JPS63129986A - トランスアミナーゼ遺伝子ｉｌｖＥのクローニング及びその使用 - Google Patents
トランスアミナーゼ遺伝子ｉｌｖＥのクローニング及びその使用Info
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- JPS63129986A JPS63129986A JP62274613A JP27461387A JPS63129986A JP S63129986 A JPS63129986 A JP S63129986A JP 62274613 A JP62274613 A JP 62274613A JP 27461387 A JP27461387 A JP 27461387A JP S63129986 A JPS63129986 A JP S63129986A
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
脂肪族アミノ酸の新規（ｄｃｎｏｖｏ ）合成における
最終段階は、トランスアミナーゼによる該当するケト前
駆体のアミノ化からなる。種々のトランスアミナーゼが
、脂肪族アミノ酸を生じるアミノ基転移反応を行なうこ
とができるが、この作用は、主として脂肪族トランスア
ミナーゼと呼ばれる酵素によって細胞中で営まれる。脂
肪族トランスアミナーゼのための遺伝子を表わす、遺伝
学で用いられる略号はｉｌｖ Ｅである（ラムバーガー
（Ｕｍ−ｂａｒｇｅｒ） 、Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｂｌ
ｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ ４７（１９７８）、５３３−
６０６）。大腸菌（Ｅ。
最終段階は、トランスアミナーゼによる該当するケト前
駆体のアミノ化からなる。種々のトランスアミナーゼが
、脂肪族アミノ酸を生じるアミノ基転移反応を行なうこ
とができるが、この作用は、主として脂肪族トランスア
ミナーゼと呼ばれる酵素によって細胞中で営まれる。脂
肪族トランスアミナーゼのための遺伝子を表わす、遺伝
学で用いられる略号はｉｌｖ Ｅである（ラムバーガー
（Ｕｍ−ｂａｒｇｅｒ） 、Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｂｌ
ｏｃｈｅｍｊｓｔｒｙ ４７（１９７８）、５３３−
６０６）。大腸菌（Ｅ。
ｃｏｌｔ） Ｋ ｉ ２の場合には、“細菌染色体”上
のこの遺伝子の位置は、正確にわかっており、この遺伝
子の遺伝子産物には、酵素番号（Ｅ、 Ｃ。
のこの遺伝子の位置は、正確にわかっており、この遺伝
子の遺伝子産物には、酵素番号（Ｅ、 Ｃ。
ｎｕｍｂｅｒ） ２． ６． １．４２が付与されてい
る（バックマンら（Ｂａｃｈｍａｎｎ Ｃ１ａｔ、 ）
。
る（バックマンら（Ｂａｃｈｍａｎｎ Ｃ１ａｔ、 ）
。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４
４ （１９８０） 、 １−５６）。
４ （１９８０） 、 １−５６）。
ヨーロッパ公開特許出願節０．１．１６，８６０号には
、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２からのＩｌｖ Ｅ遺伝子の分離と
、このアミノトランスフェラーゼ遺伝子の、マルチコピ
ー（ｍｕｌｔｉｅｏｌ）ｙ）プラスミドへのクローニン
グについて記載されている。しかしながら、クローニン
グされたＮｖ Ｅ遺伝子産物の活性に関する明確なデー
タはない。ヨーロッパ公開特許出願節０．１５２，２７
５号には、ｉｌｖ Ｅ遺伝子のクローニングによって、
この酵素活性の増加が達成できるということが記載され
ている。しかし、脂肪族アミノ酸の収量についての増加
に関するデータはない。
、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２からのＩｌｖ Ｅ遺伝子の分離と
、このアミノトランスフェラーゼ遺伝子の、マルチコピ
ー（ｍｕｌｔｉｅｏｌ）ｙ）プラスミドへのクローニン
グについて記載されている。しかしながら、クローニン
グされたＮｖ Ｅ遺伝子産物の活性に関する明確なデー
タはない。ヨーロッパ公開特許出願節０．１５２，２７
５号には、ｉｌｖ Ｅ遺伝子のクローニングによって、
この酵素活性の増加が達成できるということが記載され
ている。しかし、脂肪族アミノ酸の収量についての増加
に関するデータはない。
今やおどろくべきことに、Ｅ、 ｃｏｌｉＡ Ｔ ＣＣ
１１３０３に存在するｉｌｖ Ｅ遺伝子の分離とマルチ
コピープラスミドへのこの遺伝子のクローニングにより
、このプラスミドで出発法を形質転換した後、特定のア
ミノ酸の収量が、少なくとも３〜５倍増加することがわ
かった。
１１３０３に存在するｉｌｖ Ｅ遺伝子の分離とマルチ
コピープラスミドへのこの遺伝子のクローニングにより
、このプラスミドで出発法を形質転換した後、特定のア
ミノ酸の収量が、少なくとも３〜５倍増加することがわ
かった。
かくして、本発明は以下のことに関連する。
１、 Ｅ、ｃｏｌｉＡＴｃｃｌ １３０３から分離
したｉｌｖ Ｅ遺伝子を含む増殖性染色体外因子。
したｉｌｖ Ｅ遺伝子を含む増殖性染色体外因子。
２、 脂肪族トランスフェラーゼの合成のための、第１
項に規定された染色体外因子の使用。
項に規定された染色体外因子の使用。
３、 以下のａ）〜Ｃ）の操作からなる、微生物中での
分枝鎖アミノ酸の過剰生産のための、第１項に規定され
た染色体外因子の使用。
分枝鎖アミノ酸の過剰生産のための、第１項に規定され
た染色体外因子の使用。
ａ） 微生物への染色体外因子の導入。
ｂ） この微生物中でのｉｌｖ Ｅ遺伝子の発現、およ
び活性な脂肪族トランスアミナーゼの合成。
び活性な脂肪族トランスアミナーゼの合成。
Ｃ） このトランスアミナーゼによる、適当なケト前駆
体のアミノ化の惹起。
体のアミノ化の惹起。
本発明は以ドの記述に於いて、詳細に説明され、さらに
特許請求の範囲で定義されている。
特許請求の範囲で定義されている。
Ｅ、ｃｏｌｌＡＴｃｃｌ １３０３の野生型だけでなく
、その変種および突然変異体を使用することもできる。
、その変種および突然変異体を使用することもできる。
例えば、公知方法で突然変異をおこさせ（イー・アデル
バーグら（Ｅ、 Ａｄｅｌｂｅｒｇ ｅＬ ａｌ、）。
バーグら（Ｅ、 Ａｄｅｌｂｅｒｇ ｅＬ ａｌ、）。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｌｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍ、 １８． ７８８（１９６５）） 、分枝鎖ア
ミノ酸の過剰生産のために選別された株を用いることも
できる。ｉｌｖ Ｅ遺伝子によってコードされる、Ｅ、
ｃｏｌｉＡＴｃｃ１１３０３からの脂肪族アミノトラン
スフェラーゼは、とりわけグルタミン酸（ｇ！ｕｔａｍ
ａｔｅ ）からアミノ基を転移させることにより、適切
なケト前駆体からバリン、ロイシンおよびイソロイシン
を合成する。さらに、脂肪族トランスアミナーゼを用い
てフェニルアラニンおよびグルタミン酸を合成すること
もできる。ｉｌｖ Ｅ遺伝子産物とは別に、他の遺伝子
産物としてのトランスアミナーゼが、Ｅ、 ｃｏｌｌ細
胞に於いて見出されている。
ｏｍｍ、 １８． ７８８（１９６５）） 、分枝鎖ア
ミノ酸の過剰生産のために選別された株を用いることも
できる。ｉｌｖ Ｅ遺伝子によってコードされる、Ｅ、
ｃｏｌｉＡＴｃｃ１１３０３からの脂肪族アミノトラン
スフェラーゼは、とりわけグルタミン酸（ｇ！ｕｔａｍ
ａｔｅ ）からアミノ基を転移させることにより、適切
なケト前駆体からバリン、ロイシンおよびイソロイシン
を合成する。さらに、脂肪族トランスアミナーゼを用い
てフェニルアラニンおよびグルタミン酸を合成すること
もできる。ｉｌｖ Ｅ遺伝子産物とは別に、他の遺伝子
産物としてのトランスアミナーゼが、Ｅ、 ｃｏｌｌ細
胞に於いて見出されている。
例えば、ｔｙｒ Ｂ遺伝子産物である万香族トランスア
ミナーゼは、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギ
ン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ ）およびロイシンの合成を
、ａｓｐ Ｃ遺伝子産物はアスパラギン酸、グルタミン
酸、フェニルアラニンおよびチロシンの合成を触媒する
。しかしながら、これらトランスアミナーゼの各々は、
事実士別の二つのトランスアミナーゼのいずれかに、よ
り特異的に割当てられるべきアミノ酸の合成にも弱い活
性を示す。
ミナーゼは、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギ
ン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ ）およびロイシンの合成を
、ａｓｐ Ｃ遺伝子産物はアスパラギン酸、グルタミン
酸、フェニルアラニンおよびチロシンの合成を触媒する
。しかしながら、これらトランスアミナーゼの各々は、
事実士別の二つのトランスアミナーゼのいずれかに、よ
り特異的に割当てられるべきアミノ酸の合成にも弱い活
性を示す。
分枝鎖アミノ酸の合成をさらに増加させるために、脂肪
族アミノトランスフェラーゼをコードするｉｌｖ Ｅ遺
伝子をクローニングする。これは、Ｅ。
族アミノトランスフェラーゼをコードするｉｌｖ Ｅ遺
伝子をクローニングする。これは、Ｅ。
ｃｏｌｌＡＴｃｃ１１３０３からＤＮＡを分離すること
によって達成される。このＤＮＡの部分消化により、大
きさが２０〜３０ｋｂの範囲にある大小のフラグメント
が生成し、さらに、広い宿主域を付与するレプリコンを
もつコスミドに連結され、ファージλの頭殻に包みこま
れる。好ましくは、コスミドｐ１Ｍｓ６０２６が用いら
れる。コスミドｐＩＭｓ６０２６はコスミドｐＬＡＦＲ
１（ＡＴＣＣ３７１６７）に由来し、コスミドｐＬＡＦ
Ｒ】の唯一のＥｃｏＲＩ切断部位に、クローニングした
トランスポゾンＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子を
もつ市販のＥｃｏＲＩフラグメント（ファルマシア（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ） 、 ウプサラ、スウェーデン）
によるものである。ＢａｍＨＩでこれを消化し、続いて
ｆＴｉ連結を行なうことにより、ＥｃｏＲＩフラグメン
トの大部分を欠失させることができる。これにより二つ
のＥｃｏＲＩ切断部位によって隣接されるＢａｍＨＩ接
断部位をもつ挿入物として短いＤＮＡ断片が残存する。
によって達成される。このＤＮＡの部分消化により、大
きさが２０〜３０ｋｂの範囲にある大小のフラグメント
が生成し、さらに、広い宿主域を付与するレプリコンを
もつコスミドに連結され、ファージλの頭殻に包みこま
れる。好ましくは、コスミドｐ１Ｍｓ６０２６が用いら
れる。コスミドｐＩＭｓ６０２６はコスミドｐＬＡＦＲ
１（ＡＴＣＣ３７１６７）に由来し、コスミドｐＬＡＦ
Ｒ】の唯一のＥｃｏＲＩ切断部位に、クローニングした
トランスポゾンＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子を
もつ市販のＥｃｏＲＩフラグメント（ファルマシア（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ） 、 ウプサラ、スウェーデン）
によるものである。ＢａｍＨＩでこれを消化し、続いて
ｆＴｉ連結を行なうことにより、ＥｃｏＲＩフラグメン
トの大部分を欠失させることができる。これにより二つ
のＥｃｏＲＩ切断部位によって隣接されるＢａｍＨＩ接
断部位をもつ挿入物として短いＤＮＡ断片が残存する。
このＢａｍＨＩ切断部位は、コスミドｐＬＡＦＲ１には
存在せず、クローニングのために使用することができる
。このコスミドを適切に調製したＥ、 ｃｏｌＩＤＧ
３０の／￥！遊液と頭殻に包みこまれたコスミドと共に
インキュベーションすることにより、微生物に導入する
。Ｅ。
存在せず、クローニングのために使用することができる
。このコスミドを適切に調製したＥ、 ｃｏｌＩＤＧ
３０の／￥！遊液と頭殻に包みこまれたコスミドと共に
インキュベーションすることにより、微生物に導入する
。Ｅ。
ｃｏｌｉＤＧ３０は不完全な三種のトランスアミナーゼ
、ａｓｐ Ｃ，Ｉｌｖ Ｅおよびｔｙｒ Ｂをもつ。そ
れゆえ、この株は完全培地では、問題なく増殖するけれ
ども、最少培地での増殖には、外部から種々のアミノ酸
を補充する必要がある。なぜならば、この株は、それ自
体で種々のアミノ酸を合成することができないからであ
る。適切な培地を選択することによって、この株を用い
て、外部から取りこまれたＤＮＡが、特定のトランスア
ミナーゼについての染色体の欠損を補足することができ
るかどうかをしらべることかできる。ｉｌｖ Ｅ遺伝子
の導入は、無チロシン最少培地でのＥ、 ｃｏｌｉＤＧ
３０の増殖によって検出される。ａｓｐ Ｃｓ ｔｙｒ
Ｂおよびｉｌｖ Ｅを含み、Ｅ、 ｃｏｌｉＡＴｃｃ
１１３０３から生じたＤＮＡの取り込みによって、チ
ロシン合成についての染色体の欠損を補足することがで
きるクローンだけが、この培地で増殖することができる
。遺伝子、ａｓｐ Ｃ５ｔｙｒ Ｂおよびｉｌｖ Ｅに
よってコードされる三種のアミナーゼは、すべて千ロジ
ンをつくることができるが、これら三種のアミナーゼは
、その基質特異性に於て異なっている。
、ａｓｐ Ｃ，Ｉｌｖ Ｅおよびｔｙｒ Ｂをもつ。そ
れゆえ、この株は完全培地では、問題なく増殖するけれ
ども、最少培地での増殖には、外部から種々のアミノ酸
を補充する必要がある。なぜならば、この株は、それ自
体で種々のアミノ酸を合成することができないからであ
る。適切な培地を選択することによって、この株を用い
て、外部から取りこまれたＤＮＡが、特定のトランスア
ミナーゼについての染色体の欠損を補足することができ
るかどうかをしらべることかできる。ｉｌｖ Ｅ遺伝子
の導入は、無チロシン最少培地でのＥ、 ｃｏｌｉＤＧ
３０の増殖によって検出される。ａｓｐ Ｃｓ ｔｙｒ
Ｂおよびｉｌｖ Ｅを含み、Ｅ、 ｃｏｌｉＡＴｃｃ
１１３０３から生じたＤＮＡの取り込みによって、チ
ロシン合成についての染色体の欠損を補足することがで
きるクローンだけが、この培地で増殖することができる
。遺伝子、ａｓｐ Ｃ５ｔｙｒ Ｂおよびｉｌｖ Ｅに
よってコードされる三種のアミナーゼは、すべて千ロジ
ンをつくることができるが、これら三種のアミナーゼは
、その基質特異性に於て異なっている。
Ｌｙｒ Ｂ遺伝子によってコードされる芳香族トランス
アミナーゼは、例えば、ケト前駆体からイソロイシンを
つくることはできないが、対応するケト前駆体からロイ
シンを高収量で合成することができる。ａｓｐ Ｃ遺伝
子によってコードされるトランスアミナーゼはイソロイ
シンをつくることもできないし、ロイシンへの変換も十
分ではない。しかしながら、１１ｖ Ｅ遺伝子産物は、
イソロイシンを高収量で産生ずる。
アミナーゼは、例えば、ケト前駆体からイソロイシンを
つくることはできないが、対応するケト前駆体からロイ
シンを高収量で合成することができる。ａｓｐ Ｃ遺伝
子によってコードされるトランスアミナーゼはイソロイ
シンをつくることもできないし、ロイシンへの変換も十
分ではない。しかしながら、１１ｖ Ｅ遺伝子産物は、
イソロイシンを高収量で産生ずる。
したがって、特定の遺伝子に特徴的なアミノ酸とは別に
代謝に必要なアミノ酸を補充した最少培地での増殖によ
って、含まれるトランスアミナーゼの観点から、個々の
クローンを識別することができる。Ｉｌｖ Ｅ遺伝子を
含むＤ０３０株のクローンが、この方法で選別される。
代謝に必要なアミノ酸を補充した最少培地での増殖によ
って、含まれるトランスアミナーゼの観点から、個々の
クローンを識別することができる。Ｉｌｖ Ｅ遺伝子を
含むＤ０３０株のクローンが、この方法で選別される。
ここで、これらクローンが実際にｉｌｖ Ｅ遺伝子をも
っているかどうかを、しらべる必要がある。
っているかどうかを、しらべる必要がある。
これには、これらクローンからプラスミドＤＮＡを分離
することが必要である。しかし、ＤＧ３０株からのＤＮ
Ａの分離は、口Ｉ能であるが困難である。プラスミドＤ
ＮＡを得ることはできるが、収量が少ない。かくして、
最少溶菌の後、興味のあるクローンからのコスミドＤＮ
ＡでＥ、 ｃｏｌｉ株を形質転換し、それからこの株か
ら導入ＤＮＡを高収量で再分離することができる。Ｅ、
ｃｏｌｉＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）は、この目的
にとりわけ適切である。
することが必要である。しかし、ＤＧ３０株からのＤＮ
Ａの分離は、口Ｉ能であるが困難である。プラスミドＤ
ＮＡを得ることはできるが、収量が少ない。かくして、
最少溶菌の後、興味のあるクローンからのコスミドＤＮ
ＡでＥ、 ｃｏｌｉ株を形質転換し、それからこの株か
ら導入ＤＮＡを高収量で再分離することができる。Ｅ、
ｃｏｌｉＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）は、この目的
にとりわけ適切である。
次の段階では、この再分離したコスミドＤＮＡがマルチ
コピー（ｍｕｌｔｌｃｏｐｙ ）ベクターに連結される
。Ｅ、 ｃｏｌｉＫ １２Ｆ９Ｆ、の染色体地図から、
ＮｖＥ遺伝子はＳａｔ Ｉ −３ＩＩｌａ Ｉフラグ
メント上に存在することがわかっている。このフラグメ
ントはｉｌｖ Ｅの構造遺伝子のみを含み、天然のプロ
モーターを含まない。このことは、Ｅ、ｃｏｌｉＡＴｃ
ｃ１１３０３に於いても同扛である可能性がある。
コピー（ｍｕｌｔｌｃｏｐｙ ）ベクターに連結される
。Ｅ、 ｃｏｌｉＫ １２Ｆ９Ｆ、の染色体地図から、
ＮｖＥ遺伝子はＳａｔ Ｉ −３ＩＩｌａ Ｉフラグ
メント上に存在することがわかっている。このフラグメ
ントはｉｌｖ Ｅの構造遺伝子のみを含み、天然のプロ
モーターを含まない。このことは、Ｅ、ｃｏｌｉＡＴｃ
ｃ１１３０３に於いても同扛である可能性がある。
この理由のために、用いるのに好ましいベクターは、ク
ローニングされた塩基配列（５ｅｑｕｅｎｃｅ）が、プ
ラスミドに存在するプロモーターの制御下にくるように
、Ｓａｌ Ｉ −Ｓｍａ Ｉフラグメントのクローニ
ングを許容するマルチコピープラスミドである。
ローニングされた塩基配列（５ｅｑｕｅｎｃｅ）が、プ
ラスミドに存在するプロモーターの制御下にくるように
、Ｓａｌ Ｉ −Ｓｍａ Ｉフラグメントのクローニ
ングを許容するマルチコピープラスミドである。
ｐＢＲ３２２はその塩基配列が知られており、かつ市販
されていて、特に好ましい。
されていて、特に好ましい。
コスミドＤＮＡは酵素、Ｓａｌ ＩおよびＳｍａ Ｉ
で完全に消化される。そしてベクターは、制限酵素Ｓａ
ｌ ＩおよびＰｖｕ Ｉ Ｉで完全に消化される。こ
の二種のＤＮＡを混合し、共に連結する。この連結産物
を用いて、分枝鎖アミノ酸の産生を高めたい宿主生物の
受容細胞を形質転換する。用いるに好ましいものは腸内
細菌、特にＥ、 ｃｏｌｔてあり、Ｅ。
で完全に消化される。そしてベクターは、制限酵素Ｓａ
ｌ ＩおよびＰｖｕ Ｉ Ｉで完全に消化される。こ
の二種のＤＮＡを混合し、共に連結する。この連結産物
を用いて、分枝鎖アミノ酸の産生を高めたい宿主生物の
受容細胞を形質転換する。用いるに好ましいものは腸内
細菌、特にＥ、 ｃｏｌｔてあり、Ｅ。
ｃｏｌｉＡＴｃｃ １１３０３、その突然変異体および
変種が特に好ましい。耐性コロニーはアンピシリンを用
いて選別し、プラスミドＤＮＡは最少溶菌によって適切
なコロニーから分離し、ベクターＤＮＡは制限酵素Ｓａ
ｔ Ｉで完全消化して、大きさの変化をしらべる。制
限分析は元のＤＮＡ断片に含まれるｓａｔ Ｉ −８
ｌｌｌａ Ｉフラグメントはすべてこの方法でサブクロ
ーニングされたことを確認するために行う。それからこ
れらＳａｌ Ｉ −８ｆｆｌａ Ｉフラグメントのひ
とつを含むクローンを、文献に記載されたテスト（ダッ
ガンら（Ｄｕｇｇａｎ ｅｔ ａｔ、） 。
変種が特に好ましい。耐性コロニーはアンピシリンを用
いて選別し、プラスミドＤＮＡは最少溶菌によって適切
なコロニーから分離し、ベクターＤＮＡは制限酵素Ｓａ
ｔ Ｉで完全消化して、大きさの変化をしらべる。制
限分析は元のＤＮＡ断片に含まれるｓａｔ Ｉ −８
ｌｌｌａ Ｉフラグメントはすべてこの方法でサブクロ
ーニングされたことを確認するために行う。それからこ
れらＳａｌ Ｉ −８ｆｆｌａ Ｉフラグメントのひ
とつを含むクローンを、文献に記載されたテスト（ダッ
ガンら（Ｄｕｇｇａｎ ｅｔ ａｔ、） 。
Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、５１ （１９７３） ６
７−７９）を用いて、脂肪族トランスアミナーゼ、すな
わちｉｌｖ Ｅ遺伝子産物、の活性について検べる。こ
の方法で、ｉｌｖ Ｅ活性を１０倍以上増加させること
ができる。アガロースゲル電気泳動で、宿主株のベクタ
ーが、およそＩＭＤの大きさのＡＴＣＣ１１３０３フラ
グメントを含んでいることを示すことができる。
７−７９）を用いて、脂肪族トランスアミナーゼ、すな
わちｉｌｖ Ｅ遺伝子産物、の活性について検べる。こ
の方法で、ｉｌｖ Ｅ活性を１０倍以上増加させること
ができる。アガロースゲル電気泳動で、宿主株のベクタ
ーが、およそＩＭＤの大きさのＡＴＣＣ１１３０３フラ
グメントを含んでいることを示すことができる。
本発明は以下の諸例に於いて詳細に記載されている。特
に規定されないかぎり、百分率に関するデータは重量に
よるものである。
に規定されないかぎり、百分率に関するデータは重量に
よるものである。
例１ ： Ｅ、 ｃｏｌｌからのコスミドｐ １ＭＳ６
０２６の分離と消化 Ｅ、 ｃｏｌｔからのコスミドｐ １ＭＳ６０２６の分
離に用いられた方法はハンフリーズらの方法（Ｈｕｍｐ
ｈｒｃｙｓ ａｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ３８３．４５７−６７ （１９７５）
）か、又はバーンボイムとドーリ−（ＢｉｒｎｂｏｌＩ
Ｉｌａｎｄ Ｄｏｌｙ ）のノブ法によるアルカリ溶閉
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ７ ：１５
１３（１９７９））を１０倍のスケールにしたもののい
ずれかであった。各場合に於いて、プラスミドＤＮＡは
、塩化セシウム／臭化エチジウムの密度勾配遠心沈殿に
よって、少なくとも一回精製した。
０２６の分離と消化 Ｅ、 ｃｏｌｔからのコスミドｐ １ＭＳ６０２６の分
離に用いられた方法はハンフリーズらの方法（Ｈｕｍｐ
ｈｒｃｙｓ ａｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ３８３．４５７−６７ （１９７５）
）か、又はバーンボイムとドーリ−（ＢｉｒｎｂｏｌＩ
Ｉｌａｎｄ Ｄｏｌｙ ）のノブ法によるアルカリ溶閉
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ７ ：１５
１３（１９７９））を１０倍のスケールにしたもののい
ずれかであった。各場合に於いて、プラスミドＤＮＡは
、塩化セシウム／臭化エチジウムの密度勾配遠心沈殿に
よって、少なくとも一回精製した。
コスミドｐ１Ｍｓ６０２６は、製造元のニューイングラ
ンドバイオラブ社（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ
ｂｓ ）によって示された方法を用いて、制限酵素Ｂａ
ｆｌｌＨＩで完全に消化した。消化が完全に行なわれた
ことをしらべるために、制限混合物の適量を、０．８％
アガロースゲルに取り、電気泳動を行なった。完全消化
は臭化エチジウムで染色、短波長ＵＶ光の照射後、１ｌ
ｉ−バンドの出現で示された。フェノールで処理して、
この制限酵素を消化コスミドＤＮＡから除き、さらにこ
のＤＮＡを７０９６のエタノールで沈殿、真空中で乾燥
した後、適量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス（Ｌｒｉｓ
） 、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）にとった
。場合により、製造元のベーリンガーマンハイム（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）の指示する方
法で、アルカリホスファターゼ処理を行なった。１μｇ
のアルカリホスファターゼ（ＣＩ Ｐ）の添加後、反応
混合物を３７℃、３０分インキュベーションし、酵素を
フェノール処理で取り除き、上記の通りにＤＮＡを精製
した。ＤＮＡは最終的にＴＥ緩衝液に再浮遊させた。
ンドバイオラブ社（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ
ｂｓ ）によって示された方法を用いて、制限酵素Ｂａ
ｆｌｌＨＩで完全に消化した。消化が完全に行なわれた
ことをしらべるために、制限混合物の適量を、０．８％
アガロースゲルに取り、電気泳動を行なった。完全消化
は臭化エチジウムで染色、短波長ＵＶ光の照射後、１ｌ
ｉ−バンドの出現で示された。フェノールで処理して、
この制限酵素を消化コスミドＤＮＡから除き、さらにこ
のＤＮＡを７０９６のエタノールで沈殿、真空中で乾燥
した後、適量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス（Ｌｒｉｓ
） 、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）にとった
。場合により、製造元のベーリンガーマンハイム（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）の指示する方
法で、アルカリホスファターゼ処理を行なった。１μｇ
のアルカリホスファターゼ（ＣＩ Ｐ）の添加後、反応
混合物を３７℃、３０分インキュベーションし、酵素を
フェノール処理で取り除き、上記の通りにＤＮＡを精製
した。ＤＮＡは最終的にＴＥ緩衝液に再浮遊させた。
例２ ： Ｅ、ｃｏｌｌＡＴｃｃｌ １３０３からのＤ
ＮＡの部分消化 Ｅ、ｃｏｌｉＡＴｃｃｌ １３０３から全ＤＮＡをマ？
−（Ｍａｒｍｕｒ）の方法（Ｊ、ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、
５３゜１５５−１６２ （１９６１） ）で分離した
。分離したＤＮＡを、制限酵素５ａｕ３Ａで、生成フラ
グメントの大きさが主に２０〜３０ｋｂの範囲となるよ
うに部分消化した。この目的のためのＤＮＡ／酵素の最
適比及び、このＤＮＡについての酵素の最適反応時間を
確立するために、予備試験を行なった。適切な方法は、
ＢＲＬ刊行の“フォーカス（ｆｏｃｕｓ ）” （第７
巻、２号、３ページ。
ＮＡの部分消化 Ｅ、ｃｏｌｉＡＴｃｃｌ １３０３から全ＤＮＡをマ？
−（Ｍａｒｍｕｒ）の方法（Ｊ、ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、
５３゜１５５−１６２ （１９６１） ）で分離した
。分離したＤＮＡを、制限酵素５ａｕ３Ａで、生成フラ
グメントの大きさが主に２０〜３０ｋｂの範囲となるよ
うに部分消化した。この目的のためのＤＮＡ／酵素の最
適比及び、このＤＮＡについての酵素の最適反応時間を
確立するために、予備試験を行なった。適切な方法は、
ＢＲＬ刊行の“フォーカス（ｆｏｃｕｓ ）” （第７
巻、２号、３ページ。
１９８５）に記載されている。最適であると判明した反
応時間の経過後、６５℃で１０分間加熱して酵素を変性
させ、所望の大きさのＤＮＡが生成されたか否かは、適
切なりＮＡママ−−、例えばＥｃｏＲＩ消化λファージ
ＤＮＡ、を用いてアガロースゲル電気泳動でしらべた。
応時間の経過後、６５℃で１０分間加熱して酵素を変性
させ、所望の大きさのＤＮＡが生成されたか否かは、適
切なりＮＡママ−−、例えばＥｃｏＲＩ消化λファージ
ＤＮＡ、を用いてアガロースゲル電気泳動でしらべた。
例３・制限混合物の連結
５ａｕ３Ａで部分消化したＥ、 ｃｏｌｉＡＴ ＣＣ１
１３０３の全ＤＮＡを、ＢａｍＨＩで完全に切断し、ア
ルカリホスファターゼで処理したコスミドｐＩＭ Ｓ
Ｄ Ｎ Ａと、モル比およそ１：５で混合した。
１３０３の全ＤＮＡを、ＢａｍＨＩで完全に切断し、ア
ルカリホスファターゼで処理したコスミドｐＩＭ Ｓ
Ｄ Ｎ Ａと、モル比およそ１：５で混合した。
この混合物に、ニューイングランドバイオラブ社（Ｎｅ
ｗｌシｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）が指示するよ
うに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの最適イオン強度となるよう
に、数倍高濃度の緩衝液を加え、これを１μｇのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼとともに、１６℃で少なくとも１４時間イ
ンキュベーションした。この混合物の全容量は５０℃ｇ
で全ＤＮＡの濃度は２０℃ｇ／ｍｌてあった。
ｗｌシｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ）が指示するよ
うに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの最適イオン強度となるよう
に、数倍高濃度の緩衝液を加え、これを１μｇのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼとともに、１６℃で少なくとも１４時間イ
ンキュベーションした。この混合物の全容量は５０℃ｇ
で全ＤＮＡの濃度は２０℃ｇ／ｍｌてあった。
例４：λファージの包みこみ
リガーゼ反応の後、例３のようにして得られたＤＮＡの
、λフアージ頭殻へのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
包みこみ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ）を行なった。
、λフアージ頭殻へのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
包みこみ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ）を行なった。
この目的に必要な二種の細閃株からの抽出物はホーン（
Ｉｌｏｈｎ）の方法（２９Ｑ−３０９ページ、ＲｌＷｕ
編： ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎＬ Ｄ Ｎ Ａ、 Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ］ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第６８巻、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７
９参照）によるか、あるいはべ−リンガーマンハイムま
たはアマーシャムバックラ−（Ａａ＋ｅｒｓｈａ＋ＩＢ
ｕｃｈｌｅｒ、Ｂｒａｕｎｓｅｈｗｃｉｇ ）から購入
できる。
Ｉｌｏｈｎ）の方法（２９Ｑ−３０９ページ、ＲｌＷｕ
編： ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎＬ Ｄ Ｎ Ａ、 Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ］ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第６８巻、
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７
９参照）によるか、あるいはべ−リンガーマンハイムま
たはアマーシャムバックラ−（Ａａ＋ｅｒｓｈａ＋ＩＢ
ｕｃｈｌｅｒ、Ｂｒａｕｎｓｅｈｗｃｉｇ ）から購入
できる。
例３のようにして得られた混合物の３μｇを、水冷しつ
つ、アマ−ジャムから購入して使用直前に融解した細菌
抽出物と完全に混合した。混合物を、２０℃で３０〜６
０分間インキュベーションし、その後２００ ｕｎのＳ
Ｍ緩衝液（１００ｍＭＮａＣｊｌ）、１０ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ４，５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５））を添加
した。この混合物は、直接形質転換反応に用いるか、又
は後の使用まで１０℃ｇのクロロホルムを添加して４℃
で貯蔵した。
つ、アマ−ジャムから購入して使用直前に融解した細菌
抽出物と完全に混合した。混合物を、２０℃で３０〜６
０分間インキュベーションし、その後２００ ｕｎのＳ
Ｍ緩衝液（１００ｍＭＮａＣｊｌ）、１０ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ４，５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５））を添加
した。この混合物は、直接形質転換反応に用いるか、又
は後の使用まで１０℃ｇのクロロホルムを添加して４℃
で貯蔵した。
例５ ： Ｅ、 ｃｏｌｉＤＧ ３０の形質転換（ｔｒ
ａｎｓｄｕ−ｃＬｉｏｎ ） １９６、バクトドリプトン（Ｂａｅｔｏ ＴｒｙｐＬｏ
ｎｅ）、（１，５９（ｉ酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘ
ｔｒａｃｔ ）および０．５９６ＮａＣ１から成るＬブ
ロースの５ｍｌに０．４９６マルトースを添加し、この
混合物に、５０℃ｇの増殖定常期にあるＥ、 ｃｏｌｉ
Ｄ Ｇ ３０の液体培養を接種した。これを、初期定常
期に到達するまで、３７℃１２時間培養した。この細菌
を遠心沈殿させ、ｌＱｍＭのＭｇＣ（１２溶液２．５ｍ
１に注意深く再ｌｆ遊させた。例４からの混合物１０μ
ｇを、この濃縮細菌浮遊液２０μｇと混合し、この混合
物を室温で５０分間インキュベーションした。
ａｎｓｄｕ−ｃＬｉｏｎ ） １９６、バクトドリプトン（Ｂａｅｔｏ ＴｒｙｐＬｏ
ｎｅ）、（１，５９（ｉ酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘ
ｔｒａｃｔ ）および０．５９６ＮａＣ１から成るＬブ
ロースの５ｍｌに０．４９６マルトースを添加し、この
混合物に、５０℃ｇの増殖定常期にあるＥ、 ｃｏｌｉ
Ｄ Ｇ ３０の液体培養を接種した。これを、初期定常
期に到達するまで、３７℃１２時間培養した。この細菌
を遠心沈殿させ、ｌＱｍＭのＭｇＣ（１２溶液２．５ｍ
１に注意深く再ｌｆ遊させた。例４からの混合物１０μ
ｇを、この濃縮細菌浮遊液２０μｇと混合し、この混合
物を室温で５０分間インキュベーションした。
さらにＬブロース２００μｇを添加し、時折振盪しつつ
、この混合物を３７℃で１時間インキュベーションした
。この混合物の５０℃ｇを、テトラサイクリンを２０℃
ｇ ／ ｍｌ含むＬブロース寒天にまいた。この寒天平
板を３７℃で少なくとも１２時間培養した。この記載し
た方法にしたがって、混合物から平均１０００個のコロ
ニーをｉＩ７ることかできた。
、この混合物を３７℃で１時間インキュベーションした
。この混合物の５０℃ｇを、テトラサイクリンを２０℃
ｇ ／ ｍｌ含むＬブロース寒天にまいた。この寒天平
板を３７℃で少なくとも１２時間培養した。この記載し
た方法にしたがって、混合物から平均１０００個のコロ
ニーをｉＩ７ることかできた。
例６ ： ａｓｐ Ｃ又はｉｌｖ’Ｅ又はｔｙｒ Ｂ遺
伝子をもつＥ、ｃｏｌｌＤＧ３０の選別 すでに記載した方法でＥ、ｃｏｌｌＤＧ３０の形質転換
後、２０℃ｇ ／ ｍｌのテトラサイクリンを含むしブ
ロース寒天上で得られたおよそ８００個のコロニーを最
少寒天培地に釣り上げた。最少寒天培地は、アミノ酸の
イソロイシン、ロイシン、バリン、アスパラギン酸（ａ
ｓｐａｒｔｌｃ ａｃｉｄ ）およびフェニルアラニン
を補充したグルコース入りＭ９培地（ミラー（Ｍｉｌｌ
ｅｒ） 、 ＥｘｐｅｒｉＩＩｌｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｃ
ｌｃｃｕ−Ｉａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 、Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 １９７２ ）から成っ
ていた。しかしながら、アミノ酸のチロシンはＤＧ３０
株は同様に合成することはできないのであるが、この培
地には添加されなかった。
伝子をもつＥ、ｃｏｌｌＤＧ３０の選別 すでに記載した方法でＥ、ｃｏｌｌＤＧ３０の形質転換
後、２０℃ｇ ／ ｍｌのテトラサイクリンを含むしブ
ロース寒天上で得られたおよそ８００個のコロニーを最
少寒天培地に釣り上げた。最少寒天培地は、アミノ酸の
イソロイシン、ロイシン、バリン、アスパラギン酸（ａ
ｓｐａｒｔｌｃ ａｃｉｄ ）およびフェニルアラニン
を補充したグルコース入りＭ９培地（ミラー（Ｍｉｌｌ
ｅｒ） 、 ＥｘｐｅｒｉＩＩｌｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｃ
ｌｃｃｕ−Ｉａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 、Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 １９７２ ）から成っ
ていた。しかしながら、アミノ酸のチロシンはＤＧ３０
株は同様に合成することはできないのであるが、この培
地には添加されなかった。
釣り上げた８００個のコロニーのうち、７個がこの最少
培地で増殖することができた。
培地で増殖することができた。
Ｅ、ｃｏｌｉＤＧ３０中の想定できる３種の遺伝子、ａ
ｓｐ Ｃ，ｉｌｖ ＥおよびＬｙｒ Ｂ遺伝子を特定す
るために、この７個のクローンを再び上記記載の最少培
地に釣り上げた。この最少培地には、表記したアミノ酸
が補充されているが、各列に於いていずれか一種のアミ
ノ酸がのぞかれており、このアミノ酸に対して、ａｓｐ
Ｃ又はｉｌｖ Ｅ又はｔｙｒ Ｂ遺伝子−のうぢのひ
とつがコードするトランスアミナーゼが基質特異性を示
す。結果は下表に示されている。
ｓｐ Ｃ，ｉｌｖ ＥおよびＬｙｒ Ｂ遺伝子を特定す
るために、この７個のクローンを再び上記記載の最少培
地に釣り上げた。この最少培地には、表記したアミノ酸
が補充されているが、各列に於いていずれか一種のアミ
ノ酸がのぞかれており、このアミノ酸に対して、ａｓｐ
Ｃ又はｉｌｖ Ｅ又はｔｙｒ Ｂ遺伝子−のうぢのひ
とつがコードするトランスアミナーゼが基質特異性を示
す。結果は下表に示されている。
クローン アミノ酸添加最少培地 想定されるからのぞ
かれるアミノ酸 遺伝子 Ａｓｐ Ｌｃｕ ｌｉｅ Ｔｙｒｌ ＋
＋ −＋ ｔｙｒＢ２＋＋−＋ｔｙｒｓ ３ − ＋−＋ ＋ −１１ｖＥ４
− ＋−＋ ＋ −１ｌｖＥ５ ＋
＋ −＋ Ｌｙｒ Ｂ６ ＋
＋ −＋ ｔｙｒＢ７ − ＋−＋
＋ −１１ｖＥ＋ ：増殖良好 ＋−：増殖不良 −：増殖なし 例７：１１ｖＥ遺伝子の位置決定 例６のようにして得たクローン１〜７からマニアーチス
ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ａｔ ａｌ、 ）の方法による
最少溶菌で（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
３６６−３７０ページ、１９８２）コスミドＤＮＡ
を得た。このコスミドＤＮＡを、Ｅ、ｃｏｌｉＤＨｌ
（ＡＴＣＣ３３８４９）に導入し、それから高収量で再
びコスミドＤＮＡを再分離することができた。本来Ｅ。
かれるアミノ酸 遺伝子 Ａｓｐ Ｌｃｕ ｌｉｅ Ｔｙｒｌ ＋
＋ −＋ ｔｙｒＢ２＋＋−＋ｔｙｒｓ ３ − ＋−＋ ＋ −１１ｖＥ４
− ＋−＋ ＋ −１ｌｖＥ５ ＋
＋ −＋ Ｌｙｒ Ｂ６ ＋
＋ −＋ ｔｙｒＢ７ − ＋−＋
＋ −１１ｖＥ＋ ：増殖良好 ＋−：増殖不良 −：増殖なし 例７：１１ｖＥ遺伝子の位置決定 例６のようにして得たクローン１〜７からマニアーチス
ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ａｔ ａｌ、 ）の方法による
最少溶菌で（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
３６６−３７０ページ、１９８２）コスミドＤＮＡ
を得た。このコスミドＤＮＡを、Ｅ、ｃｏｌｉＤＨｌ
（ＡＴＣＣ３３８４９）に導入し、それから高収量で再
びコスミドＤＮＡを再分離することができた。本来Ｅ。
ｃｏｌｉＤＧ３０のクローン３から得られた（例６参照
）プラスミドＤＮＡを、このＤＮＡで形質転換したＥｃ
ｏｌｉＤＨ１株から分離し、製造元のニューイングラン
ドバイオラブ社の指示にしたがって、制限酵素Ｓａｔ
１および５ｏｄａ Ｉで完全に消化した。
）プラスミドＤＮＡを、このＤＮＡで形質転換したＥｃ
ｏｌｉＤＨ１株から分離し、製造元のニューイングラン
ドバイオラブ社の指示にしたがって、制限酵素Ｓａｔ
１および５ｏｄａ Ｉで完全に消化した。
ベクターｐＢＲ３２２を同様にＳａｌ ｒ、 Ｐｖｕ
Ｉ １およびＡｖａ Ｉで完全に消化した。Ａｖａ
Ｉで消化したのは、ｐＢＲ３２２から生じたＳａｔ
Ｉ −８ＩＩａ １フラグメントが再びベクターに連結
されるのを防ぐためである。この二種類のＤＮＡを混合
し、例４ですでに述べた方法で連結し、このリガーゼ混
合物の適量、例えば１０μｇ１でＥ、 ｃｏｌｉＡＴｃ
Ｃ１１３０３株の受容菌を形質転換した。アンピシリン
５０μｇ ／ ｍｌを含むしブロース平板で耐性コロニ
ーを選別し、最少溶菌でプラスミドＤＮＡを分離し、こ
のＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ Ｉで完全消化して、大き
さの変化をしらべた。
Ｉ １およびＡｖａ Ｉで完全に消化した。Ａｖａ
Ｉで消化したのは、ｐＢＲ３２２から生じたＳａｔ
Ｉ −８ＩＩａ １フラグメントが再びベクターに連結
されるのを防ぐためである。この二種類のＤＮＡを混合
し、例４ですでに述べた方法で連結し、このリガーゼ混
合物の適量、例えば１０μｇ１でＥ、 ｃｏｌｉＡＴｃ
Ｃ１１３０３株の受容菌を形質転換した。アンピシリン
５０μｇ ／ ｍｌを含むしブロース平板で耐性コロニ
ーを選別し、最少溶菌でプラスミドＤＮＡを分離し、こ
のＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ Ｉで完全消化して、大き
さの変化をしらべた。
例８ニドランスアミナーゼ活性試験
例７のように得られたクローンを特定の試験で脂肪族ト
ランスアミナーゼ、すなわちｉｌｖ Ｅ遺伝子産物、の
活性についてしらべた。出発法の未形質転換Ｅ、 ｃｏ
ｌｉＡＴｃ Ｃ１１３０３を比較のために用いた。この
測定で、−例に於いて著明な１ｌｖＥ活性の増加、出発
法のＥ、 ｃｏｌｉＡＴ ＣＣ１１３０３と比較して１
０倍以上の増加がみとめられた。
ランスアミナーゼ、すなわちｉｌｖ Ｅ遺伝子産物、の
活性についてしらべた。出発法の未形質転換Ｅ、 ｃｏ
ｌｉＡＴｃ Ｃ１１３０３を比較のために用いた。この
測定で、−例に於いて著明な１ｌｖＥ活性の増加、出発
法のＥ、 ｃｏｌｉＡＴ ＣＣ１１３０３と比較して１
０倍以上の増加がみとめられた。
適切なマーカーを用いたアガロースゲル電気泳動で、こ
のｉｌｖ Ｅ遺伝子活性増加法は、ＡＴＣＣ１１３０３
からのおよそＩＭＤの大きさのフラグメントをとりこん
だｐＢＲ３２２ベクターを含んでいることを示すことが
できた。分離したプラスミドを用いて、プラスミドをも
たないＥ、 ｃｏｌｉＡＴＣＣ１１３０３株を形質転換
した時、全列に於いて、１０倍以上のｌｌｖ Ｅ遺伝子
活性の増加を観察することができた。
のｉｌｖ Ｅ遺伝子活性増加法は、ＡＴＣＣ１１３０３
からのおよそＩＭＤの大きさのフラグメントをとりこん
だｐＢＲ３２２ベクターを含んでいることを示すことが
できた。分離したプラスミドを用いて、プラスミドをも
たないＥ、 ｃｏｌｉＡＴＣＣ１１３０３株を形質転換
した時、全列に於いて、１０倍以上のｌｌｖ Ｅ遺伝子
活性の増加を観察することができた。
例９ ： Ｉｌｖ Ｅ遺伝子の温度誘発による発現およ
そＩＭＤのＳａｌ Ｉ −８ＩＩａ Ｉフラグメント
としてクローニングされたＥ、 ｃｏｌｉＡＴ ＣＣ１
１３０３のＤＮＡフラグメントは、天然のプロモーター
をもたないｉｌｖ Ｅ遺伝子を含んでいる。この遺伝了
の発現は、むしろ、Ｓａｔ ＩおよびＰｖｕ Ｉ Ｉ
で消化したｐＢＲ３２２にクローニングした後、ｐＢＲ
３２２のテトラサイクリンプロモーターから開始する転
写（ｉｌｖ Ｅに対応するｍＲＮＡの翻訳がこれに続く
）によって影響される。ｐＢＲ３２２からのこのテトラ
サイクリンプロモーターは、比較的強力でかつ高収量で
蛋白を産生ずるけれども、温度変化によって制御されて
いない。ｉｌｖ Ｅの発現を温度で調節することができ
るように、１１νＥ遺伝子の５′末端にテトラサイクリ
ンプロモーターをもつＳａｌ Ｉ −ＥｃｏＲＩフラ
グメントを、λファージのＰＲプロモーター及び温度感
受性リプレッサー遺伝子ｃ １８５７が存在する５ａｌ
ｌ−ＥｅｏＲＩフラグメントで置換する。ベクターｐＣ
ＱＶ２がこのフラグメントの起源として働く （クイー
ン（Ｑｕｅｅｎ ） 、 Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅ −ｔｉｃｓ ２．１−１０
．１９８３）。ベクターｐＣＱＶ２を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＳａｔ Ｉで完全に消化する。例８のようにし
て得たベクターを同様にこれらの酵素で完全に消化する
。これには、このＤＮＡに同時にこの特定の酵素を添加
し、混合物を３７℃１時間ＲＥＢｆｉ衝ｉ＆ （５０ｍ
ＭＮａ ｃｌ 。
そＩＭＤのＳａｌ Ｉ −８ＩＩａ Ｉフラグメント
としてクローニングされたＥ、 ｃｏｌｉＡＴ ＣＣ１
１３０３のＤＮＡフラグメントは、天然のプロモーター
をもたないｉｌｖ Ｅ遺伝子を含んでいる。この遺伝了
の発現は、むしろ、Ｓａｔ ＩおよびＰｖｕ Ｉ Ｉ
で消化したｐＢＲ３２２にクローニングした後、ｐＢＲ
３２２のテトラサイクリンプロモーターから開始する転
写（ｉｌｖ Ｅに対応するｍＲＮＡの翻訳がこれに続く
）によって影響される。ｐＢＲ３２２からのこのテトラ
サイクリンプロモーターは、比較的強力でかつ高収量で
蛋白を産生ずるけれども、温度変化によって制御されて
いない。ｉｌｖ Ｅの発現を温度で調節することができ
るように、１１νＥ遺伝子の５′末端にテトラサイクリ
ンプロモーターをもつＳａｌ Ｉ −ＥｃｏＲＩフラ
グメントを、λファージのＰＲプロモーター及び温度感
受性リプレッサー遺伝子ｃ １８５７が存在する５ａｌ
ｌ−ＥｅｏＲＩフラグメントで置換する。ベクターｐＣ
ＱＶ２がこのフラグメントの起源として働く （クイー
ン（Ｑｕｅｅｎ ） 、 Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、ａｎｄ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅ −ｔｉｃｓ ２．１−１０
．１９８３）。ベクターｐＣＱＶ２を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＳａｔ Ｉで完全に消化する。例８のようにし
て得たベクターを同様にこれらの酵素で完全に消化する
。これには、このＤＮＡに同時にこの特定の酵素を添加
し、混合物を３７℃１時間ＲＥＢｆｉ衝ｉ＆ （５０ｍ
ＭＮａ ｃｌ 。
１０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７，５，６ｍＭ２−メルカ
プトエタノール、６ｍＭＭｇＣΩ２．ｔｏ。
プトエタノール、６ｍＭＭｇＣΩ２．ｔｏ。
μｇ ／ ｍｌウシ血清アルブミン、０．０１９６非イ
オン性界而活性剤（ＲＴｒｌｔｏｎ Ｘ−１００）
）でインキュベーションすることになる。混合物の全容
積は５０ｕｌ）で、ＤＮＡ濃度は２０μｇ／ｍｌである
。消化の完全さは、混合物の各々の５μｇ容量を、アガ
ロースゲルで電気泳動してしらべる。この二種の混合物
を６５℃で１０分間加熱し、制限酵素をフェノール処理
で除き、さらに切断プラスミドＤＮＡはエタノール沈殿
とそれに続＜７０９７；エタノールによる洗浄で精製す
る。真空中で乾燥してから、それぞれのＤＮＡを５０μ
ｇのＴＥｉ衝誠に再浮遊させ、各浮遊液の１０μｇを同
一容器に入れる。この混合物を酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
にとって最適であるように製造元にューイングランドバ
イオラブ社）が推奨する溶液（ｍｅｄｉｕｍ）に調製し
、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加する。混合物を
１６℃で１６時間インキュベーションし、この１０ ｔ
ｔΩでＥ、 ｃｏｌｉＨＢ １０１株の受容細胞を形質
転換する。アンピシリン耐性コロニーを選別し、最少溶
菌後、これらのクローンのプラスミドＤＮＡを、制限酵
素Ｓａｌ Ｉ及びＥｃｏＲＩで二重消化する。アガロ
ースゲル電気泳動により、予想したフラグメントパター
ンをもつプラスミドを含むコロニーを識別することがで
きる。
オン性界而活性剤（ＲＴｒｌｔｏｎ Ｘ−１００）
）でインキュベーションすることになる。混合物の全容
積は５０ｕｌ）で、ＤＮＡ濃度は２０μｇ／ｍｌである
。消化の完全さは、混合物の各々の５μｇ容量を、アガ
ロースゲルで電気泳動してしらべる。この二種の混合物
を６５℃で１０分間加熱し、制限酵素をフェノール処理
で除き、さらに切断プラスミドＤＮＡはエタノール沈殿
とそれに続＜７０９７；エタノールによる洗浄で精製す
る。真空中で乾燥してから、それぞれのＤＮＡを５０μ
ｇのＴＥｉ衝誠に再浮遊させ、各浮遊液の１０μｇを同
一容器に入れる。この混合物を酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
にとって最適であるように製造元にューイングランドバ
イオラブ社）が推奨する溶液（ｍｅｄｉｕｍ）に調製し
、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加する。混合物を
１６℃で１６時間インキュベーションし、この１０ ｔ
ｔΩでＥ、 ｃｏｌｉＨＢ １０１株の受容細胞を形質
転換する。アンピシリン耐性コロニーを選別し、最少溶
菌後、これらのクローンのプラスミドＤＮＡを、制限酵
素Ｓａｌ Ｉ及びＥｃｏＲＩで二重消化する。アガロ
ースゲル電気泳動により、予想したフラグメントパター
ンをもつプラスミドを含むコロニーを識別することがで
きる。
この方法で識別したクローンのうちの二つをＬＢ培養液
（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ） 、上掲書）で、３０℃又は
３７℃で培養する。３７℃で培養した、ここで得られた
細菌のＮｖ Ｅ遺伝子産物の酵素活性′値は、プラスミ
ドをもたない対照株のそれの５〜１０倍である。３０℃
で培養したこのクローンの酵素活性について調べた数値
は、プラスミドを持たない比較対照株のそれと実質的に
同一である。
（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ） 、上掲書）で、３０℃又は
３７℃で培養する。３７℃で培養した、ここで得られた
細菌のＮｖ Ｅ遺伝子産物の酵素活性′値は、プラスミ
ドをもたない対照株のそれの５〜１０倍である。３０℃
で培養したこのクローンの酵素活性について調べた数値
は、プラスミドを持たない比較対照株のそれと実質的に
同一である。
これに対して、この細菌を３０℃で培養し、それから培
養物の温度を６５℃の水槽中で振盪することにより４５
℃まで上昇させ、この培養物をさらに３７℃で２時間イ
ンキュベーションすると、測定できる酵素活性は少なく
ともｘｏイ＊増加する。
養物の温度を６５℃の水槽中で振盪することにより４５
℃まで上昇させ、この培養物をさらに３７℃で２時間イ
ンキュベーションすると、測定できる酵素活性は少なく
ともｘｏイ＊増加する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ１１３０３から分
離されたｉｌｖＥ遺伝子を含む増殖性染色体外因子。 ２、染色体外因子がマルチコピープラスミドである、特
許請求の範囲第１項に記載の染色体外因子。 ３、マルチコピープラスミドがｐＢＲ３２２に由来する
、特許請求の範囲第２項に記載の染色体外因子。 ４、脂肪族トランスアミナーゼの合成のための、特許請
求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の染色
体外因子の使用。 ５、以下のａ）〜ｃ）の段階から成り、かつ微生物に於
いて分枝鎖アミノ酸の過剰生産のための、特許請求の範
囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の染色体外因
子の使用。 ａ）微生物への該染色体外因子の導入。 ｂ）微生物におけるｉｌｖＥ遺伝子の発現および活性な
脂肪族トランスアミナーゼの合成。 ｃ）トランスアミナーゼによる適切なケト前駆体のアミ
ノ化の惹起。 ６、微生物が腸内細菌である、特許請求の範囲第５項に
記載の使用。 ７、微生物がＥ．ｃｏｌｉである、特許請求の範囲第５
項に記載の使用。 ８、微生物がＥ．ｃｏｌｉＡＴＣＣ１１３０３及びその
変種及び突然変異体である、特許請求の範囲第６項に記
載の使用。 ９、特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に
記載の染色体外因子で形質転換したＥ．ｃｏｌｉＡＴＣ
Ｃ１１３０３及びその変種及び突然変異体。 １０、Ｅ．ｃｏｌｉＡＴＣＣ１１３０３およびその変種
および突然変異体から得られうるｉｌｖＥ遺伝子。 １１、温度で調節されうるλＰＲプロモーターの制御の
下にある、特許請求の範囲第１０項記載のｉｌｖＥ遺伝
子から成る遺伝子構造。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3636722.2 | 1986-10-29 | ||
| DE19863636722 DE3636722A1 (de) | 1986-10-29 | 1986-10-29 | Klonierung und verwendung des transaminase-gens ilve |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63129986A true JPS63129986A (ja) | 1988-06-02 |
Family
ID=6312683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62274613A Pending JPS63129986A (ja) | 1986-10-29 | 1987-10-29 | トランスアミナーゼ遺伝子ｉｌｖＥのクローニング及びその使用 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5120654A (ja) |
| EP (1) | EP0265852A3 (ja) |
| JP (1) | JPS63129986A (ja) |
| KR (1) | KR880005271A (ja) |
| CN (1) | CN87107205A (ja) |
| AU (1) | AU8042587A (ja) |
| CA (1) | CA1340676C (ja) |
| DE (1) | DE3636722A1 (ja) |
| DK (1) | DK565487A (ja) |
| FI (1) | FI874725A7 (ja) |
| IE (1) | IE872891L (ja) |
| IL (1) | IL84293A0 (ja) |
| NO (1) | NO874490L (ja) |
| PT (1) | PT86034B (ja) |
| ZA (1) | ZA878081B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023503077A (ja) * | 2019-12-06 | 2023-01-26 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 新規な分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体及びそれを用いたロイシン生産方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3786707D1 (de) * | 1986-06-04 | 1993-09-02 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch transaminierung. |
| DE3818851A1 (de) * | 1988-06-03 | 1989-12-14 | Hoechst Ag | Neue transaminase, ihre herstellung und ihre verwendung |
| DE3932015A1 (de) | 1988-12-15 | 1991-04-04 | Hoechst Ag | Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, mikroorganismen, die dieses gen exprimieren, und transaminierungsverfahren unter verwendung des expressionsprodukts |
| USD404096S (en) | 1996-12-09 | 1999-01-12 | Wiedner Mark C | Basketball backboard cover |
| RU2243260C2 (ru) * | 2002-06-25 | 2004-12-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-лейцина (варианты), штамм escherichia coli 505/pacyc-tyr b - продуцент l-лейцина |
| RU2015120052A (ru) * | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
Family Cites Families (3)
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| GB8403244D0 (en) * | 1984-02-07 | 1984-03-14 | Searle & Co | Aminoacids via bioconversion |
| EP0189938A2 (en) * | 1985-02-01 | 1986-08-06 | G.D. Searle & Co. | Process for the preparation of L-DOPA |
-
1986
- 1986-10-29 DE DE19863636722 patent/DE3636722A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-10-23 EP EP87115528A patent/EP0265852A3/de not_active Withdrawn
- 1987-10-27 IL IL84293A patent/IL84293A0/xx unknown
- 1987-10-27 FI FI874725A patent/FI874725A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-10-28 NO NO874490A patent/NO874490L/no unknown
- 1987-10-28 DK DK565487A patent/DK565487A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-10-28 ZA ZA878081A patent/ZA878081B/xx unknown
- 1987-10-28 CN CN198787107205A patent/CN87107205A/zh active Pending
- 1987-10-28 CA CA000550516A patent/CA1340676C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-28 IE IE872891A patent/IE872891L/xx unknown
- 1987-10-28 AU AU80425/87A patent/AU8042587A/en not_active Abandoned
- 1987-10-29 KR KR870011999A patent/KR880005271A/ko not_active Withdrawn
- 1987-10-29 PT PT86034A patent/PT86034B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-10-29 JP JP62274613A patent/JPS63129986A/ja active Pending
-
1990
- 1990-08-13 US US07/566,320 patent/US5120654A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023503077A (ja) * | 2019-12-06 | 2023-01-26 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 新規な分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体及びそれを用いたロイシン生産方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA878081B (en) | 1988-10-26 |
| FI874725A0 (fi) | 1987-10-27 |
| PT86034A (de) | 1987-11-01 |
| DE3636722A1 (de) | 1988-05-05 |
| IL84293A0 (en) | 1988-03-31 |
| EP0265852A2 (de) | 1988-05-04 |
| US5120654A (en) | 1992-06-09 |
| PT86034B (pt) | 1990-08-31 |
| AU8042587A (en) | 1988-05-05 |
| CA1340676C (en) | 1999-07-27 |
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| NO874490D0 (no) | 1987-10-28 |
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| EP0265852A3 (de) | 1988-11-09 |
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