JPS61111686A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化酵素の製造方法に関し、さらに詳しく
は酵素活性を有する粒状、繊維状あるいはフィルム状な
どのキチン成形体を提供する固定化酵素の製造方法に関
するものである。

近年、酵素利用工業において水溶性の酵素を水不溶性の
高分子を担体などに固定化することにより、酵素反応工
程を連続化し、酵素を繰り返して使用する研究が進展し
、すでに実用化されているものもある。この不溶性酵素
の製造法として、酵素を水不溶性の担体に結合させる担
体結合法、酵素を官能性試薬と反応させて不溶化する架
橋法及び酵素をゲルの格子内に包み込むかポリマーの皮
膜で被覆する包括法などが知られている。

工業的規模で酵素を固定化する場合には固定化操作が簡
便であり、固定化された酵素が長時間安定に保たれる必
要があり、用いる担体は多孔性で堅牢で安価である必要
がある。

キチンは豊富に存在する未利用天然資源であり。

酵素の固定化用担体としての利用が提案されている。例
えば、特公昭５６−３５号公報にはキチンにジエチルア
ミノエチル基を導入し、そのイオン交換基を介した酵素
の固定化方法が、特公昭５３４０１５０号公報にはキチ
ンから得られるキトサンに酵素を吸着又はペプチド結合
により固定化する方法が。

また特公昭５２−３８９２号公報には脱アセチル化キチ
ンへの架橋法並びにジアゾ法による酵素の固定化方法が
提案されている。しかしながら、これらの方法により得
られる固定化酵素の形態は、粉末状もしくは薄片状であ
るため、固定化酵素をカラムに充填し酵素反応工程を連
続化する際、流体抵抗が大きいため十分な流速が得られ
ず、またカラムが目詰まりするなどの実用上大きな欠点
を有していた。すなわち、キチンを担体とした固定化酵
素を実用化するにあたって、キチンの形態に大きな問題
があったわけであり、したがって操業条件を規制しない
形態の固定化酵素の開発が望まれていた。

本発明者らは、上記のごとき欠点の改良された固定化酵
素を提供すべく鋭意努力を重ねた結果。

キチンを固定化酵素として好ましい形態にあらかじめ成
形した後、この成形体に酵素を固定するという方法の開
発に成功し１本発明に到達した。

すなわち本発明は、あらかじめ成形されたキチンをアル
カリ処理して膨潤キチン成形体を得、得られた膨潤キチ
ン成形体を酵素溶液に浸漬したのちグルタルアルデヒド
処理を行うことを特徴とする固定化酵素の製造方法であ
る。

本発明にいうキチンとは、ポリ　（Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミン）そのもの及びその誘導体のことをいう。

かかるキチンは１例えば甲殻類、昆虫類の外骨格などを
塩酸処理並びに力性ソーダ処理してタン白質及びカルシ
ウム分を分離精製することによりあるいはそれらを例え
ばエーテル化。

エステル化などすることにより調製することができる。

本発明に好ましく用いられるキチン誘導体としては２例
えばカルボキシメチル化キチン、ヒドロキシエチル化キ
チンなどのエーテル化キチン。

アセチル化キチン、スルホン化キチンなどのエステル化
キチンがあげられる。エステル化物としては２例えばギ
酸、酢酸、酪酸、吉草酸、イソ酪酸。

イソ吉草酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチル酸。

アントラニル酸、フタル酸などのカルボン酸類。

硫酸、トルエンスルホン酸、スルホファニル酸すどのス
ルホン酸類、炭酸類あるいはそれらの無水物のエステル
化物があげられる。

本発明における成形とは、キチン又はその誘導体を適当
な溶媒１例えばトリクロル酢酸を含む塩化メチレン、塩
化リチウムを含むＮ−メチルピロリドン、塩化リチウム
を含むジメチルアセトアミド、トリフルオロアセトン又
はヘキサフルオロイソプロピルアルコールなどに溶解し
たのち、成形し凝固させることをいう。キチン溶液を凝
固させるには、キチン溶液と凝固液とを接触させればよ
く、凝固液としてはキチン又はその誘導体が溶解しない
液体であればよく１例えばメタノール、エタノール、イ
ソプロピルアルコール、イソブタノール、アセトン、水
などが使用できる。成形体の形態は、固定化酵素として
の用途に適したものであればよく１例えば粒状、繊維状
、フィルム状。

チューブ状、スポンジ状などがあげられる。

本発明におけるアルカリ処理とは、あらかじめ成形され
たキチンとアルカリ溶液とが接触するようないかなる方
法をも含む。アルカリ溶液としては水酸化ナトリウム水
溶液が実用的であり、その濃度は好ましくは０．１ｗ／
ｖ％以上、さらに好ましく　Ｌｏｗ／ｖ％以上、最適に
は３０〜６０ｗ／ｖ％の範囲であり、好ましい処理温度
は１０℃以上、さらに好ましくは４０℃以上、最適には
６０〜１２０℃の範囲であればよい。処理時間はアルカ
リ濃度と処理温度とにより異なるが、好ましくは１分〜
２４時間、さらに好ましくは１５分〜１２時間、最適に
は１〜６時間程度であればよい。また、浴比はキチン成
形体１重量部に対しアルカリ溶液を好ましく２５重量部
以上、さらに好ましくは５０重量部以上、最適には１０
０重量部以上であればよい。アルカリ溶液は必要に応じ
て攪拌してもよく、処理後、アルカリを除去する場合に
は中和、水洗などの操作を行えばよい。

アルカリ処理を施し、水洗したキチン成形体は水によっ
て膨潤しており、このようにして得られた膨潤キチン成
形体をそのまま酵素溶液中に浸漬してもよいが、その前
に緩衝液に浸漬して十分に平衡化しておくことが望まし
く、用いる緩衝液の種類、濃度、　ｐＨなどは酵素溶液
と同一のものが好ましい。

本発明に用いられる酵素溶液とは、酵素活性をもつ液体
であり、酵素の種類、純度、濃度及び起源などはいかな
るものでもよく、複数の酵素を含有している液体であっ
てもよい。

本発明において１例えば次にあげるような種類の酵素が
使用できる。

酸化還元酵素：アスコルビン酸オキシダーゼ。

アラニンデヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシターゼ、ウ
リカーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、タル
コースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラー
ゼ、チトクロームＣオキシダーゼ、チロシナーゼ、乳酸
デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、６−ホスホグル
コン酸デヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲナーゼ。

ＮＡＤＨオキシダーゼなど。

転移酵素：アスパラギン酸アセチルトランスフェラーゼ
、アミノ酸トランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アデニ
レートキナーゼ、タレアチンホスホキナーゼ、グルコキ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ。

ホスホアセチルキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ。

フルクトキナーゼなど。

加水分解酵素：アミラーゼ、アスパラギナーゼ。

アセチルコリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ。

アルギナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、カリクレイン、キモ
トリプシン、トリプシン、トロンビン、ナリンジナーゼ
、ヌクレオチターゼ、パパイン、ヒアウロニダーゼ、プ
ラスミン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシン
、ペニシリナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホスホリパ
ーゼ、ホスファクターゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リボ
ヌクレアーゼ、レンニン、ケラチナーゼ、デハロゲナー
ゼなど。

リアーゼ：アスパラギン酸デカルボキシラーゼ。

アスパターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカル
ボキシラーゼ、スレオニンアルドラーゼ。

ヒスチジンアンモニナリアーゼ、フェニルアラニンアン
モニアリアーゼ、ファラーゼ、ファール酸ヒドラーゼ、
リンゴ酸シンテターゼ、メチオニナーゼなど。

異性化酵素：アラニンラセマーゼ、グルコースイソメラ
ーゼ、グルコースホスフェイトイソメラーゼ、グルタミ
ン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ。

スーパーオキシドディスムターゼなど。

リガーゼ：アミノ酸活性化酵素、アスパラギンシンテタ
ーゼ、グルタチオンシンテターゼ、グルタミンシンテタ
ーゼ、ピルビン酸シンテターゼなど。

上記の酵素を溶解する溶剤としては、緩衝液が適してお
り、その種類、濃度、　ｐＨは使用する酵素の安定性と
キチン成形体への酵素の固定化率とから決定されるため
一律には規定し得ないが、概ね好ましい濃度は１ｍＭ＝
　０．５Ｍであり、さらに好ましくは５ｍＭ〜０．２Ｍ
であり、最適には１０ｍＭ〜０．１Ｍの範囲である。好
ましいｐＨ域は、ｐＨ２〜１１であり、さらに好ましく
はｐＨ４〜９の範囲である。

本発明の方法を実施するにあたって、膨潤キチン成形体
を酵素溶液に浸漬するが、その条件は特に限定されない
。しかしながら、酵素の安定性及び固定化収率向上の観
点から、好ましい温度は０〜３０℃、さらに好ましくは
０〜２０℃、最適には０〜１０°Ｃであり、浸漬時間は
好ましくは１０分以上。

さらに好ましくは１時間以上、最適には２〜１２時間で
あればよい。

以上のようにして膨潤キチン成形体を酵素溶液に浸漬し
た後、グルタルアルデヒド処理を行うが。

実施に際しては、膨潤キチン成形体が浸漬されている酵
素溶液にグルタルアルデヒドを添加してもよく、又は酵
素溶液から取り出した膨潤キチン成形体をグルタルアル
デヒドを含む緩衝液に浸漬してもよい。いずれの場合に
おいても、グルタルアルデヒドの濃度は、好ましくは０
．０１〜２０ｗ／ｖ％。

さらに好ましくは０．０２〜１０ｗ／ｖ％、最適には０
．０５〜５ｗ／ｖ％であればよい。また、グルタルアル
デヒド処理する際の温度と時間とは、−概には規定し得
ないが１例えば４℃で処理する場合には約１０時間、　
２０℃の場合では２〜５時間であればよい。

グルタルアルデヒド処理により得られた固定化酵素は、
水又は緩衝液を用いて十分に洗浄し、過剰のグルタルア
ルデヒドや遊離の酵素などを除去することが望ましい。

以上述べた本発明の方法により得られる固定化酵素の特
長は、形態が粒状あるいは繊維状に成形されているため
、実際に使用する場合の操作性が非常に良好なことであ
り、また本発明の方法によれば特に粒状キチンは多孔性
であるため、担体重量当りの酵素活性の高い固定化酵素
が容易に得られる。その他、キチンは生体適合性に優れ
ているため９本発明の方法により得られる固定化酵素は
。

化粧品や医薬品などの人体に直接触れるような用途にも
適用できる。

以下に実施例をあげ１本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ キチン粉末５ｇを８贈ハ％ＬｉＣ１を含むジメチルアセ
トアミド９９５ｇに溶解しキチン溶液を得た。

この溶液を直径０．２１のノスプルからメタノールに滴
下し粒状に凝固せしめた後、水で洗浄して直径約０．８
ｎ＋ｍのキチンビーズ３５０ｍ　ｌを得た。４００ｇの
水酸化ナトリウムにこのキチンビーズと水を加えて１０
１００Ｏとし、８５℃に３０分間保った後、冷却し。

水洗を繰り返した。得られた膨潤キチンビーズ１０ｍ１
を２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に浸漬して平衡
化した後、同緩衝液１ｍｌあたり１３０ユニツトのグル
コキナーゼを含む酵素液１５ｍ１に浸漬した。４℃にて
５時間ゆるやかに攪拌した後、２５％グルタルアルデヒ
ド溶液の０．１ｍｌを添加し、４℃で８時間ゆるやかに
攪拌し１次いで５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）にて洗浄した。

このようにして得たグルコキナーゼ固定化キチンビーズ
の活性を、グルコースをＡＴＰとから生成したグルコー
ス−６−リン酸量をグルコース−６−リン酸脱水素酵素
を用いて測定した結果、ビーズ１ｍｌあたり７０ユニツ
トであり、固定化率は約３６％であった。

実施例２ キチン粉末３０ｇを８　ｗ／Ｗ％のＬｉＣ１を含むジメ
チルアセトアミド９７０ｇに溶解しキチン溶液を得た。

この溶液を加圧下でギヤーポンプにて輸送し、直径０．
０７ｍｍ、　　１５０ホールのノズルより水中に押し出
して繊維化し、水中で巻き取った。得られた繊維を８０
℃に加温した４０ｗ／Ｖ％ＮａＯＨ水溶液中に２時間浸
漬した後、よく水洗し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５
，５）に浸漬した。このようにして得られた繊維状膨潤
キチン５ｇを、２６０ユニツトのプロテアーゼを含む同
緩衝液２０ｍ１に浸漬し、４℃に６時間放置した後、０
，２％のグルタルアルデヒドを含む同緩衝液５０ｍ１＆
：：室温で２時間浸漬した。０．５ＭＮａＣ１水溶液で
よく洗浄したのちに測定したプロテアーゼ活性は、キチ
ン繊維５０ｍｇあたり１．８ユニツトであり固定化率は
６９％であった。

参考例１ キチン粉末と膨潤キチン成形体のそれぞれに固定化され
る酵素量を比較するため以下の実験を行った。

キチン粉末（１００メツシユ）　　２００ｍｇと、乾燥
重量が２００ｍｇに担当ひる水膨潤キチンビーズ（１５
ｍｌ）を、　８０℃の４０ｗ／ｖ％ＮａＱＨ水溶液に３
０分間浸漬した後、よく水洗して、　　２００ｍＭリン
酸緩衝液（ｐｉ（６）にて平ｉ化した。２５０ユニツト
のグルコースオキシダーゼを含む３０ｍ　ｌの同緩衝液
に、それぞれのキチンを浸漬して４℃で３時間経過後、
　　０．２ｍｌの２５％グルタルアルデヒド溶液を添加
し冷蔵庫に一夜放置した。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
５，６）にて洗浄後、それぞれのキチンに固定化された
酵素活性を３０℃における酵素吸収速度から求めたとこ
ろ、キチン粉末では９５ユニツト、キチンビーズでは１
７０ユニツトであった。

以上の結果より膨潤キチン成形体の方が、キチン粉末よ
りも、酵素固定化用担体としてはるかに優れていること
がわかる。

参考例２ 固定化酵素をカラムに詰め、連続反応を行う場合の成形
化キチン固定化酵素の操作性を検討した。

実施１で得たグルコキナーゼを固定化したビーズを、径
１０ｍｍ、長さ５ｃｍ０カラムに詰め、５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）を通液した。通液速度を徐
々に上げ、　５Ｖ＝３０で６時間経過後もビーズ層の圧
縮は起こらなかった。

以上の結果より、ビーズ状キチン固定化酵素は。

巾広い操作条件で使えることがわかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）あらかじめ成形されたキチンをアルカリ処理して
   膨潤キチン成形体を得、得られた膨潤キチン成形体を酵
   素溶液に浸漬したのちグルタルアルデヒド処理を行うこ
   とを特徴とする固定化酵素の製造方法。