JPH0614020B2 - 酵素電極の活性化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、固定化酵素電極（以下酵素電極と略す）の活
性化方法に関する。

（従来の技術） 酵素反応を生体物質や食品等に含まれる測定目的物質の
定量に用いることは、その反応速度の速さ及び基質特異
性を有する等の利点から広く行われている。特に酵素電
極を用いた測定方法は、微量の酵素を反履利用する可能
性を開き、その応用範囲を医療、食品、薬品分析等に広
げつつある。酵素電極には、白金、グラファイト等の基
体上に直接酵素を固定化したもの、あるいは特願昭６２
−１４６４８号の如く選択透過膜等の高分子膜を介して
酵素を固定化したもの等がある。通常これらの酵素電極
においては、酵素を含む層に充分な強度を持たせる目的
で、酵素にアルブミン等の蛋白質及び架橋剤を混合し、
混合固定化層を形成している。

しかし、このようにして得られた混合固定化層は高次構
造を有する蛋白質を架橋したもので、測定物質を自由に
は透過させないため、測定物質と酵素の接触を妨げる傾
向にあり、必ずしも満足すべき測定感度を有する酵素電
極が得られない。一方、感度を上げるために混合固定化
層中の蛋白質を減らすと充分な層強度が得られない欠点
があった。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、酵素と蛋白質の混合固定化層を有する酵素電
極において、固定化層の強度を損なわずに測定感度を向
上させることを目的とする。

（問題を解決するための手段） 本発明は、基体(1)上に直接もしくは高分子膜(2)を介し
て酵素と蛋白質の混合固定化層(3)を形成した酵素電極
を、水又は緩衝液中で４０℃以上に加熱処理することを
特徴とする酵素電極の活性化方法である。

（作用） 本発明で使用する酵素電極は、酵素を含む混合固定化層
を有するものである。例えば金、白金、銀、グラファイ
ト等の基体表面に１種或いは２種以上の酵素を含む混合
固定化層を形成したもの、アセチル化セルロース等の高
分子膜(2)上に酵素の混合固定化層(3)を形成し、基体
(1)に固定したもの（第１図）、基体に直接アルブミン
等高分子の選択透過膜を形成し、該選択透過膜上に混合
固定化層を形成したもの等がある。

このような酵素電極の混合固定化層は、酵素以外の蛋白
質及びグルタルアルデヒド等の架橋剤を含む酵素溶液を
基体又は高分子膜に塗布乾燥して形成される。酵素とし
てはグルコースオキシダーゼ、インベルターゼ、アミラ
ーゼ、アルコールオキシダーゼ等が用いられ、酵素以外
の蛋白質としては血清アルブミン、卵白アルブミン、グ
ロブリン等の球状蛋白質等を用いることが出来る。

本発明は、このような混合固定化層を有する酵素電極
を、水又は緩衝液中で加熱処理することにより、測定感
度を向上させることに特徴を有する。加熱処理温度が低
いと本発明の効果が得られないため、４０℃以上で行う
必要がある。ただし、温度が高すぎると酵素が失活する
恐れもあるため７０℃以下で行うのが好ましい。

例えばグルコースオキシダーゼと、アルブミン或いはグ
ロブリンの混合固定化層の場合４０〜７０℃好ましくは
４３〜６０℃、より好ましくは４５〜５５℃で、１分〜
２時間、好ましくは５分〜６０分加熱処理を行う。ま
た、インベルターゼとグルコースオキシダーゼを含み、
アルブミン或いはグロブリンとの混合固定化層を形成し
た場合４０〜６０℃、好ましくは４３〜６０℃、より好
ましくは４５〜５５℃で１分〜２時間、好ましくは５分
〜６０分加熱処理を行う。

このような加熱処理は電極を測定装置に装着したまま、
あるいは取り外して水又は緩衝液中で行われ、緩衝液と
しては燐酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液等が用いられる。

なお、このような効果が得られる理由については必ずし
も明らかではないが、混合固定化層中の酵素以外の蛋白
質が加熱により変性して、測定目的物質を透過し易くな
るため、酵素と測定目的物質による反応が促進されるも
のと考えられる。

なお、本発明は、酵素を含む混合固定化層を有する反応
器にも応用することが出来る。例えば、ガラスビーズ等
に、インベルターゼとアルブミンの混合固定化層を設け
た固定化担体の場合、４０〜６０℃で１分〜２時間加熱
処理を行うことにより活性化させることが出来る。

以下に実施例に示すが、勿論本発明はこれらのみに限定
されるものではない。

実施例１ 直径２mmの白金線の末端をエメリー紙で研磨し、側面を
熱収縮テフロンで被覆して電極基体とした。２％ウシ血
清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製；フラクションＶ）水溶
液に0.2％になるようにグルタルアルデヒドを添加した
液を、基体上に５μ塗布し、乾燥して選択透過性を有
する高分子を形成した。

１％グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製；Ｔｙｐ
ｅＩＩ）と１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製；
フラクションＶ）を含む燐酸ナトリウム緩衝液に0.2％
になるようにグルタルアルデヒドを添加した液を、上記
高分子膜に2.5μ塗布、乾燥して酵素電極を得た。

このようにして作成した酵素電極を0.1Ｍ燐酸緩衝液（p
H70.0）中で白金対極、銀、塩化銀参照極を有する３電
極形式のセルに組み込み、フロー型測定装置に設定し
た。

対銀・塩化銀参照極＋0.6Ｖの電圧を酵素電極に印加
し、資料注入口より５ｍＭ〜５０ｍＭのグルコース水溶
液１０μを逐次注入して、出力電流値を記録した（第
２図）。

同様に、１０ｍＭ〜５０ｍＭのアスコルビン酸水溶液を
注入して、出力電流値を記録した（第２図）。

次に酵素電極を取り外し0.1Ｍ燐酸緩衝液（pH7.0）の入
ったビーカーに入れ、これをウォーターバスで５０℃に
６０分間保って、加熱処理を行った。酵素電極を測定装
置に設定して、対銀・塩化銀参照極＋0.6Ｖの電圧を酵
素電極に印加し、資料注入口より５ｍＭ〜５０ｍＭのグ
ルコース水溶液１０μを逐次注入して、出力電流値を
記録した（第３図）。

同様に、１０ｍＭ〜５０ｍＭのアスコルビン酸素溶液を
注入して、出力電流を記録した（第３図）。

加熱処理により、酵素電極のグルコース２０ｍＭに対す
る出力電流値は、0.28μＡから0.44μＡへとなり、感度
が約1.5倍向上していた。グルコース定量の際に測定妨
害物質となるアスコルビン酸の出力電流値も、加熱処理
により約1.5倍に上がったが、グルコースに対する感度
の向上率とほぼ同じであるため、試料中に混入している
アスコルビン酸による測定誤差の割合は処理前と同じで
あった。

比較例１ 加熱処理温度を３５℃とした以外は実施例１と同様に測
定を行った。

加熱処理前の出力電流値を第４図、処理後の出力電流値
を第５図に示す。

３５℃では加熱処理の効果は全く得られなかった。

（効果） このように、本発明の活性化方法によれば、混合固定化
層を有する酵素電極は、混合固定化層の強度を損なわず
に、極めて優れた測定感度に向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で用いられる酵素電極を例示した断面
図で、高分子膜上に酵素の混合固定化層を形成し、該高
分子膜を基体に固定した酵素電極を表す。 第２図は実施例１において加熱処理を行う前の酸素電極
により得られたグルコース及びアスコルビン酸に対する
出力電流値を表し、第３図は本発明にかかる加熱処理を
行った後の出力電流値を表す。 第４図は比較例１において加熱処理を行う前の酵素電極
により得られたグルコース及びアスコルビン酸に対する
出力電流値を表し、第５図は３５℃で加熱処理を行った
後の出力電流値を表す。 (1)……基体 (2)……高分子膜 (3)……混合固定化層

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】基体(1)上に直接もしくは高分子膜(2)を介
   して酵素と蛋白質の混合固定化層(3)を形成した酵素電
   極を、水又は緩衝液中で４０℃以上に加熱処理すること
   を特徴とする酵素電極の活性化方法。