JPS5934112B2 - 固定化酵素およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は担体さして可溶化コラーゲンを用いる固定化酵
素およびその製造方法に関するものである。

その目的とする所はコラーゲン溶液の具備する緒特性を
利用して、優れた固定化酵素およびその製造方法を提供
することにある。

近年、酵素の利用に関する研究や技術が著しく進歩する
と共に生化学の発展による酵素の作用機構の解明に伴っ
て、新しい酵素源の開発や、新しい酵素作用の応用技術
の開発が進められている。

酵素の固定化の技術もその一つで、従来バッチ法によっ
ていた酵素反応の連続化を可能にし、酵素作用の著しい
特異性と反応効率を工業過程に提供するものとして注目
され、活発な研究が実施されている。

この酵素の固定化の方法については、これまで多くの方
法が提案されており、固定化によって酵素活性の安定性
が増大し、くりかえし使用が可能になるなどの利点が認
められているが、反面、概して固定化により酵素活性が
低下するものが多く、固定化処理中に失活したり、酵素
の離脱や基質の拡散滲透に影響をうけたり、さらに基質
特異性が変化する場合が知られている。

又、調整技術が難しかったり、酵素の種類によってそれ
ぞれに適した方法の開発が必要であったりして普遍的な
方法は少かった。

一方、酵素を固定化するのに適当な担体としては、一般
的な条件として、結合容量が大きく、担体表面の結合部
位の分布状況が重要であり、多孔度、電荷の分布、親水
性と疎水性の均衡など担体の組繊の状態を考慮する必要
があり、その上、酵素活性におよぼす影響や化学的、物
理的な安定性などにも充分な配慮が必要である。

このような観点からすると繊維性の蛋白質であるコラー
ゲンはすぐれた条件を兼ね備えた酵素の固定化材料であ
る。

本発明者は永年にわたるコラーゲンと酵素との関係につ
いての研究に従事中、成る種の酵素がコラーゲン溶液中
で安定して保存きれることを見出し酵素の固定化の担体
としてコラーゲン溶液を用いることに着目するに至った
ものである。

いうまでもなく、コラーゲンは動物の結合組織の主成分
で皮膚、骨、肺等に広く分布する蛋白質である。

このいわゆる「不溶性コラーゲン」の繊維を単分子状に
可溶化する方法は酸性領域の水中で蛋白質分解酵素を作
用させる時分３７−１４４２６および特公昭３７−１３
８７１公報記載の方法がある他、糸状菌の酸性蛋白質分
解酵素を使用する特公昭４４−１１０３７および特公昭
４４−１１７５公報記載の方法もある。

また苛性ソーダ、硫酸ソーダおよび少量の塩基性有機化
合物性液で処理する特公昭４６−１５０３３公報記載に
よっても可溶化される。

以下、本発明においては前者によって可溶化されたコラ
ーゲンを「酵素可溶化コラーゲン」、後者によって可溶
化されたコラーゲンを「アルカリ可溶化コラーゲン」と
呼び、両者を併せて「可溶化コラーゲン」と呼ぶ。

上記の諸方法で得られる可溶化コラーゲン水溶液では、
いづれもコラーゲンが単分子分散の状態で溶解しており
、分子の長さは２８００人、直径１５人、分子量約３０
萬であり、３本のポリペプチド鎖が二重へリツクス状に
巻いている剛体棒状の形をとっていることが判明してい
る。

またこの溶液からはゾ天然のコラーゲン繊維に近い繊維
を再生させるこさが出来る。

このような繊維再生能は酵素の固定化に際して極めて有
効に作用して、酵素の包括を強固にし、しかも適当な強
度をもった種々の形、即ち糸状、膜状等に成型すること
を容易にする。

尚、コラーゲンは親水性であって、しかも両性電解質と
しての性質を持っている。

酵素の担体として利用する場合には、とくにこの性質が
重要であってｐＨによりアニオン、カチオンのいづれの
電荷をも利用することが出来る。

即ち、酵素可溶化コラーゲンはｐＨ７〜９付近、アルカ
リ可溶化コラーゲンはｐＨ４，６付近で繊維状の沈澱を
生ずるが、さらに両方のコラーゲンを混合する場合には
、両者の比率に対応して両者の等電点の間の種々のｐＨ
の下で繊維状の沈澱を生せしめることができる。

またアンモニア、苛性ソーダ等による中和、界面活性剤
、有機溶媒の添加によっても繊維形成が可能であり、中
性塩を添加しても沈澱を生成する。

さらに濃厚塩類性液又は有機溶媒中に押出すと可溶化コ
ラーゲンは凝固し、脱水されて任意の形状に成型される
。

尚、コラーゲンと酵素との結合機構はなお充分明らかで
はないが、コラーゲンと酵素とのイオン結合が一つの重
要な因子であると考えられる。

さらに可溶化コラーゲン水溶液はコラーゲンが単分子状
態で溶解しているために酵素との接触が不溶性コラーゲ
ン分散液よりも充分ｌこ行われるこ吉がコラーゲンと酵
素の結合を効率よくしている要因と思われる。

本発明は上記の諸知見に基いて、コラーゲン溶液の特性
を充分活用することによって完成したものである。

。即ち、本発明は対象とする酵素液の活性の安定ｐＨ領
域に含まれる等電点を持つ可溶化コラーゲンを選択して
使用し、使用する可溶化コラーゲンの等電点付近のｐＨ
値の下で、酵素液と酵素可溶化コラーゲン又はアルカリ
可溶化コラーゲンのいづれか一方のコラーゲン水溶液と
混合するか、あるいは酵素可溶化コラーゲン及びアルカ
リ可溶化コラーゲン及びアルカリ可溶化コラーゲンの両
者の混合比をかえて沈澱ｐＨを対象とする酵素液の活性
の安定ｐＨ領域内に含ませるようにして、酵素液と酵素
可溶化コラーゲン及び／又はアルカリ可溶化コラーゲン
の水溶液と混合することにより、酵素コラーゲン複合体
を得る。

次いでこの酵素コラーゲン複合体を脱水、乾燥させ、成
型することよりなる酵素の固定化方法である。

本発明によれば酵素とコラーゲンとの親和性、凝集性を
高度に発揮させることが出来、両者の強い結合が得られ
る。

又、酵素蛋白質自体の解離もｐＨに依存するから、この
点も配慮して、酵素蛋白質とコラーゲンの電荷が当量に
存在するように混合比やｐＨ値を調整して両者を混合す
る手段を加える時には酵素とコラーゲンの親和性、凝集
性を最高度に発揮させ本発明を一層効果的に実施できる
のである。

又、等電点の異なる酵素可溶化コラーゲン及び／又はア
ルカリ可溶化コラーゲンを対象とする酵素液の活性の安
定ｐＨ領域のｐＨ値によって使いわけることによって、
対象とする酵素の種類も広範囲のものとすることができ
るのである。

次に本発明の具体的態様をあげて説明する。

例えば対象とする酵素液の活性の安定ｐＨ領域内にｐＨ
８が含まれている場合には酵素可溶化コラーゲンの水溶
液を用い、対象とする酵素液の活性の安定ｐＨ領域内に
ｐＨ４，６付近が含まれる場合にはアルカリ可溶化コラ
ーゲンの水溶液を選択して用いる。

対象とする酵素液はその安定ｐＨ領域に従って、ｐＨ８
或いはｐＨ４，６付近としたものと上記のように選択さ
れたいづれか一方のコラーゲン水溶置きをその等電点付
近のｐＨの下で撹拌しつつ混合する。

混合するコラーゲン量と酵素量の割合は乾燥重量として
前者１００部に対し後者１０〜５００部程度が好ましく
、コラーゲン溶液の濃度は目的とする成型方法によって
変えることができる。

混合後も撹拌を続け、充分に均一にする。

次いで混合液を凍結乾燥その他の手段により脱水、乾燥
すれば乾燥固定化酵素が得られる。

又、対象とする酵素液の活性の安定ｐＨ領域がｐＨ８付
近とｐＨ４，，６付近の間に含まれる場合には、その酵
素液の活性の安定ｐＨにおいて沈澱を生成するような割
合で混合した酵素可溶化コラーゲンの水溶液およびアル
カリ可溶化コラーゲンの水溶液の混合置き酵素液とをそ
のｐＨ下で撹拌しつ゛つ混合する。

混合する両者のコラーゲンの総量と酵素量との割合は上
記の場合と同様に乾燥重量として前者１００部に対し後
者１０〜５００部程度が適尚であり、コラーゲン溶液の
良度は成型の目的に応じて適宜に決めることができる。

この場合、酵素可溶化コラーゲン９部に対してアルカリ
可溶化コラーゲン１部の混合比から、漸次後者の割合を
増加させると、前者１部に対し７後者９部の混合比に近
づくに従って、両コラーゲンの沈澱生成ｐＨはその混合
比に対応して、ｐＨ８からｐＨ４，６へと低下するので
、所望の沈澱生成ｐＨを得るように両コラーゲンの混合
割合を設定できる。

又、沈澱生成のｐＨは酵素蛋白質の解離度の影響も受け
るので、この点も配慮して、あらかじめ好適な沈澱生成
条件を設定してから実施すれば一層固定の効果を高める
ことができる。

得られた固定化酵素を必要に応じて、さらに強固に固定
するために次の様な処理を行うことができる。

■）酵素とコラーゲン水溶液とを混合して酵素をコラー
ゲンで包括した後にこの混合液中にさらに、下記のコラ
ーゲンに作用する物質の水溶液をコラーゲン１００部に
対し１〜５０部程度を撹拌しつつ添加してから、脱水乾
燥するか、酵素とコラーゲンとの混合液を成型乾燥後、
これらの０．０５％乃至５．０％の水溶液で処理した後
乾燥する。

（１）アルデヒドを有する架橋剤であるジアルデヒド澱
粉やゲルタールアルデヒド類、 （２）植物性タンニン社則であるワラトル、チェスナツ
ト、タンニン酸等、 （３）クロム、鉄、アルミニウム等の３価金属の塩類、 （４）合成社則であるナフタジン、アントラセン、ベン
ゼン、フェノール類、リクニンスルホン酸などの縮合物
にスルホン基を導入したもの、（５）チオ硫酸塩、 （６）高分子凝集剤であるポリアクリル酸ナトリウムや
ポリアクリル酸アミドの部分加水分解物。

■）酵素とコラーゲン水溶液との混合液を含水状態のま
５で、常温以下で紫外線やγ線を照射して、架橋強化処
理を行った後、脱水乾燥する。

紫外線照射は３０Ｗの紫外線灯の場合、５〜３０儂の距
離から５〜３０分の照射が適当であり、γ線の照射量は
全線量で０．１〜１０ Ｍｒ （メガレントゲン）が適
当である。

■）脱水乾燥して得られた固定化酵素を４０°Ｃ〜６０
°Ｃで加熱処理する。

■）脱水乾燥をして得られた固定化酵素を、さらに水不
溶性高分子物質を溶解させた有機溶媒中、例えば酢酸セ
ルローズのメチレンクロライド溶液に分散させた後、乾
燥成型する。

以上の処理方法は相互に併用することができる。

尚、必要に応じて酵素の安定化剤、例えば２価の金属塩
等を酵素とコラーゲンの混合液に添加して、固定化ある
いは強化処理を実施することにより、活性の低下を少く
するこさができる。

次に、本発明においてはフィルム状、糸状、粒状、スポ
ンヂ状、ブロック状等、所望の形状に酵素を固定化する
ことができる。

即ち、対象とする酵素液の活性の安定ｐＨ領域に含まれ
る等電点を有した可溶化コラーゲンを選択して使用し、
該コラーゲンの等電点付近のｐＨ値の下で、酵素液と酵
素可溶化コラーゲン又はアルカリ可溶化コラーゲンのい
づれかの水溶液とを混合するか、あるいは酵素可溶化コ
ラーゲン及びアルカリ可溶化コラーゲンの両者の混合比
を変えて、それらの沈澱ｐＨを対象とする酵素液の活性
の安定ｐＨ領域内に含ませるようにして、酵素液と酵素
可溶化コラーゲン及びアルカリ可溶化コラーゲンの水溶
液とを混合する。

次いで、この混合液をそのま５乾燥するか、あるいは塩
含有溶液又は有機溶媒中に押出して、成型した後、アル
デヒドを有する架橋剤又は紫外線あるいはγ線を用いる
等の強化処理を施すことにより所望の形状に酵素を固定
化できるのである。

以下に具体的態様をあげて説明する。

（１） フィルム状の固定化 対象とする酵素液を充分に撹拌しながら、その活性の安
定ｐＨ領域内でしかも前記のようにして選択された酵素
可溶化コラーゲン又はアルカリ可溶化コラーゲンのいづ
れか一方の等電点付近のｐＨの下で、酵素液と可溶化コ
ラーゲンの水溶液を混合するか、あるいはその酵素液の
活性の安定ｐＨにおいて沈澱を生成するような混合割合
になるように酵素可溶化コラーゲンの水溶液およびアル
カリ可溶化コラーゲンの水溶液と酵素液とを、その沈澱
生成ｐＨ付近のｐＨの下で撹拌しつつ混合する。

混合する両コラーゲンの総量と酵素量との割合は乾燥重
量として、前者１００部に対し後者１０〜５００部程度
が適当である。

またこの場合のコラーゲンの終濃度は０．５％程度がよ
い。

充分均一となったコラーゲン吉酵素との混合液は脱泡し
た後、アクリル樹脂製容器（例えば深さ１ｃｒｎ〜０．
５ ｃｒｆＬ）に流しこみ通風しながら乾燥させる。

以上の処理は酵素可溶化コラーゲンを用いる場合は２５
℃以下、アルカリ可溶化コラーゲンを用いる場合は２０
°Ｃ以下で実施するのがよい。

固定化酵素膜の強度を上げるためにはコラーゲン水溶液
と酵素液とを混合した後、前述したアルデヒド澱粉ある
いはゲルタールアルデヒド等を１％程度の水溶液とし、
使用したコラーゲン１００部に対して１〜５０部（乾燥
重量として）を添加して乾燥製膜すれば強度の向上した
固定化酵素膜を得ることができる。

又、単に酵素液とコラーゲン水溶液から乾燥製膜して得
られた未強化の固定化酵素膜を前述のアルデヒド類、タ
ンニン類等の蛋白質の硬化剤や社則等で後処理して膜の
強度を増大する方法もとることができる。

例えばジアルデヒド澱粉の１％程度の水溶液、グルクー
ルアルデヒドの０．１％程度の水溶液あるいはタンニン
社則、クロム揉剤、合成社則、高分子凝集剤等の０．１
〜５．０％程度の溶液中に１０秒〜１時間程度、浸漬し
た後、水洗乾燥すれば固定化酵素膜の強度を向上させる
ことができる。

さらに未強化の固定膜に対し０．１〜１０Ｍｒの全線量
になるようγ線照射したり、３０Ｗの紫外線灯を用い２
０ｃｆｒＬ程度の距離から１０〜３０分間照射するなど
の方法によっても強化された固定化酵素膜を得ることが
できる。

（２）スボンヂ状の固定化 （１）と同様の操作で調製した充分均一なコラーゲンと
酵素との混合液を任意の形状のアクリル樹脂製容器やガ
ラス製容器あるいはステンレス製容器中に流しこみ、そ
のま＼凍結乾燥すると、混合液の容積よりや５減じた容
積の状態でスポンヂ状に成型することができる。

固定化酵素スポンヂの場合は混合液のコラーゲンの終濃
度は０．５〜２．０％程度がよい。

又、さらに強度を向上させるためには（１）と同様に、
コラーゲン水溶液と酵素液を混合した後、ジアルデヒド
澱粉またはゲルタールアルデヒド等を１％程度の水溶液
として、使用したコラーゲン１００部に対して１〜５０
部添加してから凍結乾燥すればよい。

又、タンニン社則、クロム社則、合成社則、高分子凝集
剤等も前記同様に用いることができる。

又、未強化のスポンヂを（１）と同様に紫外線処理やγ
線照射処理を施すことにより充分強化された酵素固定化
スポンヂを取得することができる。

（３）糸状の固定化 対象とする酵素液４係程度の酵素可溶化コラーゲン又は
アルカリ可溶化コラーゲンのいづれかの水溶液を混合撹
拌し酵素とコラーゲンの混合液をつくる。

コラーゲンと混合する酵素の割合はコラーゲン１００部
に対し酵素１０〜２０部程度が望ましく、コラーゲンの
終濃度は２％程度が良好である。

尚、この場合コラーゲンは溶液状態にあることが必要で
あるので、混合液のｐＨは酵素の安定ｐＨ領域にあって
、しかも可溶化コラーゲン等電点から、はなれたｐＨ値
に保たれることが望ましい。

混合液を脱泡した後、紡糸機にかけ、ノズルの先から飽
和硫酸アンモニア溶液等の凝固浴中に押出すと凝固脱水
されて成型され、ノズルの形状によって固定化酵素糸や
毛細管をつくることができる。

凝固浴を通過した繊維はローラーで誘導し、前記した条
件の下で紫外線照射を行い、さらに０．１ ％程度のゲ
ルタールアルデヒド等の溶液で処理し、水洗乾燥すれば
固定化酵素繊維を作ることができる。

尚、凝固浴には上記の他に硫酸ソーダなどの塩類や有機
溶媒液例えばエタノール、アセトン、メタノール等が使
用できる。

（４）粒状、ブロック状等の固定化 （１）と同様の操作によって、コラーゲンの終濃度が５
〜１０係になるように調整した、均一なコラーゲンと酵
素の混合液を脱泡した後、注射筒につめ直径２ｍｍ、程
度の管口から凝固浴（３０％の食塩あるいは芒硝硫酸ア
ンモニア等の水溶液）に滴下させて粒状に凝固させた後
、全線量０．１〜１０Ｍｒ（メガレントゲン）のγ線照
射を行うか、（１）で記載したような架橋剤、社則等の
溶液で処理すること、あるいは上記のコラーゲン、酵素
混合液を任意のガラス容器に入れ、全線量の０．１〜１
０ Ｍｒ （メガレントゲン）のγ線照射を行い、ゲル
化させた後、水洗通風乾燥する。

この乾燥物をブロック状に切断するか、粉砕機にかけて
砕片とする。

以上の如く、本発明によって得られる固定化酵素はいづ
れも強い酵素活性を示すと同時にコラーゲンの種々の特
性を保持している上、多くの種類の酵素を容易に固定化
することが可能である。

本発明を実施することにより、例えば酵素反応の連続化
が可能で各種の工業過程に応用される他、連続自動分析
や種々の医療分野などに広範に応用することができる。

尚、本発明により二種類以上の酵素を同時に固定化する
ことも勿論可能である。

さらに、以下の実施例は一部の酵素の固定化方法につい
て記載したものであるが、グルコアミラーゼ、α−アミ
ラーゼ、β−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラー
ゼ、リゾチーム、インベルターゼ、セルラーゼ、ガラク
トシダーゼ、イソメラーゼ、ペクチナーゼ、ヒアルロニ
ダーゼや、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン等
のプロテアーゼ類の他、ウレアーゼ、リパーゼ、ペニシ
リンアミターゼ、アシラーゼ、リボヌクレアーゼ゛、ウ
リカーゼ゛、アスパラギナーゼ、ストレプトキナーゼ、
ウロキナーゼ、トロンビン、グルコースオキシダーゼ、
カタラーゼ、パーオキシダーゼ、ｄ−アミノ酸オキシダ
ーゼ等、の加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、
転移酵素、合成酵素、リアーゼに属する多種類の酵素の
固定化も同様の技術手段によって達成される。

以下の実施例に示す酵素活性の単位は次のように定義さ
れる。

即ち、プロテアーゼは３０℃、１分間に生成するチロシ
ンμｇ数、ウレアーゼは３０℃、１分間に生成するアン
モニア態窒素のμｇ数、グルコアミラーゼは４０℃、１
分間においてグルコース１００μｙを生成する活性、β
−アミラーゼ、は３０℃、１分間においてグルコース１
００μＩに相当する還元力を生成する活性である。

実施例 １ トリス緩衝液（μｍ０．０５、ｐＨ８，０）に４１ｎ９
／ｒｒＬｌの濃度でトリプシン、キモトリプシン、アル
カリ性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ウレアーゼを
それぞれに含む各酵素溶液１００ｍ１を充分に撹拌して
ｐＨを８．０に調整しながら、酵素可溶化コラーゲンの
１％水溶液１００ｍ１を徐々に添加すると各酵素を包括
したコラーゲン繊維が再生してくるが、引きつづき撹拌
をつづけ、均一な混合液をつくる。

ｐＨを点検し、脱泡を行った後各混合液を深さＩＣＩｎ
のアクリル樹脂製容器に流しこみ、２０℃で通風しなが
ら乾燥した。

かくして各酵素を包括した固定化酵素膜が得られる。

これらの膜をゲルタールアルデヒドの０．１％溶液で３
０秒間処理するか、ジアルデヒド澱粉の１％溶液で３０
分処理する。

処理後充分水洗して乾燥させ硬化処理を施した固定化酵
素膜を得た。

これらの膜の１ｄの示す酵素活性（単位）はトリプシン
２．４、キモトリプシン２２、アルカリ性プロテアーゼ
１．２、中性プロテアーゼ゛０．４、ウレアーゼ゛５，
０であった。

また同様にして得た固定化酵素膜に３０Ｗ紫外線灯を用
いて１０儂の距離から５分間、紫外線を照射して硬化さ
せると、トリプシン２．０、キモトリプシン１．９、ア
ルカリ性プロテアーゼ１，０、中性プロテアーゼ１．０
、ウレアーゼ４，５の活性を示した。

また上記の操作において酵素とコラーゲンの混合液にジ
アルデヒド澱粉の１％溶液２０ｍ１を加えてよく混合し
た後、上記と同様シこアクリル樹脂容器に流しこみ、通
風しながら乾燥させて、硬化した固定化酵素膜をつくる
。

この場合の膜の示す活性はトリプシン２．２単位、キモ
トリプシン２．３単位、アルカリ性プロテアーゼ１．０
単位、中性プロテアーゼ０．４単位、ウレアーゼ４．８
単位であった。

尚、上記同様に酵素とコラーゲンの混合液にジアルデヒ
ド澱粉を加えた混合液を任意の型のアクリル樹脂製容器
あるいは硝子容器等に入れて凍結乾燥するとスポンヂ状
の固定化酵素が得られた。

この場合の各酵素のスポンヂ１０ｒＩＴ９の示す酵素活
性はトリプシン３．７単位、キモトリプシン３．８単位
、アルカリ性プロテアーゼ１．５単位、中性プロテアー
ゼ０．７単位、ウレアーゼ８．０単位であった。

実施例 ２ ０．１モル燐酸緩衝液（ｐＨ５，６）に４ ｙｎ９／ｒ
ｔｔｌの濃度でβ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、パ
パイン、酸性プロテアーゼをそれぞれに含む各酵素溶液
１００１７１１を充分に撹拌してｐＨを５．６に調整し
ながら、アルカリ可溶化コラーゲンの１係水溶液１００
ｄを徐々に添加すると各酵素を包括したコラーゲン繊維
が再生してくるが、引きつづき撹拌をつづけ、均一な混
合液をつくる。

ｐＨを点検してから脱泡を行った後、各混合液を深さ１
ｃｒＩＬのアクリル製容器に流しこみ、１５℃で通風し
ながら乾燥した。

かくして各酵素を包括した固定化酵素膜を得た。

これらの膜をゲルタールアルデヒドの０．１％溶液で３
０秒間処理するか、ジアルデヒド澱粉の１％溶液で３０
分処理する。

処理後充分水洗して乾燥させ硬化処理を施した固定化酵
素膜を得た。

これらの膜ＩＣ１１￥の示す酵素活性（単位）はβ−ア
ミラーゼ０．５、グルコアミラーゼ０．４、パパイン２
．０酸性プロテアーゼ０．８、であった。

また同様にして得た固定化酵素膜に３０Ｗ紫外線灯を用
いて１０ｃｒＩＬの距離から５分間、紫外線を照射して
硬化させると、β−アミラーゼ０．４、グルコアミラー
ゼ０．４、パパイン１．５の活性（単位）を示した。

実施例 ３ ４１ｎ９／ｍｌの濃度でβ−アミラーゼ、グルコアミラ
ーゼ、キモ１〜リプシン、パパイン、ウレアーゼをそれ
ぞれに含む各酵素水溶液１００ｍ１を充分に撹拌してｐ
Ｈを６．０に調整しながら、酵素可溶化コラーゲンの１
多水溶液７０ｍ１及びアルカリ可溶化コラーゲンの１％
水溶液３０ＴＬｌを徐々に添加すると各酵素を包括した
コラーゲン繊維を生ずるが、引きつづき撹拌をつづけ均
一な混合液をつくる。

ｐＨを点検し、脱泡を行った後、各混合液を深さ１ｃＩ
′ＩＬのアクリル樹脂製容器に流しζみ、１５℃で通風
しながら乾燥した。

このようにして各酵素を包括した固定化酵素膜が得られ
る。

これらの膜をゲルタールアルデヒドの０．１％溶液で３
０秒間処理するか、ジアルデヒド澱粉の１％溶液で３０
分処理する。

処理後充分水洗して乾燥させ硬化処理を施した固定化酵
素膜を得た。

これらの膜の１ｄの示す酵素活性（単位）はβ−アミラ
ーゼ０．５、グルコアミラーゼ０．４、キモトリプシン
２．０、パパイン２．０、ウレアーゼ５．５であった。

また上記の操作において酵素とコラーゲンの混合液にジ
アルデヒド澱粉の１％溶液２０ｍ１を加えてよく混合し
た後、上記吉同様にアクリル樹脂容器に流しこみ、通風
しながら乾燥させて、硬化した固定化酵素膜をつくる。

又、同様にしてつくった混合液を任意の型のアクリル樹
脂容器あるいは硝子製容器等に入れて凍結乾燥するとス
ポンヂ状の固定化酵素が得られた。

・これらの場合の各酵素の膜及びスポンヂの示す酵素活
性（単位）は夫々、β−アミラーゼは０．４／ｃｙｊ及
び０．７／１０１ｎ９、グルコアミラーゼは０．３５
／ｃｒ？を及び０．６／１０■、キモトリプシンは２．
２／ｉ及び３．８７１０〜、パパインは１．６７ｉ及び
２．６７１０■、ウレアーゼは６．０／ｄ及び１０／１
０ｍＩ？であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 脱水乾燥された可溶性コラーゲンとその可溶性コラ
   ーゲン中に分散された酵素さからなる固定化酵素。 ２ 可溶性コラーゲン水溶液中に酵素を均一に分散させ
   、この分散液を脱水乾燥させて製造される特許請求の範
   囲第１項記載の固定化酵素。 ３ 可溶性コラーゲンが酵素可溶化コラーゲン、アルカ
   リ可溶化コラーゲンおよびそれらの混合コラーゲンから
   選択される、特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 ４ 酵素液と該酵素液の活性が安定であるｐＨ領域に等
   電点を持つ可溶化コラーゲン水溶液とを該等電点付近の
   ｐＨで混合して、酵素を包括した可溶化コラーゲンを沈
   殿させて酵素−コラーゲン複合体を得、必要に応じて該
   複合体を架橋し、該複合体を形成し、脱水乾燥すること
   からなる固定化酵素の製造方法。 ５ 可溶化コラーゲンが酵素可溶化コラーゲン、アルカ
   リ可溶化コラーゲンおよび両者の混合物から選択される
   特許請求の範囲第４項記載の固定化酵素の製造方法。 ６ 沈殿させた酵素−コラーゲン複合体の架橋はアルデ
   ヒド、植物タンニン揉剤、合成揉剤、３価の金属塩、チ
   オ硫酸塩および高分子凝集剤から選択される試薬によっ
   て処理することからなる特許請求の範囲第４項記載の固
   定化酵素の製造方法。 ７ 沈殿させた酵素−コラーゲン複合体の架橋は紫外線
   照射、γ一線照射および４０〜６０°Ｃでの加熱処理か
   ら選択される処理によって行われる特許請求の範囲第４
   項記載の固定化酵素の製造方法。 ８ 可溶性コラーゲンと酵素とを乾燥重量さして１００
   ：１０〜５００の割合で混合する特許請求の範囲第４項
   、第５項、第６項または第７項の固定化酵素の製造方法
   。 ９ コラーゲンの等電点がｐＨ４，，６〜９．０である
   特許請求の範囲第４項、第５項、第６項、第７項または
   第８項記載の固定化酵素の製造方法。 １０酵素の安定剤として酵素液または可溶化コラーゲン
   水溶液の一方または両方に２価の金属塩を添加する特許
   請求の範囲第４項、第５項、第６項、第７項、第８項ま
   たは第９項記載の固定化酵素の製造方法。 １１ 酵素−コラーゲン複合体をフィルム状、スポンジ
   状、粒状およびブロック状から選択される形状に成形す
   る特許請求の範囲第４項、第５項、第６項、第７項、第
   ８項、第９項または第１０項記載の固定化酵素の製造方
   法。 １２酵素液と可溶化コラーゲン水溶液とを該酵素液の活
   性が安定であるｐＨ領域内でかつ可溶化コラーゲンを沈
   殿しない程度に該コラーゲンの等電点と離れたｐＨ値で
   混合し、この混合液を紡糸原液として凝固浴に押出し、
   架橋処理を行うことからなる糸状固定化酵素の製造方法
   。