良試験組成物および試験具を
開示している。この組成物は、コロイド物質製の微球形
状の泡中にカプセル化またはトラップ化された有機ヒド
ロペルオキシド、有機ヒドロペルオキシドからの酸素の
移動を受容してヘモグロビンの補欠分子族の触媒作用に
より誘起される呈色応答を生ずることのできる指示薬ま
たは色素前駆体、および試験される物質のｐＨを４から
６．５の範囲に維持するための緩衝剤よりなる。この特
許は、ヒドロペルオキシドをカプセル化またはトラップ
化するために用いるコロイド物質、例えば、ポリビニル
アルコール、ゼラチン、アラビアゴムまたはカルボキシ
ビニルポリマーにより、該組成物より製造された試験具
の好ましい実施態様での反応性を、７５°Ｃで３００時
間の保存後でさえも安定化することができ、それに対し
てヒドロペルオキシドのカプセル化なしに製造した同様
の試験具は５０℃で２４時間後には反応性が低下するこ
とを開示している。

安定化された試験組成物および試験具の別の開示として
は、アダムス台ジュニア（Ａｄａｍｓ、　Ｊ　ｒ　、　
）等の米国特許第３，２５２，７０２号のアプローチが
あり、そこでは、用いられた有機ヒドロペルオキシドが
コロイド物質、例えば、ジアルデヒド多糖類で固定する
ことによって硬化されたゼラチンのようなコロイド状物
質中にカプセル化されている。このようにカプセル化さ
れたヒドロペルオキシド、適切な指示薬および緩衝剤を
含有するかかる組成物は、種々の悪影響のある温度条件
のもとで高い安定性を示すといわれている。

かかる試薬細片試験具の安定化についての、更に別に開
示された試みとしては、Ｃｅｍ１ｃａｌＡｂｓｔｒａｃ
ｔｓ　８５巻、１８６頁（１９７Ｂ）の詳説があり、こ
れは、０−トリジンおよびフェニルイソプロピルヒドロ
ペルオキシドを含有する試薬細片を製造するための２段
階−浸漬法について述べている。この開示は、指示薬（
Ｏｎリジン・２　ＨＣ：Ｌ）およびポリビニルビはリド
ンのエタノール溶液を調製することを報告している。こ
の溶液に少量の界面活性剤および十分な量のクエン酸塩
緩衝剤を添加して、ｐＨを３．７とし、その後エチル・
セルロースを含浸せしめたろ紙細片をこの溶液に浸漬し
乾燥した。

この含浸ろ紙を、次に、エタノール−トルエン混合物中
に溶解した１、４−ジアザビシクロ［２，２，２］−オ
クタン、フェニルイソプロピルヒドロペルオキシドおよ
びポリビニルピロリドンを含有する第２溶液中に浸漬し
た。この作業の目的はビシクロオクタン誘導体およびポ
リビニルピロリドンの使用により、ペルオキシドおよび
指示薬の組合せを安定化することであった。

同様の方法が米国特許第３，８５３，４７１号に開示さ
れている。この特許は、その置換アミド基が主にＮ−モ
ルホリン基であるリン酸アミド類またはホスホン酸アミ
ド類の使用を開示している。

安定化試薬組成物への別のアプローチとしては、クメン
ヒドロペルオキシドおよび指示薬と共に、種々の稀釈副
化合物、例えば、ジメチルスルホンおよびＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミドの混合物を用いる米国特許第４，０７
１，３１？号；同第４，０７１，３１８号（ホウ酸エス
テル類の使用）；および同第４．０７１，３２１号（稀
釈剤およびホウ酸エステル類の両者の使用）がある。

これらの一般概念にとっての重要な別の参考文献として
は、触媒および酸化剤として用いられる有機ヒドロペル
オキシド類の安定化に向けられている米国特許第３．２
３１３．８５０号がある。この参考文献は有機過酸化物
と共に一級、二級または三級アミン塩を使用することを
開示しており、固相試薬細片試験具の安定性の問題には
向けられていない。

湿式化学法と比べて固相試薬細片試験具固有の分析上の
利点、およびかかる細片試験具の反応性の安定化につい
ての従来技術における先に例示した利点にも拘らず、後
者の安定特性は、特に、過酸化物活性化物質の測定用試
験具の場合には、なお、更なる改良を必要としている。

現在の技術水準の、過酸化物活性化物質測定用固相組成
物および試験具の性質は湿式化学法および安定性向上技
法を全く含まないものより大幅に高められているが、そ
れにも拘らず、もしも化学的物質の添加、カプセル化に
よる試薬の隔離、またはかかる組成物および試験具の、
同様の比較的複雑かつ高価な処理を必要とせずに、長期
の保存中、より安定にすることができ、かつ、かかる保
存後も過酸化物活性化分析対象物に対して、より高い感
度を持たせることができれば、著しく有利なものとなる
であろう。例えば、従来、固相試験組成物および試験具
に用いられた公知の有機ヒドロペルオキシドにとっての
適切な直接的代替物、および長期の保存中、これら組成
物および試験具の試薬系をより安定にすることができる
代替物を提供することができれば当業界において大幅な
進歩となるであろう。

従来用いられるヒドロペルオキシド類としては、例えば
、クメンヒドロペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド、ジイソプロビルベンゼンヒドロペルオキド、２
，５−ジメチル−ヘキサン−２，５−ジヒドロペルオキ
シドおよびバラメタンヒドロペルオキシドが挙げられる
。しかしながら、かかる化合物にとっての適切な代替物
は、従来用いられる指示薬系の存在下で過酸化物活性化
物質（分析対象物）とのレドックス反応に同様に関与し
て変色または試験組成物による光吸収量または光反射量
の変化のような検出可能な応答を生ずることができるば
かりでなく、典型的に用いられる従来のヒドロペルオキ
シド類のそれに匹敵する程度にかかる反応性を示さねば
ならない。

過酸化物活性化物質測定用の従来の固相試薬組成物およ
び細片試験具の、保存安定性または”保存寿命”の欠如
をもたらす、反応性の低下がしばしば観察されるが、こ
れは試薬細片中に用いられる有機ヒドロペルオキシドの
喪失および／または化学分解に主に起因するものと現在
仮定されている。かかる喪失または分解は、例えば、ヒ
ドロペルオキシドの分解または蒸発、または他の細片成
分との化学相互反応から起こることがあるだろう。しか
しながら、分解、または悪影響を与える相互反応に起因
する崩壊が、はとんどの反応性低下の理由であろう。か
かる分解を引起す機構は現在解明されていない。

かかる試薬系に、ある置換クメンヒドロペルオキシド類
を有利に包含させることによって、現在の技術水準であ
る、慣用の過酸化物活性化物質測定用の試薬系を実質的
に改良し、かつ、かかる慣用系の前述の安定性について
の問題を大幅に克服することができることが現在発見さ
れており、かつ本発明はこの発見に基づくものである。

本発明によれば、従来技術において通常に用いられる、
有機ヒドロペルオキシド類の代りに、置換クメンヒドロ
ペルオキシドが用いられ、試薬、化学添加物等の隔離の
ような技法を用いる安定化組成物と比較すると、経済性
および信頼性が高められる結果となる。

過酸化物活性化物質測定用の従来の試薬系は、一般に、
有機ヒドロペルオキシドおよびｏ−トルイジンまたは３
−．３’　、５，５°−テトラメチルベンジジンのよう
なレドックス指示薬よりなる。過酸化物活性化分析対象
物は、酵素ペルオキシダーゼに似た挙動をするので指示
薬および有機ヒドロペルオキシドの間の反応において、
触媒として働くか、さもなければ反応に関与して、呈色
し、その強度が分析対象物の濃度を示唆するものである
。かかる従来の分析試薬系とは異なり、本発明によれば
、試験試料中の過酸化物活性化物質を測定するための改
良分析組成物が提供される。該組成物は、有機ヒドロペ
ルオキシド、並びに該有機ヒドロペルオキシドおよび過
酸化物活性化物質の存在下で検出可能な応答を提供する
ことができる指示薬より成り、ここで該有機ヒドロペル
オキシドは、式： （式中、置換基ｘ１、Ｘ２およびＸ３のいずれか１つは
炭素原子数１−６の低級アルキル基、Ｃ１、Ｂｒ、　Ｉ
　、　ＮＯ２もしくはカルボキシル基；または置換基Ｘ
、、Ｘ２およびＸ３のいずれか２つ（同一でも異なって
いてもよい）は、炭素原子数１−８の低級アルキル基、
ＣＩ、　Ｂｒ、Ｉ　、ＮＯ２もしくはカルボキシル基で
ある）を有する置換クメンヒドロペルオキシドである。

好ましい置換クメンヒドロペルオキシド類はｐ−クロロ
クメンヒドロペルオキシドおよびｐ−ブロモクメンヒド
ロペルオキシドであり；最も好ましいものはｐ−クロロ
クメンヒドロペルオキシドである。

本発明はまた過酸化物活性化物質を測定するための改良
分析試験具をも提供する。好ましい実施態様においては
、該試験具は本発明の改良組成物を包含せしめた担体マ
トリックスよりなる。置換クメンヒドロペルオキシドと
、組成物中に用いられる他のほぼ慣用的な成分との組合
せの総体的効果によって、該組成物の反応性を、特に雰
囲気温度および高温の双方での長期にわたる保存におい
て、著しく安定させることができ、かつ従来の組成物お
よび試験具と比較して、有利に高められた°°保存寿命
″をもたらすと同時に、試験試料中の過酸化物活性化分
析対象物の存在に対する優れた感度をもたらすというこ
とが信じられている。

すなわち、かかる分析対象物の正確な検出を可能にする
、組成物中の酸化剤としての機能の点で、本発明の置換
クメンヒドロペルオキシド類は、この目的のために従来
普通に用いられる公知のヒドロペルオキシド類と実質的
に同一の特性を示すことが判明している。

更に、本発明の分析具の使用法並びにその製造法が提供
される。好ましい実施態様においては、本発明の試験具
は分析下の液体試験試料中にそれを浸漬し、そこに生じ
た変色のような応答を観察することにより用いられる。

好ましくは、本発明試験具の製造法は、担体マトリック
ス、例えば、多孔性の紙に組成物成分の溶液または懸濁
液を包含せしめることよりなる。

本発明の開発の際、従来公知の方法論にたよらずに、従
来の試薬組成物および試験具の前述の安定性に関する問
題を克服するよう試みることが決定された。この目的の
ために、一連の置換ベンジル型ヒドロペルオキシド類を
、はぼ従来の有機化学法により先ず合成した。合成され
た化合物は、ヒドロペルオキシド官能基上に安定化効果
を付与することができると思われる芳香族環上の置換基
を示唆しており、もし試薬の不安定性が、化学的分解、
またはヒドロペルオキシドと他の試薬との慈影響を与え
る相互反応に起因するならば、電子吸引基の脱安定化効
果が試薬の不安定性の問題を克服するのであろうと現在
信じられている。

したがって、本発明の試験組成物および試験具において
使用するのに適切だと決定された置換クメンヒドロペル
オキシド類としては、 一般式： ） １式中、置換基×１、ｘ２およびｘ３のいずれか１つは
炭素原子数１−６の低級アルキル基、ＣＩ、Ｂｒ、　Ｉ
　、ＮＯ，、もしくはカルボキシル基；または置換基ｘ
１、Ｘ２および×３のいずれか２つ（同一でも異なって
いてもよい）は、炭素原子数１−６の低級アルキル基、
Ｃ１，Ｆｉｒ、Ｉ　、　ＮＯ２もしくはカルボキシル基
である）を有する七ノーおよびジー置換クメンヒドロペ
ルオキシド類、およびそれらの混合物が挙げられる。す
なわち、本発明によれば、適切な置換クメンヒドロペル
オキシド類としては、例えば、ｐ−クロロクメンヒドロ
ペルオキシド、ｐ−ブロモクメンヒドロペルオキシド、
ｐ−ニトロクメンヒドロペルオキシド、ｐ−カルボキシ
クメンヒドロペルオキシド、３，４−ジクロロクメンヒ
ドロペルオキシド、ｍ−クロロクメンヒドロペルオキシ
ド、０−クロロクメンヒドロペルオキシド、ｍ−イソプ
ロピルクメンヒドロペルオキシド、０−メチルクメンヒ
ドロペルオキシド、ｐ−メチルクメンヒドロペルオキシ
ドと共に種々の割合のこれらの混合物を挙げることがで
きる。更に、ｐ−クロロクメンヒドロペルオキシドおよ
びｐ−ブロモクメンヒドロペルオキシドが本発明では好
ましく、ｐ−クロロクメンヒドロペルオキシドが最も好
ましいが、上に構造式を定義したようなすべてのかかる
化合物は本発明に用い６るのに適切であることを認識す
べきである。かくして、特定の置換クメンヒドロペルオ
キシド、またはそれら化合物の混合物の選択は、この開
示を教示された普通の当業者の手腕内の通常の選択に任
される事柄である。

本発明に用いられる適切な置換クメンヒドロペルオキシ
ドは、市販されてもおり、またほぼ慣用の有機合成技法
を用いて市販材料から通常の技術者により容易に合成す
ることもできる。例えば、後述の実施例に示したような
、ｐ−クロロ、ｐ−ブロモおよび３，４−ジクロロ基を
有する置換クメンヒドロペルオキシド類は、ニー・マエ
ルッ力−（Ａ。

Ｍａｅｒｕｃｋｅｒ）、Ｏｒｇ、Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、
１４巻　２７０頁（１９８５）、エ　　ス　　・　　　
ト　　リ　　ペ　　ッ　　ト　　（Ｓ、Ｔｒｉｐｐｅｔ
ｔ）、Ｑｕａｒｔ、Ｒｅｖ。

（Ｌｏｎｄｏｎ）　、　１７巻４０６頁（１９Ｈ）、シ
ー−マーベル（Ｃ，Ｍａｒｖｅｌ）　、アールΦアＬ／
　７　（Ｒ，ＡＩＩｅｎ）およびシー・オーバーバーガ
ー（Ｃ，Ｏｖａ、ｒｂｅｒｇｅｒ）、’　　Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、５ｏｃ−６８巻、　１０８８頁（１８４Ｂ）
、および他の周知の有機化学文献に記載されているよう
な方法を用いて相当するアセトフェノン類より合成する
ことができる。例えば、ｐ−クロロアセトフェノンを、
０℃の乾燥テトラヒドロフラン中の、トリフェニルメチ
ルホスホニウムプロミドおよびｎ−ブチルリチウム／ヘ
キサンより合成されたメチレントリフェニルホスホラン
と反応させると、ろ過による精製、溶媒除去、および減
圧蒸留後、ｐ−クロロ−α−メチルスチレンを生成する
。エタノール中の酸化プラチナを用いて二置換二重結合
の水素化が、塩素置換基の水素添加分解を起さずに行な
うことができる。ろ過による精製、溶媒除去、および減
圧蒸留によりｐ−クロロクメンヒドロペルオキシドが生
成する。実質的に同一の、はぼ慣用の経路をとると、Ｐ
−ブロモ−および３，４−ジクロロクメンヒドロペルオ
キシド型を、例えば、本発明において用いるのに適切な
他の千ノーおよびジー置換クメンヒドロペルオキシド類
と同様に合成することができる。

本発明の組成物および試験具に用いられる置換クメンヒ
ドロペルオキシドの量は、決定的に重要なことではなく
、当業者の通常の選択に任される事柄である。すなわち
、この分析試験（分析）が、分析対象物についてのスク
リーニング用に計画されているか、または半定量分析用
もしくは定量分析用に計画されているかの要因次第で、
特定の分析情況において要求される程度に、組成物また
は試験具を、過酸化物活性化分析対象物の存在に対して
反応させるのに必要な化学反応および化学変化を可能に
するに十分な量を選択する。か力）る量は、例えば、米
国特許第３，０９２，１３７８号、第３．０９２，４８
３号および他の同様の開示のそれのように、従来公知の
半定量的調製物に用いられるクメンヒドロペルオキシド
のような、従来のヒドロペルオキシドの量と実質的に同
じでよく、これらの開示を、ヒドロペルオキシドの好ま
しい濃度範囲についての参考にすることもできる。した
がって、前述の有利性を達成するために、本発明の組成
物および試験具においては、任意の場合に、試験の機能
および感度に大きな影響を与えることなしに、従来の調
製物中の公知のヒドロペルオキシドを直接に、しかも選
択的な量を用しλて代替しうることを認識すべきである
。

先に示したように、適切な置換クメンヒドロペルオキシ
ドによって改良された本発明の試験組成物は、該置換ク
メンヒドロペルオキシドおよび過酸化物活性化物質の存
在下で、目視による力１、または器具手段によって検出
可能な、変色また４±他の応答のような検出可能な応答
を生ずること力（できる指示薬化合物を、更に少くとも
１つ含む。適切な指示薬としては、いわゆる”ベンジジ
ン系“化合物、例えば、ベンジジン、０−トリジン、３
．３°、５．５’−テトラ−（低級アルキル）ベンジジ
ン、２．７−ジアミツフルオレンまたは種々の比でこれ
らを混合したものが挙げられる。”低級アルキル”は、
メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびイソプロピル、並
びに種々のブチル、ペンチルおよびヘキシル異性体をは
じめとする、１力ζら６の炭素原子を有するアルキル基
を意味する。他の適切な指示薬としては、０−トルイジ
ン、ｐ−トルイジン、〇−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ
“−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン、　Ｎ、Ｎ’−
ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン、ｐ−アニシジン、
ジ−アニシジン、０−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ
−クレゾール、アルファーナフトール、ベーターナフト
ール、カテコール、グアヤコール、ピロガロール、また
はへテロ環式アジン系のもの、例えば、ビス−（Ｎ−エ
チル−キノール−２−オン）−アジンまたは（Ｎ−メチ
ルベンツチアゾール−２−オン）−（１−エチル−３−
フエニルー５−メストリアゾール−２−オン）−アジン
がある。しかしながら、指示薬として最も好ましいもの
は、３，３″、５．５’−テトラメチルベンジジンであ
る。

好しい実施態様においては、本発明の改良試験組成物を
担体マトリックス上に包含するか、または担体マトリッ
クスに包含せしめて、固相”浸漬−読取り”試験具を製
造する。かかる本発明の試験具は、試験組成物の溶液を
吸収剤マトリックス材に含浸させ、ついで、含浸マトリ
ックスを乾燥して、微細かつ均一な組成物成分の混合物
をこのようにマトリックス内に包含させることを含む種
々の公知の方法により製造することができる。

用いることができる適切な担体マトリックスとしては１
紙、セルロース４木、合成樹脂フリース、ガラス繊維紙
、ポリプロピレン・フェルト、不織布または織布等を挙
げることができる。担体マトリックスとして、本発明に
用いるのに最も適切で好ましいものは、ろ紙のような多
孔性の紙である。しかしながら、担体マトリックスとし
て用いるのに適切な材料の選択は当業者の通常の選択に
任される事柄であり、マトリックスは種々の物理的形態
をとることができ、それらのすべては本発明の範囲内の
ものとされることを認識すべきである。試験具の製造の
最も好ましい方法は、組成物成分が共に溶液または懸濁
液に混合され、この溶液にマトリックスを含浸または浸
漬し、ついで。

取出し乾燥を行なう、１工程方法でマトリックスを含浸
することである。乾燥された含浸マトリックスは次に、
両面粘着テープのような適切な手段により、例えば、長
方形のプラスチック細片よりなる担体部材の一端に固着
させることができ、細片の他端は使いやすくするために
把手として働く。

試験反応に積極的に関与する前述の試験組成物成分の外
に、用いられた指示薬を分散させるための溶媒、増粘剤
、湿潤剤、緩衝剤、乳化剤および他の周知のアジュバン
トのような更なる成分もまた本発明の試験組成物および
試験具に含有させることができる。すなわち、例えば、
増粘剤としては、ゼラチン、アルギン、カラゲーン、カ
ゼイン、アルブミン、メチルセルロース、ポリビニルピ
ロリドン等のような種々の材料を用いることができる。

湿潤剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムを用いるのが
好ましいが、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムまた
はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムのような長い
鎖状有機硫酸塩またはスルホン酸塩のいずれもまた用い
ることができる。緩衝系としては、酒石酸塩、リン酸塩
、フタル酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、またはコハク酸塩
緩衝剤を用いることができる。組成物は約５．５から７
．０のＰＨ値に緩衝化されることが好ましい。乳化剤と
しては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、カルボ
キシビニルポリマー等を用いることができる。指示薬を
懸濁するのに有用な有機溶媒としては、ジメチルホルム
アミド、クロロホルム、二塩化エチレン、ベンゼン、酢
酸エチル等のほとんどの非反応性、蒸発性溶媒を挙げる
ことができる。

使用に際し、試験具の含浸マトリックスは試料液体また
は試験されるべき物質の液体懸濁液中に浸漬し、ついで
、直ちに、引上げることができる。過酸化物活性化物質
が存在する場合は、試験組成物を試料と接触させると、
正の検出可能な応答、例えば、呈色反応を生じる。次に
、呈色応答を予め検量された標準色と比較して、試料中
に含まれる過酸化物活性化物質についての定量的評価を
行なうことができる。非溶血赤血球細胞のような非処理
過酸化物活性化物質は、通常無色のマトリックス上に点
もしくは斑点状の色として現われる。溶血赤血球細胞は
過酸化物質を活性化してマトリックスを一様に着色する
であろう。目視比較に加えて、種々の器具を用いること
もでき、それにより人間の眼による、色の主観的測定を
排除することにより、試験の精度を高めることができる
。

本発明の試験具は、溶液中ばかりでなく又糞便、胃腸内
容物等のような固相または半固相物質中の過酸化物活性
化物質の測定にもまた用いることができることを認識す
べきである。すなわち、例えば、固相または半固相物質
の薄層を試験具の担体マトリックスに塗布し、変色のよ
うな検出可能な応答をマトリックス甲で観察することが
できる。

改良された本発明の試験組成物および試験具は、従来の
試験組成物および試験具より、安定性が高いという点ば
かりではなく、また感度が高いという点で有利であるこ
とが見出されている。

好ましい実施態様においては１本発明の試験組成物は１
デシリツトル当たり０．０１５　ミリグラム（ｍｇ／ｄ
ｉ）の低濃度の尿中ヘモグロビンを検出することができ
ることが判明しており、これは１：ｉ、０００，０００
の血液稀釈に相当する。この高感度は、予期しない長所
であり、少なくとも、過酸化物活性化物質のための多く
の従来の技術水準の試験の感度に匹敵する。

」二連のように、本発明の組成物を種々の方法で適切な
担体マトリックスに包含せしめて、試験具を製造するこ
とができる。例えば、水、およびジメチルホルムアミド
、アセトン、エタノールまたはそれらの混合物のような
他の適切な溶媒の混合物に、成分を溶解または懸濁させ
ることができる。次に、かかる溶液または懸濁液をろ紙
担体マトリックスを含浸するのに用い□ることができる
。

担体マトリックスは、組成物中に浸漬するかもしくは、
例えば、ドクター・ブレードで組成物を塗布するか、イ
ンキとしての組成物を包含せしめることができるが、そ
の場合、試薬はマトリックス上に印刷される。

現在好まれている方法は、組成物成分の溶液または懸濁
液をろ紙に含浸することであり、好ましい溶媒は蒸留水
または脱イオン水および／またはジメチルホルムアミド
頁ＤＭＦ）である。かかる含浸は、１枚のろ紙を溶液ま
たは懸濁液に浸漬し、ついで空気炉中でろ紙を乾燥する
ことにより達成することができる。試験具を完成させる
ために、次に、乾燥ろ紙を一辺約０．６センチメードル
（ｃｍ）の正方形に裁断し、これを約０．６！１００１
１のポリスチレン・フィルム細片の一端に貼付する。貼
付は、スリー・エム・カンパニー（３％　Ｃｏｍｐａｎ
ｙ）より市販されているような、両面接着剤テープを使
用して達成される。

本発明の試験具の別の製造方法は、組成物成分のいくつ
かを含む水溶液をろ紙マトリックスに含浸させ、ついで
、置換クメンヒドロペルオキシドおよび指示薬を含有す
る有機第二溶液をマトリックスに含浸させる。すなわち
、この”二段階−浸漬”法においては、ろ紙を、第一溶
液で含浸し、乾燥し、ヒドロペルオキシドおよび指示薬
の第二溶液で再び含浸し、ついで二度目の乾燥を行う。

本発明の試験具の最も好ましい製造方法は、試薬（ヒド
ロペルオキシドおよび指示薬以外の）、緩衝剤、湿潤剤
等からなる組成物成分を含む第一水溶液を調製し、次に
、ヒドロペルオキシドおよび指示薬試薬をすべての残り
の成分と共に含む第二有機溶液を調製し、それに続いて
、二つの溶液を混合し、混合物にろ紙を浸漬し、乾燥さ
せることである。試験具はそこで上述のように完成され
る。

実施例 次の実施例は、本発明の概念および有利性を更に立証す
るために用意された。実施例は１本発明の試験具をいか
に製造し、いかに使用するかを説明することを意図して
おり、その範囲を制限するものとして理解すべきもので
はない。更に、本発明の好ましい実施例において用いら
れる置換クメンヒドロペルオキシドのための２はぼ慣用
の有機合成法が実施例に詳述されているが、これもまた
、単に説明のためであることを認識されたい。

普通の当業者は、これらについての教示および前述の参
考例を考慮すれば、かかる化合物を合成するための種々
の方法と同時に本発明に用いるための他の適切な置換ク
メンヒドロペルオキシド類を使用することができるであ
ろう。ここで表わされるすべての百分率（パーセント）
は、特に断わらない限り重量パーセントであり、水素化
および酸化以外のすべての反応はアルゴン雰囲気下で行
なわれた。

実」１倒」：　ｐ−クロロクメンヒドロペルオキシドを
包含する試験組成物および試験具 ａ、−クロローα−メチルス　レンの 乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　（ナトリウム／ベ
ンゾフェノンより蒸留したもの）５００　ミリリットル
（１）中のトリフェニルメチルホスホニウムプロミド（
７１，４グラム（ｇ）、２００　　ミリモル（ｍｍｏｌ
ｅ））のスラリーに、ヘキサン中の１．５５モル濃度（
Ｎ）のｎ−ブチルリチウム１２９ｍ１（２００＋ｓｍｏ
ｌｅ）を徐々に滴加した。反応混合物を−ｌＯ℃で３０
分間撹拌し、その後、乾燥ＴＨＦＩＯ（１ｍｌ中の４−
クロロアセトフェノン３０．９２ｇ（２００ｍｍｏｌｅ
）の溶液を徐々に滴加した。次に、反応混合物を一１０
℃で１時間撹拌し、雰囲気温度（約２３℃）まで徐々に
昇温し、次いで撹拌を一晩続けた。反応混合物をその後
ろ過し、次いで常圧で蒸留することにより溶媒を除去し
た。水流アスピレータを用いて蒸留すると、沸点（ｂｐ
）８２−８８℃のｐ−クロロ−α−メチルスチレン　１
８．５ｇ（５４，２％収率）を生成した。

ｂ、−クロロクメン パール（Ｐａａｒ）水素添加器を用いて、Ｐ−クロロ−
α−メチルスチレン　（１５，７ｇ、２０４■ｏｌｅ）
、酸化プラチナ２０ミリグラム（ｍｇ）、および無水エ
タノール２０１の混合物を、先ず３．０ｋｇ／ｃｍ２（
４２ｐｓｉ）の初期水素圧力で、約８時間振とうした。

この操作中に水素添加器・タンクに０．Ｈｋｇ／ｃｍ２
（１４ｐｓｉ）の水素を更に添加した。次に、反応混合
物をろ過し、ついで常圧で注意深く蒸留することにより
溶媒を除去した。得られた残査物質を水流アスピレータ
の減圧下で蒸留して、ｐ−クロロクメン（ｂｐ　８９−
７４’Ｃ）　１２．［１９ｇ（７４％収率）　ヲ生ｔ、
Ｌり。

Ｃ１−クロロクメンヒドロペルオキシドｐ−りｔｆｆ　
Ｃ７クメ７　（Ｈ，９０ｇ、２３９＋ｉｍｏｌｅ）　、
ステアリン酸２８５ｍｇ（１ｍｍｏｌｅ）　、炭酸ナト
リウム２．５８ｇ（２４，１ｍｍｏ　ｌｅ）　、および
８５℃の蒸留水１８０１の混合物に、ベンゾイルペルオ
キシド３８ｍｇを添加した。次に、酸素ガスを反応混合
物に４８時間通気し、反応混合物を冷却し、水１５０ｍ
　ｌを添加し、ついで生成物をペンタン１００ａ＋　１
ずつで３回抽出した。有機抽出物をろ過し、ついで溶媒
を真空除去した。この濃縮物質を冷（２５パーセント）
水酸化ナトリウム溶液７５ｍ１に注意深く添加し、２時
間放置した。次に、この物質を予め冷却したろ過器でろ
過し、ついでこノ固体をペンタン５０ｍ１ずつで３回洗
浄した。ろ過ケークを真空中で乾燥し、水に懸濁させ、
ついでｐ）ｌ値が８になるまで混合物中に炭酸ガスを通
気した。次に、反応混合物をペンタン１０ｈｌずつで３
回抽出し、ついで溶媒を真空除去した。ペンタンよりこ
の物質を再結晶すると、融点　（ｍｐ）３２−３３．５
℃のｐ−クロロクメンヒドロペルオキシド１．５２ｇ（
２，９％収率）を生成した。生成物のヨウ素滴定による
と、この物質は約８８パーセント純度のｐ−クロロクメ
ンヒドロペルオキシドであることを示した。

ｄ・　　　　　　　よび　　　　＝ 次の成分を、列挙した順に混合することにより第一溶液
を調製した： ２５　ｍｌ　　の蒸留水 ３．３４ｇ　　のホウ酸トリエタノールアミン；０．４
に攻０．５ｇ　　のラウリル硫酸ナトリウム；　１．（
Ｈ家０．０３４ｇのエチレンジアミン四酢酸ついで、次
のものを混合することにより第二溶液を調製した： ２５ｍ１　　のジメチルホルムアミド ０．２ｍｌの６−メドキシキノリン；　０．４％攻ベン
ジジン；　０．０３Ｍ末 ０．０５ｇのオレンジＧ　染料 求：混合溶液中の成分の最終濃度 第一溶液を第二溶液と十分に混合して、Ｐ−クロロクメ
ンヒドロペルオキシド約０．２Ｍ濃度の、本発明による
試験組成物を調製した。

前述の組成物から試験具を製造するために、１枚の実験
室用ろ紙シート［（ワットマン・スリーエムエム（Ｗｈ
ａｔｍａｎ　３ＭＭ）］を混合溶液ニ１ＪＨｉｔＬ、口
紙を取出し、空気炉中１０５℃で約８分乾燥することに
より、ろ紙に組成物を含浸′せしめた。０．６センチメ
ートル（ｃｍ）平方の乾燥含浸紙を裁断し、約０．８　
Ｘ　１０ｃｍのポリスチレンフィルム細片の一端に、−
片の両面接着剤テープ［スリーエム・カンパ、＝、　−
（３％　ＣｏｍｐａＢ）］　を用いて貼付した。

種々の濃度のヘモグロビンを含有する尿試料中で、上述
のようにして製造された本発明の試験具の試験を行なう
と、ヘモグロビン濃度に半定量的に対応するレベルの、
目視で認識されうる呈色を生じた。

ＬＬｆ！ｉｎ：　ｐ−ブロモクメンヒドロペルオキシド
を包含する試験組成物および試験具 ａ、−ブロモーα−メチルスチレンの ０°Ｃの乾燥Ｔ）ＩＦ　５００　ｍｌ中のトリフェニル
メチルホスホニウムプロミド（”／１．４　ｇ　、２０
０　ｍｍｏｌｅ　）のスラリーに、ヘキサン中の１．４
４Ｍのｎ−ブチルリチウム１３５ｍ１（２００＋ｕ＋ｏ
ｌｅ）を徐々に滴加した。反応混合物を０℃で３０分間
撹拌し、ついで、乾燥ＴＨＦ１００ｍ１中のｐ−ブロモ
アセトフェノン３９．８ｇ　（２００ｍｍｏｌｅ）の溶
液を徐々に滴加した。反応混合物を雰囲気温度まで徐々
に昇温するにまかせ、その後撹拌を一晩続けた。撹拌反
応混合物を次にろ過し、次いで常圧で注意深く蒸留する
ことにより溶媒を除去した。得られた残査をヘキサンで
希釈し、ろ過し、ついで蒸留によりヘキサンを除去した
。残渣物質を水流アスピレータによる減圧下で蒸留して
、ｂｐ　９５−９８℃のｐ−ブロモ−α−メチルスチレ
ン２３．２ｇ（５８，３％収率）を生成した。

ｂ、−ブロモクメンの パール（Ｐａａｒ）水素添加器を用いて、ｐ−ブロモ−
α〜メチルスチレン２３．２ｇ量（１１８ｍｍｏｌｅ）
　、酸化プラチナ約１００　ｆｆ１ｇ、および無水エタ
ノール１５０ｍ１を先ず３．５ｋｇ／ｃｍ２（５０ｐｓ
ｉ）の初期水素圧力で、４時間振とうした。次に、この
物質をセライト・プラク（ｃｅｌｉｔａ　ｐｌｕｇ）を
介してろ過し、ついで常圧で蒸留することにより溶媒を
除去した。得られた残査物質を水流アスピレータによる
減圧下で蒸留して、　ｂｐ　８８−９２℃（７）ｐ−ブ
Ｏ％　ｌ）　メ７１８．Ｉｌｌｇ（８０，４２収率）を
生成した。

Ｃ９−ブロモクメンヒドロペルオキシドｐ−ブロモクメ
ン（１８，９ｇ、！１１５　ｍｍｏｌｅ）、ステアリン
Ｈ１１５，８ｍｇ（０，４０８ｍｍｏｌｅ　）　、炭酸
ナトリウム１．０４ｇ（１０，８ｍｍｏｌｅ）　、およ
び８４℃の蒸留水８０　ｍｌの混合物に、ベンゾイルペ
ルオキシド１５ｍｇを添加した。反応混合物に４８時間
酸素を通気し、その後反応混合物を冷却し、水１５ｈｌ
で希釈し、ついで生成物をペンタン１００ｍ　ｌずつで
３回抽出した。合わせた有機抽出物をセライト・プラグ
を介してろ過し、ついで溶媒を真空除去した。この濃縮
物質を冷水酸化ナトリウム（２！Ｊ）溶液２５１に注意
深く添加し、２時間放置し、次に予め冷却したろ過器で
ろ過した。このろ過ケークをペンタンで洗浄し、ついで
洗浄固体物質を水に懸濁させた。ついでｐＨ値が８にな
るまで溶液中に炭酸ガスを通気した。

次に、反応混合物をペンタン５０ｖｌずつで４回抽出し
、ついで溶媒を真空除去した。ペンタンより再結晶して
、ｍｐ　４２−４２．５℃のｐ−ブロモクメンヒドロペ
ルオキシド１．３１ｇ（５，９５％収率）が生成した。

ヨウ素滴定によると、この生成物は実質的に純粋なｐ−
ブロモクメンヒドロペルオキシドであることを示した。

ｄ・　　　　　　よび　　　の８ ｐ−クロロクメンヒドロペルオキシドの代りに、上述の
ようにして生成したｐ−ブロモクメンヒドロペルオキシ
ド（１，３８ｇ）を用いて、約０．２Ｍのｐ−ブロモク
メンヒドロペルオキシド濃度の組成物を調製した外は実
質的に前出の実施例Ｉに述べたように、本発明によって
、試験組成物を調製した。該組成物よりの試験具の製造
方法は実質的に実施例工に述べたようであり、該試験具
の試験もまた先に述べたように、種々の濃度のヘモグロ
ビンを含有する尿試料中において行われた。実施例工の
ように、試料中のヘモグロビンの濃度レベルに相当する
レベルの、目視で認識されうる呈色を生じた。

’ＩＵＭＪ！ＬＭ　：　ｐ−ニトロクメンヒドロペルオ
キシドを包含する試験組成物および試験具 ａ、−二トローα−ブロモクメンの 四塩化炭素７０ｍ１中にｐ−ニトロクメン（コロンビア
・ケミカルズ（Ｃｏｌｕ＋＊ｂｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｇ）より入手１８．８ｇ＋４０ｔｓｍｏＩｅを含む溶液
に、Ｎ−ブロモスクシンイミドｆ１．８３ｇ（４４ｍｍ
ｏ　ｌｅ）および　２，２′−アソ゛ビス−（２−メチ
ルプロピオニトリル）４０１１ｇを添加した。

反応混合物を４時間還流し、その後、冷却、ろ過し、つ
いで溶媒を真空除去して、ｐ−ニトロ−α−ブロモクメ
ン８．４ｇ　（８７，２＄収率）を生成した。

ｂ、−ニトロクメンヒドロペルオキシドの乾燥エーテル
１０ｍ１中のｐ−ニトロ−α−ブロモクメン（２，４３
ｇ、、１０　ａｍｏｌｅ）、および０℃に冷却した８０
駕過酸化水素４１の混合物に乾燥エーテル２０１中にト
リフルオロ酢酸銀２．４０ｇ（１０＋ｉ＋５ｏｌｅ）を
含む溶液を滴加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌
し、セライト・プラグを介してろ過し、ついでろ液を水
５０１ずつで４回洗浄した。溶媒を真空除去し、−７０
℃に冷却すると、ｐ−ニトロクメンヒドロペルオキシド
１．５８ｇ（８０，８％収率）が固化した。ヨウ素滴定
によると、この生成物は約り１８％純度であることを示
した。

Ｃ０よび　　　　・ ｐ−クロロクメンヒドロペルオキシドの代りに、上述の
ようにして生成したｐ−ニトロクメンヒドロペルオキシ
ド（１，２３ｇ）を用いて、約０．２Ｍのｐ−ニトロク
メンヒドロペルオキシド濃度の組成物を調製した外は実
質的に実施例工に述べたようにして、本発明による試験
組成物を調製した。該組成物よりの試験具の製造方法は
実質的に実施例Ｉに述べたようであり、該試験具の試験
もまた先に述べたように、種々の濃度のヘモグロビンを
含有する尿試刺中において行われた。実施例Ｉのように
、試料中のヘモグロビンの濃度レベルに相当するレベル
の、目視で認識されうる呈色を生じた。

支り監」：　３　、４−ジクロロクメンヒドロペルオキ
シドを包含する試験組成物および試験具 ａ、３４−ジクロローα−メチルスチレンの０℃の乾燥
ＴＨＦ　５００　ｍｌ中のトリフェニルメチルホスホニ
ウムプロミド（７１，４ｇ　、２００　ｍｍｏｌｅ　）
のスラリーに、ヘキサン中の１．４４にのｎ−ブチルリ
チウム１３５ｍｌ（２００ｍｍｏｌｅ）を徐々に消却し
た。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、乾燥Ｔ
ＨＦ１００ｍｌ中の３，４−ジクロロアセトフェノン３
７．８ｇ　（２００ｍｍｏｌｅ）の溶液を徐々に消却し
た。反応混合物を０°Ｃで１時間撹拌しその後、乾燥Ｔ
ＨＦ１００＋ａｌ中の３，４−ジクロロアセト７ｘノン
３７．８ｇ（２００ｍｍｏｌｅ）の溶液を徐々に消却し
た。次に、反応混合物を環境温度まで徐々に昇温しなが
ら一晩撹拌した。得られた反応混合物を常温でろ過し、
次いで常圧で蒸留することにより溶媒を除去した。得ら
れた残香を減圧　（約１０ｍｍＨｇ）蒸留して、ｂｐ　
９７−１０２℃ノ３，４−ジクＩ：１　ロー　ａ−）　
ｆルス−ｆ−レン２１．９ｇ（５８，８％収率）を生成
した。

ｂ、３４−ジクロロクメン パール（Ｐａａｒ）水素添加器を用いて、３，４−ジク
ロロ−α−メチルスチＬ／　ン（２１，８ｇ、　１１８
＋ａｍｏｌｅ）　、酸化プラチナ約１００　ｌａｇ、お
よび無水エタノール１２５ｍ１を３．５ｋｇ／ｃｍ２（
５０ｐｓｉ）の初期水素圧力で４時間振とうした。次に
、反応物質をセライトを介してろ過し、ついで常圧で蒸
留することにより溶媒を除去した。得られた残香物質を
減圧蒸留して、ｂｐ　１２３−１２８℃（７）　３．４
−シクロ＊　りｌ　７１９．８ｇｌ’１５％収率）を生
成した。

０．３４−ジクロロ−α−ブロモクメンの３．４−ジク
ロロクメン（１，８９ｇ、１０　ｍｍｏｌｅ）、Ｎ−ブ
ロモスクシンイミド（１，ｆ１５ｇ、１１＋＋ｍｏｌｅ
）　、　２．２°−アゾビス（２−メチルプロピオニト
リル）約４０Ｂおよび四塩化炭素５０１の溶液を４時間
還流し、次に一晩放置した。反応混合物をセライトを介
してろ過し、ついで溶媒を真空除去した。残香にペンタ
ン（５０ｍｌ）を活性炭と共に添加し、反応物を再びセ
ライトを介してろ過した。溶媒を真空除去して、３．４
−ジクロロ−α−ブロモクメン２．２８ｇ（８５，５％
収率）を生成した。

ｄ、３４−ジクロロ　メンヒドロペルオキシドの或 ３．４−ジクロロ−α−ブロモクメン　（２，２８ｇ、
８．５５ｍｍｏｌｅ　）　、　９０％過酸化水素３．５
１および０℃の乾燥エーテル１５ｍ１の混合物に、エー
テル１０ｍ１中のトリフルオロ酢酸銀２．０５ｇ（８，
５５＋ａｍｏｌｅ）の溶液を消却した。反応混合物を０
℃で３０分間撹拌し、次いでセライトを介してろ過した
。次にろ液を水５０＋＋＋１ずつで４回、飽和炭酸水素
ナトリウム５０１ずつで２回、更に再び水５０１で洗浄
した。次に、溶媒を真空除去して、３，４−ジクロロク
メンヒドロペルオキシド１．５０ｇ　（８８Ｘ収率）を
生成した。ヨウ素滴定によると、この生成物は８０．５
％純度の３，４−ジクロロクメンヒドロペルオキシドで
あることを示した。

ｅ・−よび　　　の。

ｐ−クロロクメンヒドロペルオキシドの代りに、上述の
ようにして生成した３、４−ジクロロクメンヒドロペル
オキシド（１，４ｆ１ｇ）を用いて、約０．２Ｍの３．
４−ジクロロクメンヒドロペルオキシド濃度の組成物を
調製した外は実質的に実施例Ｉ（前出）に述べたように
して、本発明による試験組成物を調製した。該組成物よ
りの試験具の製造方法は実質的に実施例■に述べたよう
であり、該試験具の試験もまた先に述べたように、種々
の濃度のヘモグロビンを含有する尿試料中において行わ
れた。実施例工のように、試料中のヘモグロビンの濃度
レベルに相当するレベルの、目視で認識されうる呈色を
生じた。

えＬ丘ス１ 前出の実施例に述べたようにして、本発明によって製造
された試験具の、雰囲気温度および高温状態での保存安
定性すなわち”保存寿命”を測定するために一連の試験
が行なわれた。

本発明による、試験組成物およ゛びそれから製造される
試験具を実施例Ｉに述べたようにして製造し、更に、実
Ａ例Ｉの試験具と実質的には同一であるが、ｐ−クロロ
クメンヒドロペルオキシドの代りにクメンヒドロペルオ
キシド（２ｍｌ、０．２Ｍ　１１）を含有する対照試験
具を製造した。製造に引続き、空気炉中５０℃および７
０℃で１週間保存することによって、試験具の促進試験
を行なった。７０℃における１週間の保存は、雰囲気温
度においては約１年の保存に相当すると考えられた。次
に、−組の促進試験に付した細片を、過酸化物活性化物
質が負であることが分っている尿試料に浸漬し、他の一
組を種々の量のヒト全血を添加した尿試料に浸漬した。

呈色（すなわち尿試料中のヘモグロビンについての検出
能）についての試験具の目視試験の結果を次表に示す。

試験具の目視による色の読取りを、種々の量の血液を含
む尿試料と、従来のヘモグロビン試験具の反応により生
じる色に相当するカラーブロックを含有するカラーチャ
ートに対応する標準溶液表示（ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎｓ、５ＳＤ）に当
てはめた。試験具を先ず製造後直ちに雰囲気温度で試験
し、次いで前述の促進試験期間後試験した；各試料で試
験した試験具についての、ＳＳＤ単位で表わされた変化
を次に算出した。

実施例工において述べたようにして、本発明によって製
造した、別の試験具とともにＰ−クロロクメンヒドロペ
ルオキシドの代りにクメンヒドロペルオキシドを含有し
た対照試験具を、試験具申の呈色ヲマクベス　（Ｍａｃ
ｂｅｔｈ）比色計［フルモルガン・カンパ＝　−（Ｋｏ
ｌｌｍｏｒｇａｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ）より市販］として
知られる計器を用いて計器によって監視した外は、ヘモ
グロビンを含有する尿試料において先に述べたようにし
て試験した。この計器は、マイクロプロセッサにより制
御された、可視範囲内の反射率スペクトルの高速測定に
適した走査反射率スペクトロメータである。マクベス　
（Ｍａｃｂｅｔｈ）比色計での試薬細片試験具の性能測
定は、同−細片中の呈色の目視観察と比較して１次の長
所を有する： ｌ）　光源および試料の周囲の他の条件が一定である； ２）　目視観察では検出主体（すなわち、観察者の眼）
が個人個人により変化し、同一人物でも日によって変化
するのに対し、検出主体の特性が一定である；および ３）　計器測定は目視観察が行なうより、データのより
正確な定量を可能にし、結果について、より客観的な比
較ができる。

マクベス　（Ｍａｃｂｅｔｈ）比色計により得られたデ
ータを有意に算定するために、それを用いての試験結果
はＢ本単位で表わされた。これらの単位は三次元カラー
空間における負度／青度値の計器基準尺度である。マク
ベス　（Ｍａｃｂｅｔｈ）比色計により得られた任意の
反射率（色）値からのＢ零値を得るために、ディー・ビ
ー・シャットおよびジー・つ゛イスゼック（口、Ｂ、Ｊ
ｕｄｄ　ａｎｄ　Ｇ、Ｗｙｓｚｅｃｋｉ）、Ｃｏ１ａｒ
　ｉｎ　Ｂｕｓｉｎｅｓｓ　、　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎ
ｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ［ジョン争ワイリー〇アラド拳す
ンス（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　）　、
　＝　ニーヨーク　１１１１７５］に記載されている方
法を用いて相関式を作成する。促進試験に４＝Ｊされな
い、すなわち実質的に十分反応性を有すると考えられる
、本発明によらない従来の試験具は、ヘモグロビン０．
１３５ｍｇ／ｄｉを含む尿試料に浸漬すると、目視可能
の青色を呈する；相関値Ｂ＊の数値は小さい　（約８）
、シかしながら、保存期間を経た従来試験具、さもなけ
れば促進試験に付された従来試験具は、０．１３５履ｇ
／ｄｌのヘモグロビンを含有する尿中に浸漬すると、反
応性の実質的低下を示して、青色ではなく緑色を呈する
；そのような後者の色は、より高いＢ零値（約３０）と
相関する。したがって、本発明の試験具の相対的安定性
を測定するためには、促進試験条件、例えば、高温での
長期間の保存下で°の時間に対するＢ木の変化率が小さ
ければ小さい程試験具の安定性が大きいことになる したがって、マクベス比色計による変化率のデータが、
前出の実施例Ｉ−ＩＶに述べたようにして本発明によっ
て製造された試験具から得られた。

試験具を７０℃で１週間保存して促進試験に付し、つい
でこの促進試験期間直後および試験具の製造直後に、０
．１３５ｍｇ／ｄｉのヘモグロビンを含有する尿試料中
に含浸した後、８本の読取りを試験具から得た：　次に
、Ｂ＊の変化率を算出した。試験具についての反応性の
変化率の平均値を、１週間当すのＢ＊単位で次表に示す
。

試験具の形式　　　　　　　　　　　　　変化率（Ｂ零
／週）クメンヒドロペルオキシド０拒υ　　　　　　　
　　　　２４．８Ｂｐ−クロロクメンヒドロペルオキシ
ドαｉ例Ｉ）　　　　　　１５．１９ｐ−ブロモクメン
ヒドロペルオキシドα麓例■）　　　　　　１１．３２
ｐ−ニトロクメンヒドロペルオキシドα施例ＩＩＩ）　
　　　　　１５．５４３．４−ジクロロクメンヒドロペ
ルオキシドα漢例ＩＶ）　　　　２２．８８先の計器に
よるデータは、クメンヒドロペルオキシドを包含させた
従来の試験具と比較して、置換クメンヒドロペルオキシ
ドを包含させた本発明の試験具は、悪影響のある保存お
よび温度負荷条件下でも、実質的により大きい安定性を
示すことを確証している。更に、有利なことに、本発明
の試験具のこの高い安定性、すなわち”保存寿命”のた
めに、かかる促進試験の後でさえも、この試験具によっ
て、ヘモグロビンの存在を検出しうるが、それに対し、
従来の対照試験具の反応性の低下は比較的速くしかも木
質的であるので、それらの試験具はヘモグロビンに対す
る反応性が著しく低下し、　”保存寿命”の点で望まし
くないものとなる。

ここに述べた本発明の好ましい実施例における多くの修
正および変更が、本発明の精神および範囲を逸脱するこ
となしに可能であり、かつ、かかる精神および範囲につ
いての制限は特許請求の範囲によってのみ定まることを
認識すべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有機ヒドロペルオキシド、並びに該有機ヒドロペル
   オキシドおよび過酸化物活性化物質の存在下で検出可能
   な応答をなすことができる指示薬よりなる、試験試料中
   の過酸化物活性化物質測定用組成物において、該有機ヒ
   ドロペルオキシドが、 式： （式中、置換基ｘ１、Ｘ２およびｘ３のいずれか１つは
   炭素原子数１−’Ｂの低級アルキル基、ＣＩ、Ｂｒ、■
   、Ｎ０２　もしくはカルボキシル基；または置抄基Ｘ、
   、Ｘ２および×３のいずれか２つ（同一でも異なってい
   てもよい）は、炭素原子数１−６の低級アルキル基、Ｃ
   １、Ｂｒ、　Ｉ　、　ＮＯ２もしくはカルボキシル基で
   ある）で示される置換クメンヒドロペルオキシドである
   ことを特徴とする組成物。 ２、該置換クメンヒドロペルオキシドが、ｐ−クロロク
   メンヒドロペルオキシドである特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 ３、該置換クメンヒドロペルオキシ下が、Ｐ−ブロモク
   メンヒドロペルオキシドである特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 ４、該置換クメンヒドロペルオキシドが、ｐ−クロロク
   メンヒドロペルオキシド、Ｐ−ブロモクメンヒドロペル
   オキシド、ｐ−ニトロクメンヒドロペルオキシド、ｐ−
   カルボキシクメンヒドロペルオキシド、３，４−ジクロ
   ロクメンヒドロペルオキシド、ｒクロロクメンヒドロペ
   ルオキシド、０−クロロクメンヒドロペルオキシド、ｍ
   −インプロピルクメンヒドロペルオキシド、０−メチル
   クメンヒドロペルオキシド、ｐ−メチルクメンヒドロペ
   ルオキシドおよびそれらの混合物からなる群より選択さ
   れたものである特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ５．該指示薬が、ベンジジン、ｏ−トリジン、３．３’
   、５．５’−テトラ−（低級アルキル）−ベンジジン、
   ２．７−ジアミツフルオレンまたはそれらの混合物より
   なる特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ６、有機ヒドロペルオキシド、並びに該有機ヒドロペル
   オキシドおよび過酸化物活性化物質の存在下で検出可能
   な応答をなすことができる指示薬よりなる、試験試料中
   の過酸化物活性化物質測定用組成物において、該有機ヒ
   ドロペルオキシドか、 式： （式中、置換基ｘ１、Ｘ２およびｘ３のいずれか１つは
   炭素原子数１−６の低級アルキル基、ＣＩ、Ｂｒ、　Ｉ
   　、　ＮＯ２もしくはカルボキシル基：または置換基Ｘ
   ］、ｘ２およびＸ３のいずれか２つ（同一でも異なって
   いてもよい）は、炭素原子数１−６の低級アルキル基、
   Ｃ１、Ｂｒ、　Ｉ　、　ＮＯ２もしくはカルボキシル基
   である）で示される置換クメンヒドロペルオキシドであ
   る改良組成物を包含せしめた担体マトリックスよりなる
   ことを特徴とする、試験試料中の過酸化物活性化物質の
   存在を測定するための試験具。 ７、該置換クメンヒドロペルオキシドが、Ｐ−クロロク
   メンヒドロペルオキシドである特許請求の範囲第６項記
   載の試験具。 ８、該置換クメンヒドロペルオキシドが、ｐ−ブロモク
   メンヒドロペルオキシドである特許請求の範囲第６項記
   載の試験具。 ８、該置換クメンヒドロペルオキシドが、ｐ−クロロク
   メンヒドロペルオキシド、ｐ−ブロモクメンヒドロペル
   オキシド、ｐ−ニトロクメンヒドロペルオキシド、ｐ−
   カルボキシクメンヒドロペルオキシド、３．４−ジクロ
   ロクメンヒドロペルオキシド、ｍ−クロロクメンヒドロ
   ペルオキシド、０−クロロクメンヒドロペルオキシド、
   ｍ−イソプロピルクメンヒドロペルオキシド、０−メチ
   ルクメンヒドロペルオキシド、ｐ−メチルクメンヒドロ
   ペルオキシドおよびそれらの混合物からなる群より選択
   されたものである特許請求の範囲第６項記載の試験具。 １０、該指示薬が、ベンジジン、０−）リジン、３．３
   °、５．５°−テトラ−（低級アルキル）−ベンジジン
   、２．７−ジアミツフルオレンまたはそれらの混合物よ
   りなる特許請求の範囲第６項記載の試験具。 １１、有機ヒドロペルオキシド、並びに該有機ヒドロペ
   ルオキシドおよび過酸化物活性化物質の存在下で検出可
   能な応答を提供することができる指示薬よりなる、試験
   試料中の過酸化物活性化物質測定用組成物において、該
   有機ヒドロペルオキシドが、 式：００Ｈ ■ （式中、置換基Ｘ１、Ｘ２および×３のいずれか１つは
   炭素原子数ｉｆｆの低級アルキル基、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ　
   、　ＮＯ２もしくはカルボキシル基；または置換基ｘ１
   、ｘ２およびＸ３のいずれか２つ（同一でも異なってい
   てもよい）は、炭素原子数１−８の低級アルキル基、Ｃ
   １，Ｂｒ、Ｉ　、　ＮＯ２もしくはカルボキシル基であ
   る）で示される置換クメンヒドロペルオキシドである改
   良組成物を包含せしめた担体マトリックスよりなる試験
   試料中の過酸化物活性化物質の存在を測定するための試
   験具と、試料を接触させる工程、および試験具申の検出
   可能な応答を観察する工程よりなることを特徴とする試
   験試料中の過酸化物活性化物質の存在を測定するための
   方法。 ＋２．該置換クメンヒドロペルオキシドが、ｐ−クロロ
   クメンヒドロペルオキシドである特許請求の範囲第１１
   項記載の方法。 １３、該置換クメンヒドロペルオキシドが、ｐ−ブロモ
   クメンヒドロペルオキシドである特許請求の範囲第１１
   項記載の方法。 １４、該置換クメンヒドロペルオキシドが、ｐ−クロロ
   クメンヒドロペルオキシド、ｐ−ブロモクメンヒドロペ
   ルオキシド、ｐ−ニトロクメンヒドロペルオキシド、ｐ
   −カルボキシクメンヒドロペルオキシド、３．４−ジク
   ロロクメンヒドロペルオキシド、ｍ−クロロクメンヒド
   ロペルオキシド、０−クロロクメンヒドロペルオキシド
   、ｍ−イソプロピルクメンヒドロペルオキシド、０−メ
   チルクメンヒドロペルオキシド、ｐ−メチルクメンヒド
   ロペルオキシドおよびそれらの混合物からなる群より選
   択されたものである特許請求の範囲第１１項記載の方法
   。 １５、該指示薬が、ベンジジン、ｏ−トリジン、３．３
   °、５．５°−テトラ　（低級アルキル）−ベンジジン
   、２，７−ジアミツフルオレンまたはそれらの混合物よ
   りなる特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １６、有機ヒドロペルオキシド、並びに該有機ヒドロペ
   ルオキシドおよび過酸化物活性化物質の存在下で検出可
   能な応答を提供することができる指示薬よりなる、試験
   試料中の過酸化物活性化物質測定用固相組成物において
   、該有機ヒドロペルオキシドが、 式： （式中、置換基Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のいずれか１つは
   炭素原子数１−６の低級アルキル基、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ　
   、　Ｎｏ２もしくはカルボキシル基；または置換基Ｘ、
   、Ｘ２およびｘ３のいずれか２つ（同一でも異なってい
   てもよい）は、炭素原子数１−８の低級アルキル基、Ｃ
   １，Ｂｒ、Ｉ　、　Ｎｏ２もしくはカルボキシル基であ
   る）で示される置換クメンヒドロペルオキシドである改
   良組成物よりなる溶液を調製する工程； 担体マトリックスを該溶液で湿潤させることにより、該
   溶液を該担体マトリックスに包含せしめる工程；および 該湿潤マトリックスを乾燥して、該マトリックス中に該
   組成物残査を残す工程 よりなることを特徴とする、試験試料中の過酸化物活性
   化物質の存在を測定するための試験具の製造法。 １？、更に、乾燥マトリックスな担体部材に固着する更
   なる工程を含む特許請求の範囲第１６項記載の製造法。