JPS5923795B2 - 組織培養によるピレトリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組織培養によるピレトリンの製造法に関する。

ビレ） ＩＪンは、除虫菊植物に比較的多く含有される
物質であり、ゴキブ１八ハエ、蚊、ノミ、家ダニ、アブ
ラムシ、アオムシ、ウンカ、ヨコバイ等の各種害虫に対
し強力且つ速効性殺虫力を示し、しかも人体に対しては
極めて低毒性である所から、このピレトリン又は之を含
有する除虫菊は古くから植物性殺虫剤として農薬、除疫
、家庭用等で汎用されている。

しかるに上記除虫菊は、その収穫までには通常２年程度
の長期間の管理を要し、収穫量は気候風土等の自然条件
に左右される。

本発明者らは自然条件に影響されることなくしかも短時
間に目的とするビ／トリンを得る方法に一つきかねてよ
り研究を重ねてきた。

その過程において、上記除虫菊の植物組織片を培養して
カルス化させることに成功し、しかもこのカルスには通
常の栽培品と同様にピレトリンが含有されることを見い
出しここに本発明を完成するに至った。

即ち本発明はキク科に属するシロバナムショケギクの組
織を培養してカルス化させ、該カルスを培養し増殖もし
くは再分化させ、ピレトリンを採取することを特徴とす
る組織培養によるピレトリンの製造法に係る。

従来よの薬用植物等については、之を組織培養してカル
ス化するに成功した例が報告され【いるが、除虫菊植物
を組織培養した例は勿論皆無である。

しかも一般に組織培養法により得られるカルスには、通
常の栽培品とは異なり有用成分が全く検出されなくなっ
たり又は検出されてもその量が非常に少なく実用的でな
いことが知られている。

これに対して本発明は初めて除虫菊植物の組織培養に着
手し、該植物のカルス化に成功すると共に、とのカルス
には通常の栽培品と同様にピレトリンが検出され、従っ
てこのカルスの増殖によってピレトリンを極めて短期間
に、しかも何ら自然条件に影響されることなく安定して
収得することを可能としたものであり、その工業的価値
は顕著である。

本発明方法を適用する除虫菊植物としては、具体的には
サク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）に属するシロバナムシ
ョケギク（ＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍＣｉ ｎｅｒａ
ｒ ｉａｅ ｆｏ Ｉ ｉ ｕｍ）を挙げ得る。

本発明ではこの除虫菊植物の細胞を培養してカルス化さ
せる。

培養に先立ち植物を殺菌処理する。

これは常法に従えばよく通常は、植物を水洗後輩、葉柄
、根、花部等に分は之等の適当な切片を作製し、之を例
えば５係次亜塩酸ナトリウム液中に５〜１５分間浸漬し
次いで滅菌水で洗浄することにより行ない得る。

培養に当り上記切片は更に必要に応じ０．５〜２．０ｃ
ｒｆＬ程度に無菌的に切断されるのが望ましい。

次ｌこ上記切片を培地に移植する。

培地としては、植物組織培養に一般に用いられる洒常の
各種無機培地がいずれも使用できる。

具体的にこの無機培地としては例えばムラシゲアンドス
クーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆Ｓｋｏｏｇ ）、
ブラウンアンドウッド培地ＣＢｒａｗｎ ＆ Ｗｏｏｃ
’ ）、ヨンダ培地（Ｙｏｓｈ ｉｄａ ）等を好まし
く使用できる。

之等無機培地には、ビタミン類、アミノ酸類、各種抽出
物エキス、生長調節物質、糖類等の既知の添加剤を添加
できる。

ビタミン類としては、例えばニコチン酸、サイアミン、
ピリドキシン、ミオイノシトール、リボフラビン、パン
トテン酸カルシウム、葉酸、ビオチン、アスコルビン酸
、ニコチン酸アミド等を０〜３００ ｐｐｍ 濃度で、
アミノ酸類としては例えばグリシン、グルタミン酸、グ
ルタミンｆｌｌＮａ、アルギニン、システィン、フェニ
ールアラニン、チロシン等をＯ〜５００ ｐｐｍ濃度で
、天然物、抽出エキス類としては例えばカザミノ酸、酵
母エキス、ココナツツミルク、麦芽エキス等を０〜５０
００ ｐｐｍ 濃度で、生長調節物質としてはオーキシ
ン類、例えば３〜インドール酢酸（ＩＡＡ）、α−ナフ
チル酢酸（ＮＡＡ）、３−イア トール酪酸（Ｉ ＢＡ
）、２．４−ジクロルフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）
等を１０−３〜５×１１０２ｐｐ濃度でまたカイエン類
例えばカイネチン、６−ベンジルアデニン等を０〜２０
ｐｐｍ濃度で更にジベレリンを０〜１０ｐｐｍ濃度で、
糖類としては例えば蔗糖、グルコース、フラクトース等
を０．４〜４重量係配合することができ、之等は組合わ
せて添加する事により効率よくカルス化を行なわせ得る
。

植物組織片の細胞増殖によるカルス化は、明又は暗所下
で、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜３０°Ｃの培養条件下
に進行し、約１〜６週間で完全なカルスが収得できる。

特に明所例えば３００〜２００００ルックス程度の照度
下に培養を行なえばクロロフィルの生産により、所謂緑
化カルスが収得される。

本発明ではかくして得られるカルスを次いで好ましくは
生長調節物質である例えばオーキシン等を添加して、通
常の液体培養法又は固型培養法に従い継代培養して増殖
させ、培養開始後４日〜６週間で目的とするピレトリン
を収獲できる。

また本発明では上記カルスもしくは増殖カルスを更に培
養して再分化せしめ得、これにより得られる再分化物か
ら目的とするビレｌ−ＩＪンを収獲することもできる。

ここでカルスの再分化は、例えばカルスをオーキシン類
Ｏ〜１０ｐｐｍ、カイニン類０〜２０ｐｐｍを単独また
は組合せて添加した培地に移植し、光源として太陽光線
または白色光３００〜２００００ルツクスの照射下に２
〜６週間培養することにより実施でき、これにより原基
、根、葉が生ずる。

また上記で得られる再分化物は、之を生長調節剤無添加
培地に移植後同様の照射を続けることにより完全な個体
として生長し、該個体は一般栽培品と同一の特長を備え
之を土壌に移し栽培することにより開花する。

本発明方法によれば培養によってピレトリンを含有する
カルス、カルスの再分化物及び再分化物からの生長個体
が得られ、また２等カルス等の培養に用いる培地中にも
相当量のピレトリンが含有される。

このことは収獲したカルス等を常法に従い石油エーテル
及びニトロメタンで順次抽出し、抽出物をｎ−ヘキサン
に溶解して得た検体を、世界標準除虫菊エキス（Ｗｏｒ
ｔｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｐｙｒｅｔｈｒｕｍ Ｅｘｔｒ
ａｃｔ ：Ｗ、Ｓ、Ｐ、Ｅ ）を標準とする薄層クロ
マトグラフィー、ガスクロマトグラフィー及びピレスロ
ロンの特異的発色反応であるオルトＩＪン酸法による発
色試験に供した結果、いずれの検体も標品と同一の特注
を示すことから確認される。

また上記各検体の殺虫効力は、次の検定法（衛生動物検
査指針中の蚊幼虫に対する浸漬試験）により確認できる
。

即ち検体の一定量を２５０１１Ｌｌ腰高シヤーレに入れ
、溶媒を蒸散後０．１係「ツイーン（Ｔｗｅｅｎ） ８
０ Ｊ液１１ｒＬｌを滴下し、エキス分と充分混和及び
乳化させ、これに蒸留水１９９ｍ１を加え更に充分混合
後（この時のツイン８０濃度は５ｐｐｍ）、この中にア
カイエカ４４初期の供試虫３０頭を放ち２５℃、２４時
間保持した後死亡率を求める。

この試験において前記Ｗ。Ｓ、Ｐ、Ｅ、を標準として比
較し３回の平均死亡率を求めた結果本発明方法により得
られる各検体はいずれも充分な殺虫効力を有することが
確認された。

以下本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。

実施例 １ シロバナムショケギク植物体をよく水洗い後、根、茎、
葉柄部分に切断し更に長さ５〜８ｃｒｎ程度に切る。

５チ次亜塩素酸ナトリウム溶液にて殺菌処理後滅菌水に
てよく洗浄し、これを無菌的に約１ｃ１１′Ｌの長さに
切断し、組織片を各々下記の培地を１０１１Ｌｌづつ注
入した別々の試験管に置床した。

第１表 培地組成 ＫＮＯ３１９００ｍ？／Ｉ Ｎ Ｈ４Ｎ Ｏａ １６５０
ｔｔＣａＣｌｌ 、２Ｈ０４４０／／ ２ ２ Ｍ、！ｉｉ！ＳＯ、７Ｈ０３７０ｔｔ ４ ２ Ｋ Ｈ２Ｐ ０４ １７０ ｔｔ
Ｎａ２ ＥＤＴＡ ３７．３ ／ｌ
Ｆ ｅ Ｓ Ｏ−７Ｈ２０２７，８ｔｔ Ｍ ｎ Ｓ Ｏ−４Ｈ２０２２，３ｔｔ Ｚｎ５Ｏ−７Ｈ２０８，６” Ｈ２ＢＯ３６，２〃 ＣｏＣ＃２ ．６Ｈ２００，０２５／／ Ｃｕ Ｓ Ｏ−５Ｈ２００，０２５ｔｔ Ｎａ ＭａＯ−２Ｈ２００，２５／／ ２ ４ ＫＩ ０１８３ 〃ミオ、
イノジット １００ ｍ９／ｌ！サイア
ミン−ＨＣ１３０，１ｔｔ ピリドキシン、ＨＣ＃ ０．５ ／／ニ
コチン酸 ０．５〃 ２．４−ジクロルフェノキシ酢酸 １ 〃カ
イネチン ０．２〃シヨ糖
３００００ ｔｔ寒天 、
１００００ ｔｔ蒸留水 １１
とする量 尚培地のｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムの添加により
５．８に調整した。

またこの培地は１２１℃で１５分間オートクレーブ処理
することにより滅菌したものである。

暗所下、２５℃の静置培養で１〜２週間頃より置床した
組織片の一部にカルス化が認められ、■〜６週間で完全
にカルスの状態になった。

これを約２週間毎に新しい培地に移し、同じ条件下で培
養を続ける。

この期間十分に生長したカルスは継代培養する事が可能
であった。

実施例 ２ 実施例１で誘導したカルスを第１表記載の培地組成中の
２，４−ジクロルフェノキシ酢酸を０．２〜／ｌとした
培地上に移植し２５℃、１０００ルツクスの白色光下に
て培養し１週間毎に新しい培地に移し同条件下で培養を
続ける。

培養を重ねるにつれカルスは緑化し、約２ケ月で緑化カ
ルスが誘導される。

実施例 ３ 実施例１で誘導したカルスを第１表記載の培地組成中の
２．４−ジクロルフェノキシ酢酸の替りにα−ナフチル
酢酸０．１ ｍｙ／ １３を用いかつカイネチンを２ｍ
ｙ／１１とした培地上に移植し２５℃、１０００ルツク
スの白色光下にて培養する。

培養を重ねるにつれカルスは緑化、再分化現象が起り、
約２週間で発根、４〜６週間で発芽が認められる。

更に生長調節物質無添加培地に移植し、培養を継続する
と約４週間後にほぼ完全な除虫菊の植物個体が得られる
。

これは土壌を入れた鉢に移し、水分に注意しながら太陽
光線を照射し栽培すると、やがて生長個体となり根、葉
も発達し、開花する。

上記実施例１〜３にて得られたカルス、増殖培地、生長
個体栽培品の分析の実施について以下に記す。

実施例１〜３で得られたカルス、生長個体、栽培品を３
５〜４０℃で減圧乾燥後、暗所培養カルス５２Ｉ、緑化
カルス２４Ｉ、生長個体１．６，９゜栽培品１，５ｇを
得た。

これを前二者は２５０ｍ１゜後二者は１１０属の石油エ
ーテルでソックスレー抽出を行ない、石油エーテル層を
濃縮しニトロメタン３０，２０ＴｆＬｌで２回再抽出し
た。

ニトロメタンを留去後、ｎ−ヘキサンを１ｍｌ加えて抽
出物を溶解しこれをそれぞれの検体とした。

暗所培養培地１２１．緑化カルス培養培地１２１は石油
エーテル８００．５００．５００ｍ１で分液ロートにて
抽出を行ない、以後ニトロメタン再抽出、ｎ−へキサン
との溶媒置換を行ないこれを検体とした。

またコントロールとして培養前培地１１も同様に抽出を
行なった。

（１）薄層クロマトグラフィー 各検体をシリカゲルプレート（ワコーゲル Ｂ−１０，
和光純薬工業株式会社製）上にスポットシ、ｎ−へキサ
ン：酢酸エチル＝６：１（Ｖ／Ｖ）（７）溶媒系で展開
し、Ｗ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、を標準物質としてＲｆを比較検討
した。

得られた結果を第１図に示す。

第１図においてａ−ｈは夫々次の検体を示す。

ａ 暗所培養カルスエキス ｂ 暗所培養培地エキス Ｃ緑化カルスエキス ｄ 緑化カルス培養培地エキス ｅ 生長個体エキス ｆ 栽培品エキス ｇ 培養前培地エキス ｈ Ｗ、Ｓ、Ｐ、Ｅ また第１図においてＰｙｒｓ Ｉはピレトリン１群（
シネリンＩ、ジャスモリンＩ、ピレトリンＩの三者の総
称とする）を、Ｐｙｒｓ ＩＩはピレトリン■群（シ
ネリン■、ジャスモリン■、ピレトリン■の三者の総称
とする）を夫々示す。

この第１図より全検体共Ｗ、Ｓ、Ｐ、Ｅと同一のＲｆを
示すスポットを認めることがわかる。

またピレスロロンの特異的発色試薬であるオルトリン酸
溶液（８５係オルトリン猷：酢酸エチル＝４：１（Ｖ／
Ｖ））を展開後のプレート上に噴霧し１０５℃、５分間
加熱したところピレトリン１群及びピレトリン■群共に
ピンク色を呈しピレスロロン骨格の存在を示した。

なお培養前培地エキスではピレトリン１群、■群のＲｆ
に対応するスポットは認められなかった。

（２）ガスクロマトグラフィー 各検体について下記条件でガスクロマトグラフィーを行
なった。

測定条件 カラム；２係「シリコンＤＣＱＦ−１ｊ 、 ６０〜８
０メツシユ「クロモソーブ （ｃｈ ｒ ｏｍｏｓｏｒｂ） Ｗ Ｊ 、ガラス３ｍ
ｍφ×２ｍ２ カラム温度；２００℃（ピレトリン１群用）２２０℃（
ピレトリン■群用） インジェクション温度；２５０°Ｃ キャリヤーガス：Ｎ２４０ｍＶ分 流 量 ； Ｎ２４０ｍｌ／’；＋、空気０．８
／分機 器 ；島津製作所製「Ｓｈｉｍａｄｚｕ
ＧＣ−５Ａ、ＦＩＤＪ 測定結果を第２図及び第３図に示す。

第２図はカラム温度を２００℃とした時の結果であり、
また第３図はカラム温度を２２０℃とした時の結果であ
る。

各図中■はシネリンＩ、■はジャスモリンＩ。

■はピレトリン■の夫々を、また■はシネリン■。

■はジャスモリン■、■はピレトリンＨの夫々をそれぞ
れ示し、ｐｙｒｓ Ｉ及びｐｙｒｓ ＩＩは夫々第１
図と同じ意味を示す。

また各図において破線は’ Ｗ、Ｓ、Ｐ、Ｅを検体とす
る測定結果であり、実線は本発明により得られる暗所培
養カルスエキスを検体とする測定結果である。

このガスクロマトグラフィー分析結果より、シネリン、
ジャスモリン、ピレトリンの組成比は若干変化するが、
本発明方法により得られる暗所培養カルスエキスには、
Ｗ、Ｓ、Ｐ、Ｅに認められると同一の１１８９２１群及
び■群の存在が確認される。

次に実施例１〜３にて得られたカルス、増殖培・地、生
長個体、栽培品の殺虫効力試験についての実例を下記に
示す。

各検体の一定量、すなわち暗所培養カルスエキス１５０
μｌ、緑化カルスエキス１５μｌ、生長個体エキス１０
μｌ、栽培品エキス２μｌ、暗所培養培地１００μｌ及
び緑化カルス培養培地１０μｌを夫々１０１ｒＬｌのメ
スフラスコにとり、ｎ−ヘキサンにて定容化する。

これよりそれぞれ２罰を腰高シャーレに入れｎ−へキサ
ンを蒸散させた後０．１％ツイーン８０液Ｉｙｄをそれ
ぞれれに滴下し、エキス分と十分混和、乳化させ、これ
に蒸留水１９９ｍ１を加え更に十分混合させる。

この中にアカイエカ４令初期の供試虫を３０頭放ち、２
５℃、２４時間放置後死亡数をかぞえ、死亡率を算定し
た。

コントロールとしては蒸留水のみ、５ｐｐｍツイーン８
０液を用い死亡率の補正を行なった。

また試験は同様にして３回行なった。

結果を下記第２表に示す。

尚供試幼虫数および幼虫死亡数は３回試験した結果の平
均値で示す。

上記結果より、各検体の死亡率は全て１００ｆｂ、コン
トロールにおける幼虫死亡０．および培養前培地エキス
における幼虫死亡０であり、各検体は全て殺虫効力を有
していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法により得られるカルス、カルス培養
培地、生長個体、栽培品を検体とし、薄層クロマトグラ
フィー分析を行なった結果を示すものであり、また第２
図及び第３図は上記検体をガスクロマトグラフィー分析
に供した結果を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キク科に属するシロバナムショケギクの組織を培養
   してカルス化させ、該カルスを培養し増殖もしくは再分
   化させ、ピレトリンを採取することを特徴とする組織培
   養によるピレトリンの製造法。