JPS5929196B2 - 蛋白質物質の半透膜による濃縮，精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は有用な蛋白質を含む水溶液から限外口過方法に
より有効かつ迅速に該蛋白質を分離、濃縮、精製する方
法に関するものである。

半透膜を用いた物質分離技術は、近年合成高分子半透膜
の著しい進歩にともない各産業分野でその利用が検討さ
れている。

その中でも食品工業、発酵工業、医薬品工業などでは特
にこの技術の利用価値が認められている。これらの産業
では高価な蛋白質たとえば蛋白質ホルモン、酵素などを
大量の水溶液から分離、濃縮、精製する必要があり、こ
れを実施するためには限外口過法が非常に有用である。
限外口過法に於てはそれに用いるべき半透膜の性能とし
て以下の諸点が要求される。

（１）選択透過性に優れていること。

即ち分離しようとしている蛋白質水溶液には水以外に種
々の物質を含む場合が多い。

これらは低分子電解質や糖類あるいは他の蛋白質である
。従つて半透膜としては目的としている蛋白質を透過さ
せずに、水−およびその他の夾雑物質を透過させる性質
が要求される。（２）送液速度が大きく、安定している
こと。

蛋白質の濃縮の場合、一般に大部分が水であり、この水
の膜透過速度が大きければ、濃縮時間が短かくてすみ、
また装置の膜面積を小さくすることが出来、処理コスト
が安価となる。現在、種々の限外口過膜が市販されてお
り、その代表的なものはセルロースアセテートを素材と
した半透膜であるが、その性能や耐薬品性の点から言え
ばまだ完全なものではない。本発明者らは（１）、（２
）の観点から蛋白質物質の限外口過処理に適した半透膜
を探索し、その処理方法を検討した。

その結果、ポリアクリロニトリルあるいはアクリロニト
リルを５０ｗｔ％以上含む共重合体からなる半透膜を使
用し、さらに限外口過すべき蛋白質水溶液のＰＨを（ａ
−１）以下あるいは（ａ＋１）以上（但しａは蛋白質の
等電点）に保つて限外口過処理を行なうことにより、有
効にかつ迅速に目的を達成出来ることを見出し本発明を
完成した。以下に本発明の詳細について述べる。

本発明の方法を実施するためには、まずポリアクリロニ
トリル又はアクリロニトリルを５０ｗｔ％以上、好まし
くは６５〜９９ｗｔ％を含む共重合体から成型された半
透膜を用いる必要がある。

これらの重合体を用いての透水速度の大きい半透膜の製
造法は一般に該重合体を溶媒に溶解し、重合体濃厚溶液
を平膜状、チューブ状、中空糸状に賦形し、非溶剤中で
凝固させることによつて得られる。溶媒として有機溶媒
を用いた場合の製造方法が特開昭４８−８６１６３号、
特開昭４９一４３８７８号、特開昭５０−７８５７６号
、特開昭５０−９０５７９号などに開示されている。ま
た硝酸などの無機溶媒を用いた場合の製造方法が特開昭
４９−６５５２号に開示されている。本発明に用いられ
る半透膜はこれらいずれの製造方法から得られるもので
も用いることが出来るが、透水速度の大きいものが望ま
しい。しかし、あまりにも透水速度が大きいと、半透膜
の低分子量領域での選択透過性が悪化したり、溶質の目
づまりが起るため、ある範囲に保つ必要がある。平膜や
チユーブ状膜では、透水速度が０．０２〜３．０（ｍｌ
／Ｃｒｌｉ．ｍｍ．ａｔｍ）の範囲のものを、又中空糸
状の膜では０．００５〜１．０（ｍｌ／ＣＦ７ｆ，．ｍ
ｍ，．ａｔｎｌ）の範囲のものを使用するのが好ましい
。ポリアクリロニトリルあるいはアクリロニトリルを主
成分とする重合体からなる種々の半透膜は蛋白質と非蛋
白質の間で特異的な選択透過性を示す。

また、蛋白質のみを含む水溶液ではその蛋白質に対して
優れた阻止率を示した。そして、これらの特異な性質は
半透膜を構成している重合体中のアクリロニトリルの重
量％が５０以上のときに、特に顕著に現われることを見
い出した。特異的な選択透過性を示す１例として実施例
１に示したごとく、蛋白質である卵アルブミン（Ｍ．Ｗ
．−４．５万）と非蛋白質であるデキストラン（Ｍ．Ｗ
．−４万）を含む混合水溶液をアクリロニトリルを主成
分とする半透膜で限外口過を行なつた場合、卵アルブミ
ンの該半透膜による阻止率は９８％を示すが、デキスト
ランの阻止率は１０％しか示さない。

即ち、この半透膜を用いれば卵アルブミンとデキストラ
ンを含む水溶液から卵アルブミンのみを有効に分離濃縮
することが出来る。一方市販のセルロースアセテートか
らなる半透膜を同様に使用した場合、卵アルブミン、デ
キストランの両溶質に対し共に９８％の阻止率を示し、
蛋白質と非蛋白質の間での選択透過性は発現されない。
従つてセルロースアセテート系の半透膜は単一成分のみ
を含む水溶液からの該成分の濃縮に対しては有効に用い
られるが、前述したごとく実際に取り扱う蛋白質水溶液
には種々の夾雑物質が混入しており、目的とする蛋白質
だけを有効に分離するのは困難となる。次に本発明の第
２の要点について説明する。

ポリアクリロニトリルあるいはアクリロニトリルを主成
分とする共重合体からなる半透膜は以上説明して来たご
とく、蛋白質と非蛋白質に対してすぐれた選択透過性を
示すが、これらの物質を含む水溶液で限外口過を行なう
と、著しく透液速度の低下を示すことが明らかとなつた
。透液速度が小さくなることは限外口過処理技術に於て
致命的な欠陥である。本発明者らはこの欠陥を改善すべ
く鋭意検討した結果、蛋白質水溶液のＰＨがこの透液速
度に大きく影響を与えていることを発見した。

蛋白質は種々のアミノ酸がペプチド結合して出来たもの
であり、水溶液中では一種の両性電解質高分子として挙
動する。従つて酸性領域では分子は１荷電を持ち、アル
カリ性領域ではｅ荷電を有する。あるＰＨに於て１０の
荷電数が等しくなり、分子はあたかも中性分子のごとく
挙動するが、このＰＨを等電点と呼ぶ。等電点は蛋白質
に固有のものであるが、水溶液中に含まれる低分子イオ
ンの影響をわずかに受ける。本発明者らは限外口過水溶
液のＰＨ、蛋白質の等電点、限外口過速度（透液速度）
の関係を種々の蛋白質について調べた結果、蛋白質の等
電点で透液速度が最小となり、水溶液のＰＨが等電点か
ら離れておれば透液速度が著しく大きくなることを発見
した。

このＰＨ範囲は等電点をａとすれば、ａ−１以下あるい
はａ＋１以上で十分であり、蛋白質水溶液のＰＨをこの
範囲に保つことにより工，業的に実用可能な限外口過速
度が得られることを見い出した。また、これらの現象は
セルロースアセテート系や他の市販半透膜では観察され
ず、ポリアクリロニトリル又はアクリロニトリルを主成
分とする共重合体から得られる半透膜に特徴的であるこ
とが判明した。蛋白質水溶液に低分子電解質が含まれて
いる場合、低分子電解質の種類により、該蛋白質の等電
点が少し変化することがある。このような場合はその水
溶液の電位差滴定を行なうことによつて等電点を求める
ことが出来る。また２種類以上の蛋白質を含む場合は濃
縮、分離しようとしている目的の蛋白質の等電点を求め
てその等電点をａとする。表１に蛋白質あるいは酵素の
等電点を示したが、一般に中性付近のものが多い。従つ
て限外処理を行なう場合、酸性あるいはアルカリ性領域
で行なうことになるが極度に酸性、アルカリ性にすると
蛋白質が変性してしまう恐れがある。従つて蛋白質水溶
液のＰＨ調整は十分注意しなければならない。一方半透
膜も一般に酸やアルカリで犯されやすいが、ここで用い
るポリアクリロニトリルやアクリロニトリルを主成分と
する共重合体は市販のセルロースアセテート膜にくらべ
て耐酸、耐アルカリ性に優れており、ＰＨ＝０．５〜１
１の範囲で長時間安定に使用出来る。なお蛋白質によつ
ては複雑な滴定曲線を示しあるＰＨ範囲内で２つ以上の
等電点をもつ場合がある。そのような蛋白質の場合、ａ
としてはそめＰＨ範囲全体を意味する。たとえばウロキ
ナーゼの場合表１に示したごとくＰＨ−６．８〜９．６
の範囲で５つの等電点を示すが、この場合ａはこの範囲
のＰＨを表わす。従つて限外口過水溶液のＰＨは６．８
−１−５．８以下あるいは９．６＋１−１０．６以上に
保つ必要がある。次に本発明を実施例を用いて具体的に
説明する。

実施例 １アクリロニトリルを主成分とする限外口過膜
を、以下の手法で作成した。

アクリロニトリル９０ｗｔ％，酢酸ビニル１０ｗｔ％を
含む共重合体を公知の方法で合成した。得られた重合体
の固有粘度はジメチルホルムアミド中３０℃で測定した
ところ１．６０であつた。この重合体を濃度が１８ｗｔ
％となるようにジメチルアセトアミドに溶解し、この溶
液をガラス板上へ均一に流延して、直ちにあらかじめ用
意した水を主成分とする凝固浴へ浸漬した。次に凝固フ
イルムを定長状態で７５℃の温水中で熱処理を行ない半
透膜を得た。この半透膜を用いて次の条件で限外口過の
実験を行なつた。原液として０．１ｗｔ％の卵アルブミ
ンと０．１ｗｔ％のデキストランＴ４Ｏ（重量平均分子
量４万）を含む水溶液をイオン交換水に溶解した。水溶
液のＰＨは５．２５の値を示したが、塩酸を加えてＰＨ
−３．０に調整した。限外口過装置に半透膜を装着し、
半透膜上を攪拌しながら１．５気圧に加圧して上記ＰＨ
調整を行なつた原液の口過を行なつた。このようにして
４００ｍ１の原液を４０ｍ１まで濃縮し、濃縮液中に含
まれる卵アルブミンとデキストランの濃度を求めた。卵
アルブミンの濃度は濃縮液を希釈して、吸光光度法によ
り２８０ｍμ波長の吸収を測定して、あらかじめ作成し
た検量線より決定した。デキストランの濃度は同様に希
釈して石炭酸と濃硫酸により発色させ４９０ｍμの吸光
度を測定して決定した。濃縮液中の卵アルブミンの濃度
は０．９５％であり、デキストランの濃度は０．２％で
あつた。また濃縮実験の初期段階に於て膜透過液中の各
溶質濃度を同様に求めた所、卵アルブミンは０．００２
％、デキストランは０．０９％であつた。従つて、実験
初期でのこの半透膜の各溶質に対する阻止率は卵アルブ
ミンに０．００２対しては（１−？）×１００−９８％
、デ０．１ ０．０９ キストランに対しては（１−？）×１００一０．１１０
％となり、卵アルブミンとデキストランの間に著しい透
過性の差を示した。

また濃縮液は卵アルブミンを原液にくらべ９．５倍含み
、一方デキストランは２倍しか含まず、卵アルブミンを
選択的に濃縮出来ることがわかつた。比較実施例 １ 市販セルロースアセテート限外口過膜（＃６００ＤＥＤ
ＡＮＳＫＥＳＵＫＫＥＲＦＡＢＲＩＫＫＥＲ社製）を用
いて実施例１と同様の実験を行なつた。

実，験初期での各溶質に対する阻止率は卵アルブミン、
デキストラン両者に対して９８％の値を示し選択透過性
は得られなかつた。また濃縮液の濃度は両成分ともに０
．９５％の値を示した。実施例 ２ 実施例１で調整した半透膜を用いて、０．１％の卵アル
ブミンを含む蛋白質水溶液を原料として原液のＰＨを種
々変化させて限外口過の実験を行ない、透液速度および
蛋白質の阻止率を調べた。

限外口過の操作圧力は１．５気圧で行なつた。実験に先
立ち原液としてイオン交換水を用いて、この半透膜の透
水速度を測定した所、０．０６（ｒ／Ｃｄ．ｍｍ．ａｔ
ｍ）（１気圧の操作圧に直して１分間に１ｃｄの膜面積
を透過する液のグラム数）の値を示した。

透液速度および卵アルブミンの阻止率を表２に示した。
表２に於て、ＬＯはイオン交換水での透水速度であり、
Ｌは卵アルブミン水溶液での透液速度である。表２の結
果から卵アルブミンの等電点近くでは透液速度は著しく
低下しているのに対し、等電点からＰＨが１以上ずれる
と透液速度が著しく大きくなることがわかる。

実施例 ３ 実施例１で調整した半透膜を用いて、０．０５ｗｔ％の
α−キモトリプシンを含む水溶液を原液として限外口過
の実験を行なつた。

α−キモトリブシンの溶媒としてはＰＨ＝８．８のトリ
スバツフア一、塩酸でＰＨ＝３．０および苛性ソーダで
ＰＨ＝１０．５に調整したイオン交換水を用いた。１。

５ａｔｍで限外口過の実験を行ない、透液速度およびα
−キモトリプシンの半透膜による阻止率を求めた。

結果を表３に示した。表３の結果より原液のＰＨを導電
点からずらすことによつて透液速度が著るしく向上し、
阻止率も殆ど同じか向上することが明らかとなつた。

実施例 ４アクリロニトリルと酢酸ビニルの組成を変え
て種々の共重合体を公知の方法により合成した。

これらの重合体を用いて実施例１と同様にして半透膜を
調整した。これらの半透膜を用いて実施例１と同様にし
て、卵アルブミンとデキストランの混合水溶液を原液と
して限外口過の実験を行ない、その選択透過性を調べた
。選択透過性は実験初期の透過液中に含まれる溶質濃度
を求め、実施例１で示した阻止率から判断した。結果を
表４に示した。この実験から共重合体中のアクリロニト
リルの含量が５０ｗｔ％以下になると、デキストランの
阻止率はあまり変化しないが、卵アルブミンの阻止率が
急激に悪くなり、選択性透過性能がそこなわれることが
わかつた。

実施例 ５ 実施例１で調製した半透膜を用いて、α−アミラーゼを
含む水溶液の限外口過実験を行なつた。

原液として市販精製α−アミラーゼの０．１ｗｔ％を含
む水溶液を調製し、原液のＰＨを変化させて１．５気圧
の操作圧で実験初期に於ける透液速度及び透過液に含ま
れるα−アミラーゼの濃度を測定した。結果を表５に示
した。溶液の実験に先だち、この半透膜のイオン交換水
を用いた場合の透水速度を調べたところＬ。

＝ ０．０７５（夕／−Ｗｌ，−、Ａｔｍ）であつた。

表５の結果より、原液のＰＨが等電点から１以上はなれ
ていると、大きな透液速度で限外口過が行なえる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蛋白質物質を含む水溶液を限外口過によつて濃縮、
   精製する方法に於て（１）限外口過膜としてポリアクリ
   ロニトリルあるいは少くとも５０ｗｔ％以上のアクリロ
   ニトリルを含む共重合体からなる半透膜を使用し（２）
   蛋白質を含む水溶液のＰＨを、（ａ−１）以下又は（ａ
   ＋１）以上に保つことを特徴とする蛋白質物質の濃縮、
   精製法。 ここにａは蛋白質物質の等電点である。