JPH059072B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH059072B2 JPH059072B2 JP61127423A JP12742386A JPH059072B2 JP H059072 B2 JPH059072 B2 JP H059072B2 JP 61127423 A JP61127423 A JP 61127423A JP 12742386 A JP12742386 A JP 12742386A JP H059072 B2 JPH059072 B2 JP H059072B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cholesterin
- serum
- oxidase
- solution
- cholestenone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遊離及びエステル化されたコレステリ
ンの酵素定量に使用する方法に関する。
ンの酵素定量に使用する方法に関する。
コレステリンの定量は医学的な診断法にとつて
非常に重要である。増加したコレステリン血中濃
度は動脈硬化症の重要な危険因子である。コレス
テリン値の高い場合、すなわち高コレステリン血
症の場合には、コレステリン値の低い場合よりも
頻繁に冠機能不全及び心臓硬塞が起きる。高コレ
ステリン血症は動脈硬化症及び冠状動脈疾患を惹
起しやすい。従つて治療を適正時に開始するため
には、早期に発見しなければならない。高いコレ
ステリン値は真性糖尿病、ネフローゼ症候群、甲
状腺機能減弱及び肝疾患、例えば胆汁肝硬変の場
合にもしばしば見出される。
非常に重要である。増加したコレステリン血中濃
度は動脈硬化症の重要な危険因子である。コレス
テリン値の高い場合、すなわち高コレステリン血
症の場合には、コレステリン値の低い場合よりも
頻繁に冠機能不全及び心臓硬塞が起きる。高コレ
ステリン血症は動脈硬化症及び冠状動脈疾患を惹
起しやすい。従つて治療を適正時に開始するため
には、早期に発見しなければならない。高いコレ
ステリン値は真性糖尿病、ネフローゼ症候群、甲
状腺機能減弱及び肝疾患、例えば胆汁肝硬変の場
合にもしばしば見出される。
公知で有効なコレステリン定量法はリーベルマ
ン・ブルヒアルト（Liebermann und
Burchard）の反応に基づいている。この方法に
よると、遊離のコレステリンおよびエステル化コ
レステリンが無水酢酸および濃硫酸と青−緑色に
着色した化合物を形成し、この濃淡が分光光度計
で測定されている。
ン・ブルヒアルト（Liebermann und
Burchard）の反応に基づいている。この方法に
よると、遊離のコレステリンおよびエステル化コ
レステリンが無水酢酸および濃硫酸と青−緑色に
着色した化合物を形成し、この濃淡が分光光度計
で測定されている。
この公知方法の重大な欠点を有する。その主要
な欠点はその方法が非特異的である点にある。リ
ーベルマン・ブルヒアルトの反応は、コレステリ
ン以外のステロイドによつても起きる比較的非特
異的なステロイド反応である。例えば血漿中には
他のステロイドと共に、なお１〜３％のジヒドロ
コレステリン及び0.5〜1.4％の△７−コレステノ
ールも存在するので、大きな誤差が生じる。その
上、該反応はビリルビン及びヘモグロビンによつ
て障たげられ、結果、不当に高いプラスのコレス
テリン値が得られる。その他の欠点は、攻撃的で
腐蝕性の試薬を使用して操作しなくてはならない
という点に存する。
な欠点はその方法が非特異的である点にある。リ
ーベルマン・ブルヒアルトの反応は、コレステリ
ン以外のステロイドによつても起きる比較的非特
異的なステロイド反応である。例えば血漿中には
他のステロイドと共に、なお１〜３％のジヒドロ
コレステリン及び0.5〜1.4％の△７−コレステノ
ールも存在するので、大きな誤差が生じる。その
上、該反応はビリルビン及びヘモグロビンによつ
て障たげられ、結果、不当に高いプラスのコレス
テリン値が得られる。その他の欠点は、攻撃的で
腐蝕性の試薬を使用して操作しなくてはならない
という点に存する。
前記の欠点を有せず、かつ特にコレステリンに
対し絶対的に特異的であり、腐蝕的な試薬を必要
としない新規コレステリン定量法は、既にコレス
テリンを水媒体中でコレステリンオキシダーゼと
共に恒温に保持し、かつ酸素消費量又は生成した
H2O2又はコレステノンを定量することから成る
コレステリン定量法により解決されている。
対し絶対的に特異的であり、腐蝕的な試薬を必要
としない新規コレステリン定量法は、既にコレス
テリンを水媒体中でコレステリンオキシダーゼと
共に恒温に保持し、かつ酸素消費量又は生成した
H2O2又はコレステノンを定量することから成る
コレステリン定量法により解決されている。
即ち、特公昭54−8318号（特願昭47−95060号
の分割）には、液体を、コレステロールを△４−
コレステノンおよび過酸化水素に酸化できる酵素
製剤とインキユベートし、且つ、存在するコレス
テロール量を、生成される過酸化水素量を測定す
ることによつて決定することから成る液体中のコ
レステロールの定量法が、公告されている。この
公告方法は液体、殊に血清中のコレステロールを
酵素的に特異的に定量する方法を提供したもので
あつて、医学的日常検査に極めて大きな貢献をも
たらしたものと評価されている。
の分割）には、液体を、コレステロールを△４−
コレステノンおよび過酸化水素に酸化できる酵素
製剤とインキユベートし、且つ、存在するコレス
テロール量を、生成される過酸化水素量を測定す
ることによつて決定することから成る液体中のコ
レステロールの定量法が、公告されている。この
公告方法は液体、殊に血清中のコレステロールを
酵素的に特異的に定量する方法を提供したもので
あつて、医学的日常検査に極めて大きな貢献をも
たらしたものと評価されている。
しかしながら、血清中の遊離のコレステリンを
定量すると共に、血清中に存在するコレステリン
エステルをコレステリンエステラーゼを使用して
予め鹸化したのち、合わせて定量する方法は、そ
の最先の優先権主張日には提案されていなかつ
た。
定量すると共に、血清中に存在するコレステリン
エステルをコレステリンエステラーゼを使用して
予め鹸化したのち、合わせて定量する方法は、そ
の最先の優先権主張日には提案されていなかつ
た。
本発明は特公昭54−8318号の発明と同様、
H2O2およびコレステノンの生成能を有するコレ
ステリンオキシダーゼを使用してコレステリンを
定量しようとするものであるが、殊に、血清およ
び血漿中の遊離のコレステリンのみならずエステ
ル化されたコレステリンをも定量しようとするも
のであり、その際、コレステリンエステラーゼを
使用して、コレステリンエステルからコレステリ
ンを遊離させ、遊離してきたコレステリンを別個
にあるいは既に存在するコレステリンと共に、コ
レステリンオキシダーゼを用いて定量しようとす
るもので、その際表面活性剤をも併用しようとす
るものである。
H2O2およびコレステノンの生成能を有するコレ
ステリンオキシダーゼを使用してコレステリンを
定量しようとするものであるが、殊に、血清およ
び血漿中の遊離のコレステリンのみならずエステ
ル化されたコレステリンをも定量しようとするも
のであり、その際、コレステリンエステラーゼを
使用して、コレステリンエステルからコレステリ
ンを遊離させ、遊離してきたコレステリンを別個
にあるいは既に存在するコレステリンと共に、コ
レステリンオキシダーゼを用いて定量しようとす
るもので、その際表面活性剤をも併用しようとす
るものである。
即ち本発明の対象は(1)血清又は血漿中のコレス
テリンエステルを、先ず第一工程でコレステリン
エステラーゼにより鹸化し、次いで得られたコレ
ステリンを第二工程で表面活性剤の存在下、コレ
ステリンオキシダーゼと反応することにより定量
することを特徴とする血清又は血漿中の、遊離又
は結合したコレステリン測定方法である。
テリンエステルを、先ず第一工程でコレステリン
エステラーゼにより鹸化し、次いで得られたコレ
ステリンを第二工程で表面活性剤の存在下、コレ
ステリンオキシダーゼと反応することにより定量
することを特徴とする血清又は血漿中の、遊離又
は結合したコレステリン測定方法である。
そうして、上記第一工程の鹸化液中に生成した
コレステリンは、第二工程で生成するコレステノ
ン或はH2O2量を測定することにより定量される。
このコレステノン量を定量するための諸試薬や
H2O2量を定量するための諸試薬は、コレステリ
ン、コレステリンオキシダーゼ及び界面活性剤を
含有する反応液に、その酵素反応が完了した後始
めて加えられる。また、上記酵素反応進行の前に
加えても良い。
コレステリンは、第二工程で生成するコレステノ
ン或はH2O2量を測定することにより定量される。
このコレステノン量を定量するための諸試薬や
H2O2量を定量するための諸試薬は、コレステリ
ン、コレステリンオキシダーゼ及び界面活性剤を
含有する反応液に、その酵素反応が完了した後始
めて加えられる。また、上記酵素反応進行の前に
加えても良い。
コレステリンオキシダーゼは次の反応を接触す
る新規酵素である： コレステリン＋O2コレステリンオキシダーゼ ―――――――――――― コレステノン＋H2O2 この反応は定量的に進行し、絶対的に特異で、
かつ正確なコレステリンの定量を可能ならしめ
る。
る新規酵素である： コレステリン＋O2コレステリンオキシダーゼ ―――――――――――― コレステノン＋H2O2 この反応は定量的に進行し、絶対的に特異で、
かつ正確なコレステリンの定量を可能ならしめ
る。
本発明の方法は、血清中の遊離のコレステリン
のみならず、結合したコレステリンの定量に好適
である。周知の如くエステル化された形で存在す
る結合型コレステリンも前以つて化学的もしくは
酵素的に鹸化することによつて定量することがで
きる。化学的鹸化はアルコール性苛性カリ溶液に
よつて行われるから、それに続いて行われるべき
コレステリンオキシダーゼによる酸化反応に先立
つて、中和ろ過等の複雑な中間工程が必要とな
る。これに反して、酵素的鹸化はエステラーゼ、
有利には肝臓又は膵臓からのコレステリンエステ
ラーゼによつて行われるから、その様な複雑な中
間工程は必要としない。
のみならず、結合したコレステリンの定量に好適
である。周知の如くエステル化された形で存在す
る結合型コレステリンも前以つて化学的もしくは
酵素的に鹸化することによつて定量することがで
きる。化学的鹸化はアルコール性苛性カリ溶液に
よつて行われるから、それに続いて行われるべき
コレステリンオキシダーゼによる酸化反応に先立
つて、中和ろ過等の複雑な中間工程が必要とな
る。これに反して、酵素的鹸化はエステラーゼ、
有利には肝臓又は膵臓からのコレステリンエステ
ラーゼによつて行われるから、その様な複雑な中
間工程は必要としない。
前記一般式による、H2O2生成量又はコレステ
ノン生成量の測定はその為に公知かつ常用の方法
により行うことができる。
ノン生成量の測定はその為に公知かつ常用の方法
により行うことができる。
即ち、生成した過酸化水素は、滴定並びに電位
差滴定、ポーラログラフイー及び比色並びに酵素
法により定量することができる。カタラーゼ及び
ペルオキシダーゼを使用する酵素法が有利であ
る。該方法は単に非常に特異的でかつ確実である
のみならず、極めて簡単に過酸化水素の生成下に
主反応と組合わせることができるからである。特
にβ−ジケトン類、例えばアセチルアセトン及び
低級脂肪族の１価又は多価アルコール、例えばメ
タノール、エタノール又はメチレングリコールの
存在下でのカタラーゼによる測定及び発色体の存
在下でのペルオキシダーゼによる測定が特に適当
であると判明した。カタラーゼ、アセチルアセト
ン及びメタノールを用いる測定の際に、メタノー
ルはホルムアルデヒドに酸化され、このホルムア
ルデヒドはアセチルアセトンと共に呈色反応を生
じ、この呈色反応を測定することができる。ペル
オキシダーゼによる測定の際には、反応後に光度
測定法で測定することのできる化合物を発色体と
して使用する。適当な発色体の例は２，2′−アミ
ノベンズチアゾリンスルホン酸である。
差滴定、ポーラログラフイー及び比色並びに酵素
法により定量することができる。カタラーゼ及び
ペルオキシダーゼを使用する酵素法が有利であ
る。該方法は単に非常に特異的でかつ確実である
のみならず、極めて簡単に過酸化水素の生成下に
主反応と組合わせることができるからである。特
にβ−ジケトン類、例えばアセチルアセトン及び
低級脂肪族の１価又は多価アルコール、例えばメ
タノール、エタノール又はメチレングリコールの
存在下でのカタラーゼによる測定及び発色体の存
在下でのペルオキシダーゼによる測定が特に適当
であると判明した。カタラーゼ、アセチルアセト
ン及びメタノールを用いる測定の際に、メタノー
ルはホルムアルデヒドに酸化され、このホルムア
ルデヒドはアセチルアセトンと共に呈色反応を生
じ、この呈色反応を測定することができる。ペル
オキシダーゼによる測定の際には、反応後に光度
測定法で測定することのできる化合物を発色体と
して使用する。適当な発色体の例は２，2′−アミ
ノベンズチアゾリンスルホン酸である。
コレステノンの測定はケト試薬、有利にはヒド
ラゾン生成下にケト基と反応するヒドラゾン誘導
体、例えば２，４−ジニトロフエニルヒドラジン
を用いて実施する。しかしながら、コレステノン
を直接、240nmにおける吸収の測定によつて測定
することもできる。
ラゾン生成下にケト基と反応するヒドラゾン誘導
体、例えば２，４−ジニトロフエニルヒドラジン
を用いて実施する。しかしながら、コレステノン
を直接、240nmにおける吸収の測定によつて測定
することもできる。
本発明のコレステリンオキシダーゼ及びH2O2
測定用の系又はコレステノン測定用の系から成る
コレステリン測定試薬の第一の有利な実施例にお
いて、該試薬はコレステリンオキシダーゼ、カタ
ラーゼ、アセチルアセトン、メタノール及びアン
モニウムイオン含有の緩衝液（単独又は混合し
て）から構成されている。もう１つの有利な実施
例においては、試薬はコレステリンオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、発色体及び緩衝液（単独
又は混合して）から構成されている。発色体とし
ては２，2′−アミノベンズチアゾリンスルホン酸
が有利である。
測定用の系又はコレステノン測定用の系から成る
コレステリン測定試薬の第一の有利な実施例にお
いて、該試薬はコレステリンオキシダーゼ、カタ
ラーゼ、アセチルアセトン、メタノール及びアン
モニウムイオン含有の緩衝液（単独又は混合し
て）から構成されている。もう１つの有利な実施
例においては、試薬はコレステリンオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、発色体及び緩衝液（単独
又は混合して）から構成されている。発色体とし
ては２，2′−アミノベンズチアゾリンスルホン酸
が有利である。
その他の有利な例によれば、本発明による方法
はコレステリンオキシダーゼ及びヒドラゾン生成
下にケト基と反応するヒドラジン誘導体及び場合
により緩衝液から構成されている試薬を用いて実
施される。ヒドラジン誘導体としては２，４−ジ
ニトロフエニルヒドラジンが有利である。
はコレステリンオキシダーゼ及びヒドラゾン生成
下にケト基と反応するヒドラジン誘導体及び場合
により緩衝液から構成されている試薬を用いて実
施される。ヒドラジン誘導体としては２，４−ジ
ニトロフエニルヒドラジンが有利である。
有利には、前記の試薬組合せは記載した必須成
分の他に付加的に常用の溶剤、安定剤及び表面活
性物質を含有する前記の有利な試薬組合せは主成
分を次の量比で含有する。
分の他に付加的に常用の溶剤、安定剤及び表面活
性物質を含有する前記の有利な試薬組合せは主成
分を次の量比で含有する。
１ PH５〜７のアンモニウムイオン含有緩衝液
100ml中にコレステリンオキシダーゼ13〜150単
位並びに市販のカタラーゼ2.104〜5.105単位、
アセチルアセトン0.05〜0.2ml及びメタノール
２〜10ml、並びに界面活性剤（有利にはヒドロ
キシポリエドキシドデカン）0.02〜0.3ml。
100ml中にコレステリンオキシダーゼ13〜150単
位並びに市販のカタラーゼ2.104〜5.105単位、
アセチルアセトン0.05〜0.2ml及びメタノール
２〜10ml、並びに界面活性剤（有利にはヒドロ
キシポリエドキシドデカン）0.02〜0.3ml。
２ PH６〜８の緩衝液100ml中にコレステリンオ
キシダーゼ３〜40単位並びに市販のペルオキシ
ダーゼ2.10〜1.104単位、２，2′−アミノベンズ
チアゾリンスルホン酸50〜200mg並びに界面活
性剤（有利にはヒドロキシポリエトキシドデカ
ン）0.05〜0.5ml。
キシダーゼ３〜40単位並びに市販のペルオキシ
ダーゼ2.10〜1.104単位、２，2′−アミノベンズ
チアゾリンスルホン酸50〜200mg並びに界面活
性剤（有利にはヒドロキシポリエトキシドデカ
ン）0.05〜0.5ml。
３ コレステリンオキシダーゼ0.1〜１単位、２，
４−ジニトロフエルヒドラジンの1mM溶液１
〜５ml及び場合により界面活性剤0.005〜0.1
ml。
４−ジニトロフエルヒドラジンの1mM溶液１
〜５ml及び場合により界面活性剤0.005〜0.1
ml。
４ PH５〜９の緩衝液、有利にはPH7.5の0.5M燐
酸ナトリウム緩衝液50ml中にコレステリンオキ
シダーゼ２〜100単位並びに界面活性剤（有利
にはヒドロキシポリエトキシドデカン）0.1〜
20ml。
酸ナトリウム緩衝液50ml中にコレステリンオキ
シダーゼ２〜100単位並びに界面活性剤（有利
にはヒドロキシポリエトキシドデカン）0.1〜
20ml。
次に本発明を実施例につき説明する。
参考例 １
H2O2の定量
燐酸水素アンモニウム10ｇを水100mlに溶解し
85％燐酸でPH7.0に調整する。次いでカタラーゼ
105単位を添加する。こうして得た溶液で、アセ
チルアセトン0.2mlとメタノール10mlとの混合物
を全量100mlにする。
85％燐酸でPH7.0に調整する。次いでカタラーゼ
105単位を添加する。こうして得た溶液で、アセ
チルアセトン0.2mlとメタノール10mlとの混合物
を全量100mlにする。
こうして得た溶液7.5mlを血清0.5mlと混合す
る。血清含有試料にコレステリンオキシダーゼ５
単位及び10％ヒドロキシポリエトキシドデカン溶
液0.02mlを加え、70分間37℃で恒温保持する。次
いで生成した色素を、試薬盲検値を考慮して
405nmで光度計により測定する。次いで血清の代
わりに、コレステリン標準溶液（200mg％のコレ
ステリンを含有する）を用いて校正線図を作成、
これを添付の第１図に示した。この校正線図では
コレステリン濃度を405nmでの吸光につきプロツ
トした。
る。血清含有試料にコレステリンオキシダーゼ５
単位及び10％ヒドロキシポリエトキシドデカン溶
液0.02mlを加え、70分間37℃で恒温保持する。次
いで生成した色素を、試薬盲検値を考慮して
405nmで光度計により測定する。次いで血清の代
わりに、コレステリン標準溶液（200mg％のコレ
ステリンを含有する）を用いて校正線図を作成、
これを添付の第１図に示した。この校正線図では
コレステリン濃度を405nmでの吸光につきプロツ
トした。
血清含有試料のコレステリン濃度を、基準量と
してその校正線図を使用して測定する。リーベル
マン・ブルヒアルトによる対照値は約５％の偏差
を有していた。
してその校正線図を使用して測定する。リーベル
マン・ブルヒアルトによる対照値は約５％の偏差
を有していた。
参考例 ２
H2O2の定量
100mg％の２，2′−アミノベンズチアゾリンス
ルホン酸を含有するPH７の燐酸カリウム緩衝液
（O2飽和）３mlに20％ヒドロキシポリエトキシド
デカン0.05ml及び市販のペルオキシダーゼ溶液
0.02ml（＝36単位）及び還元性物質を除去するた
めにH2O20.02ml（水100mlに対し30（容量／容量）
％のH2O20.02ml）を加える。この混合物を光度
計で403nm又は436nmで追跡した。反応が静止し
たら直ちに血清0.01ml（水で１：15に希釈）を加
える。10分後の吸光度（E1）を読みコレステリ
ンオキシダーゼ0.15単位を加える。更に10分後吸
光度（E2）を読み吸光度差（E2−E1）を調べる。
ルホン酸を含有するPH７の燐酸カリウム緩衝液
（O2飽和）３mlに20％ヒドロキシポリエトキシド
デカン0.05ml及び市販のペルオキシダーゼ溶液
0.02ml（＝36単位）及び還元性物質を除去するた
めにH2O20.02ml（水100mlに対し30（容量／容量）
％のH2O20.02ml）を加える。この混合物を光度
計で403nm又は436nmで追跡した。反応が静止し
たら直ちに血清0.01ml（水で１：15に希釈）を加
える。10分後の吸光度（E1）を読みコレステリ
ンオキシダーゼ0.15単位を加える。更に10分後吸
光度（E2）を読み吸光度差（E2−E1）を調べる。
同様にして、但し200mg％の含分を有するコレ
ステリン標準溶液を使用し436nmで第２図に示し
た校正線を作成した。この校正線を用いて、血清
試料のコレステリン濃度を測定する。測定により
66mg％のコレステリン濃度が判明した。リーベル
マン・ブルヒアルトによる対照値は70mg％であつ
た。
ステリン標準溶液を使用し436nmで第２図に示し
た校正線を作成した。この校正線を用いて、血清
試料のコレステリン濃度を測定する。測定により
66mg％のコレステリン濃度が判明した。リーベル
マン・ブルヒアルトによる対照値は70mg％であつ
た。
実施例 １
H2O2の定量
100mg％の２，2′−アミノベンズチアゾリンス
ルホン酸を含む３mlのPH７の燐酸カリウム緩衝液
（O2で飽和）に、ヒドロキシポリエトキシドデカ
ンの20％溶液0.05mg及び市販のパーオキシダーゼ
溶液0.02ml（＝36U単位）、並びに0.02mlのH2O2
（0.02mlの30容量％のH2O2を水で100mlとする）
を加えて、還元性物質を除去する。この混合物を
405nm（若しくは436nm）で光度計で追跡する。
還元が停止するに到つたら、2.5単位のコレステ
リンエステラーゼ（パンクレアス）及び0.01mlの
血清（水で１：15に希釈）を加える。約30分後に
吸光度（E1）を読み取り、0.15単位のコレステリ
ンオキシダーゼを用いて更に反応を進行させる。
10分後に吸光度（E2）を読み取り、吸光度の差
（E2−E1）調べる。
ルホン酸を含む３mlのPH７の燐酸カリウム緩衝液
（O2で飽和）に、ヒドロキシポリエトキシドデカ
ンの20％溶液0.05mg及び市販のパーオキシダーゼ
溶液0.02ml（＝36U単位）、並びに0.02mlのH2O2
（0.02mlの30容量％のH2O2を水で100mlとする）
を加えて、還元性物質を除去する。この混合物を
405nm（若しくは436nm）で光度計で追跡する。
還元が停止するに到つたら、2.5単位のコレステ
リンエステラーゼ（パンクレアス）及び0.01mlの
血清（水で１：15に希釈）を加える。約30分後に
吸光度（E1）を読み取り、0.15単位のコレステリ
ンオキシダーゼを用いて更に反応を進行させる。
10分後に吸光度（E2）を読み取り、吸光度の差
（E2−E1）調べる。
検量曲線を用いて血清中の全コレステリン値を
測定する。この測定の結果180mg％なる全コレス
テリンの含有率であることが判つた。リーベルマ
ン・ブルヒアルトによる対照試験の結果は185mg
％であつた。
測定する。この測定の結果180mg％なる全コレス
テリンの含有率であることが判つた。リーベルマ
ン・ブルヒアルトによる対照試験の結果は185mg
％であつた。
参考例 １
コレステノンの定量
血清（水で１：10に希釈）0.2mlに20％ヒドロ
キシポリエトキシドデカン溶液0.05ml及びコレス
テリンオキシダーゼ0.15単位を加える。15分後
に、1N塩酸中に２，４−ジニトロフエルヒドラ
シン１ミリモルを含有する溶液2.0mlを添加する。
更に30分後に水4.0mlを加え、生成したヒドラゾ
ンを光度計で405nmで測定する。評価は試薬盲検
値を考慮して基準線について行なう。測定はアル
カリの添加後に546nmでも行うことができる。
キシポリエトキシドデカン溶液0.05ml及びコレス
テリンオキシダーゼ0.15単位を加える。15分後
に、1N塩酸中に２，４−ジニトロフエルヒドラ
シン１ミリモルを含有する溶液2.0mlを添加する。
更に30分後に水4.0mlを加え、生成したヒドラゾ
ンを光度計で405nmで測定する。評価は試薬盲検
値を考慮して基準線について行なう。測定はアル
カリの添加後に546nmでも行うことができる。
代表的試料の測定により遊離コレステリン60mg
％及び全コレステリン（アルコール性KOHによ
つてケン化）154mg％が得られた。
％及び全コレステリン（アルコール性KOHによ
つてケン化）154mg％が得られた。
リーベルマン・ブルヒアルトの比較定量では64
mgの遊離コレステリンと全コレステリン170mg％
が得られた。
mgの遊離コレステリンと全コレステリン170mg％
が得られた。
エステル化されたコレステリンをケン化するた
めに（血清中の全コレステリンの測定）、血清１
ml、20％ヒドロキシポリエトキシドデカン溶液１
ml及び90％エタノール中の0.5N KOH5mlを混合
し30分間70℃に加熱する。次いで溶液を冷却し、
0.1M硫酸マグネシウム溶液10mlと混合しかつ遠
心分離する。上澄液（13ml）全コレステリンを遊
離型で含有する。
めに（血清中の全コレステリンの測定）、血清１
ml、20％ヒドロキシポリエトキシドデカン溶液１
ml及び90％エタノール中の0.5N KOH5mlを混合
し30分間70℃に加熱する。次いで溶液を冷却し、
0.1M硫酸マグネシウム溶液10mlと混合しかつ遠
心分離する。上澄液（13ml）全コレステリンを遊
離型で含有する。
実施例 ２
コレステノンの定量
0.2mlの血清（水で１：10に希釈）を0.05mlの
20％ヒドロキシポリエトキシドデカン溶液、及び
2.5単位のコレステリンエステラーゼ（バンクレ
アス）と混合し、30分間37℃でPH７でインキユベ
ートとする。そのインキユベートが終了したの
ち、0.15単位のコレステリンオキシダーゼを加え
る。
20％ヒドロキシポリエトキシドデカン溶液、及び
2.5単位のコレステリンエステラーゼ（バンクレ
アス）と混合し、30分間37℃でPH７でインキユベ
ートとする。そのインキユベートが終了したの
ち、0.15単位のコレステリンオキシダーゼを加え
る。
15分後に、1N塩酸に1mmol／１の２，４−ジ
ニトロフエニルヒドラジンを溶かした溶液2.0ml
を加え、更に30分後4.0mlの水を加え生成したヒ
ドロゾンを405nmで光度計で測定する。ブランク
テストの値を考慮し、標準曲線により評定を行
う。
ニトロフエニルヒドラジンを溶かした溶液2.0ml
を加え、更に30分後4.0mlの水を加え生成したヒ
ドロゾンを405nmで光度計で測定する。ブランク
テストの値を考慮し、標準曲線により評定を行
う。
代表的試料を測定した結果154mg％なる全コレ
ステリンの値が得られた。リーベルマン・ブルカ
ルトによる比較測定の結果は、170mgなるコレス
テリン値であつた。
ステリンの値が得られた。リーベルマン・ブルカ
ルトによる比較測定の結果は、170mgなるコレス
テリン値であつた。
参考例 ２
0.4％ヒドロキシポリエトキシドデカンを有す
るPH7.5の0.5M燐酸ナトリウム緩衝液2.5mlに血清
0.2mlを加える。適当な分光光度計で240nmにお
ける吸光度（E1）を読みとり、コレステリンオ
キシダーゼ0.02ml（＝1.5U）で反応を開始する。
２分後にもう一度吸光度（E2）を読みとる。生
成したコレステノンの濃度及び従つてコレステリ
ンの濃度は、240nmにおけるコレステノンのモル
吸光係数を考慮して１回目の読みとりと２回目の
読みとりとの差から得られ、代表例試料の測定に
よる遊離のコレステリンは58mg％であつた。リー
ベルマン・ブルヒアルトの比較試験では62mg％で
あつた。
るPH7.5の0.5M燐酸ナトリウム緩衝液2.5mlに血清
0.2mlを加える。適当な分光光度計で240nmにお
ける吸光度（E1）を読みとり、コレステリンオ
キシダーゼ0.02ml（＝1.5U）で反応を開始する。
２分後にもう一度吸光度（E2）を読みとる。生
成したコレステノンの濃度及び従つてコレステリ
ンの濃度は、240nmにおけるコレステノンのモル
吸光係数を考慮して１回目の読みとりと２回目の
読みとりとの差から得られ、代表例試料の測定に
よる遊離のコレステリンは58mg％であつた。リー
ベルマン・ブルヒアルトの比較試験では62mg％で
あつた。
実施例 ３
コレステノンの測定
0.5Mol／ｌの燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.5で
0.4％のヒドロキシポリエトキシドデカン液を含
有する）2.5mlに、2.5単位のコレステリンエステ
ラーゼ及び0.2mlの血清加え、30分間インキユベ
ートする。そのインキユベート完了後240nmでの
吸光度（E1）を適当に分光光度計で読み取り、
その反応を0.02ml（＝1.5単位）のコレステリン
オキシダーゼで開始させる。２分の後、改めて吸
光度（E2）を読む。生成したコレステノンの濃
度、従つて全コレステリン量は240nmでモル吸光
度係数を考慮して、１回目と２回目の読み取り差
から得られる。
0.4％のヒドロキシポリエトキシドデカン液を含
有する）2.5mlに、2.5単位のコレステリンエステ
ラーゼ及び0.2mlの血清加え、30分間インキユベ
ートする。そのインキユベート完了後240nmでの
吸光度（E1）を適当に分光光度計で読み取り、
その反応を0.02ml（＝1.5単位）のコレステリン
オキシダーゼで開始させる。２分の後、改めて吸
光度（E2）を読む。生成したコレステノンの濃
度、従つて全コレステリン量は240nmでモル吸光
度係数を考慮して、１回目と２回目の読み取り差
から得られる。
典型的試料を測定したところ163mg％の全コレ
ステリン値が得られた。リーベルマン・ブルヒア
ルトでの対照試験の結果は全コレステリンが173
mg％であつた。
ステリン値が得られた。リーベルマン・ブルヒア
ルトでの対照試験の結果は全コレステリンが173
mg％であつた。
実施例 ４
血清0.05mlを、ヒドロキシポリエトキシドデカ
ン0.5％を含有する0.5M燐酸酸カリウム−緩衝液
（PH7.5）10ml中に加える。適当な分光光度計で
240nmでの吸光度（E1）を読み、1M硫酸アンモ
ニウム溶液中の貯蔵安定で、痕跡量の界面活性剤
も含まないコレステリンオキシダーゼ0.02ml（＝
0.1U）で反応を開始させる。３分後に改めて吸
光度（E2）を読む。最初の読みと２度目の読み
との差から、240nmでのコレステノンに関するモ
ル吸光係数を考慮に入れると、生じたコレステリ
ンの濃度が得られる。典型的な資料の測定で、遊
離のコレステリン62mg％及び全コレステリン（鹸
化後の）167mg％が得られた。
ン0.5％を含有する0.5M燐酸酸カリウム−緩衝液
（PH7.5）10ml中に加える。適当な分光光度計で
240nmでの吸光度（E1）を読み、1M硫酸アンモ
ニウム溶液中の貯蔵安定で、痕跡量の界面活性剤
も含まないコレステリンオキシダーゼ0.02ml（＝
0.1U）で反応を開始させる。３分後に改めて吸
光度（E2）を読む。最初の読みと２度目の読み
との差から、240nmでのコレステノンに関するモ
ル吸光係数を考慮に入れると、生じたコレステリ
ンの濃度が得られる。典型的な資料の測定で、遊
離のコレステリン62mg％及び全コレステリン（鹸
化後の）167mg％が得られた。
界面活性剤を添加しない比較測定は、15分の反
応時間を必要とした。
応時間を必要とした。
添付図面の第１図および第２図はコレステリン
標準溶液を用いて制作した吸光度とコレステリン
濃度との関係を示す校正線図である。
標準溶液を用いて制作した吸光度とコレステリン
濃度との関係を示す校正線図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の工程(1)及び工程(2)よりなる血清又は血漿
中のコレステリン測定方法： 工程(1)：血清又は血漿中のコレステリンエステ
ルをコレステリンエステラーゼによりケン化する
こと。 工程(2)：得られたコレステリンを界面活性剤の
存在下コレステリンオキシターゼと反応させてそ
れ自体公知の方法でコレステリン含量を定量する
こと。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2224132.3 | 1972-05-17 | ||
| DE19722224132 DE2224132C2 (de) | 1972-05-17 | 1972-05-17 | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62275700A JPS62275700A (ja) | 1987-11-30 |
| JPH059072B2 true JPH059072B2 (ja) | 1993-02-03 |
Family
ID=5845161
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP48055157A Pending JPS4962193A (ja) | 1972-05-17 | 1973-05-17 | |
| JP9956576A Pending JPS52106856A (en) | 1972-05-17 | 1976-08-20 | Quantitative method of cholesterol and reagent utilized in said method |
| JP2586977A Pending JPS53111792A (en) | 1972-05-17 | 1977-03-09 | Quantitative determination of cholesterin |
| JP2586877A Granted JPS53111791A (en) | 1972-05-17 | 1977-03-09 | Reagent for determination of cholesterin |
| JP61127422A Pending JPS62272999A (ja) | 1972-05-17 | 1986-05-30 | 血清中のコレステリンを測定するための試薬 |
| JP61127423A Granted JPS62275700A (ja) | 1972-05-17 | 1986-05-30 | 血清中のコレステリンを測定するための試薬 |
Family Applications Before (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP48055157A Pending JPS4962193A (ja) | 1972-05-17 | 1973-05-17 | |
| JP9956576A Pending JPS52106856A (en) | 1972-05-17 | 1976-08-20 | Quantitative method of cholesterol and reagent utilized in said method |
| JP2586977A Pending JPS53111792A (en) | 1972-05-17 | 1977-03-09 | Quantitative determination of cholesterin |
| JP2586877A Granted JPS53111791A (en) | 1972-05-17 | 1977-03-09 | Reagent for determination of cholesterin |
| JP61127422A Pending JPS62272999A (ja) | 1972-05-17 | 1986-05-30 | 血清中のコレステリンを測定するための試薬 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4212938A (ja) |
| JP (6) | JPS4962193A (ja) |
| AR (1) | AR195000A1 (ja) |
| CH (1) | CH610108A5 (ja) |
| CS (1) | CS163299B2 (ja) |
| DD (1) | DD103324A5 (ja) |
| DK (1) | DK145234C (ja) |
| FI (1) | FI53507C (ja) |
| HU (1) | HU169171B (ja) |
| IL (1) | IL42289A (ja) |
| IT (1) | IT994863B (ja) |
| MX (1) | MX153761A (ja) |
| SE (1) | SE387175B (ja) |
| SU (3) | SU664536A3 (ja) |
| YU (1) | YU129573A (ja) |
| ZA (1) | ZA733258B (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR195000A1 (es) * | 1972-05-17 | 1973-08-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Procedimiento para la determinacion de colesterol |
| US4186251A (en) * | 1973-03-01 | 1980-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Composition and method for determination of cholesterol |
| DE2315501C3 (de) * | 1973-03-28 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin |
| JPS50150496A (ja) * | 1974-05-22 | 1975-12-02 | ||
| US4399218A (en) * | 1980-02-05 | 1983-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for the determination of glycerin |
| US4409326A (en) * | 1980-07-10 | 1983-10-11 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized enzymatic solutions and method for determining total cholesterol in human serum |
| DE3046241A1 (de) * | 1980-12-08 | 1982-07-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin |
| US5047327A (en) * | 1982-04-02 | 1991-09-10 | Ivan E. Modrovich | Time-stable liquid cholesterol assay compositions |
| US5071772A (en) * | 1988-02-08 | 1991-12-10 | Raffaele Beli | Device for carrying out extemporaneous quantitative diagnostic tests on whole blood |
| US5156954A (en) * | 1989-03-08 | 1992-10-20 | Cholestech Corporation | Assay device and method using a signal-modulating compound |
| US5171688A (en) * | 1988-08-30 | 1992-12-15 | Cholestech Corporation | Self-corrected assay device |
| JP2514087B2 (ja) * | 1989-01-06 | 1996-07-10 | 富士写真フイルム株式会社 | 総コレステロ―ル分析要素 |
| US5114350A (en) * | 1989-03-08 | 1992-05-19 | Cholestech Corporation | Controlled-volume assay apparatus |
| US5340539A (en) * | 1989-03-16 | 1994-08-23 | Chemtrak, Inc. | Non-instrumented cholesterol assay |
| US5110724A (en) * | 1990-04-02 | 1992-05-05 | Cholestech Corporation | Multi-analyte assay device |
| JPH04200396A (ja) * | 1990-11-30 | 1992-07-21 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | 過酸化水素の酵素学的高感度測定法及びそのための試薬 |
| US5439569A (en) * | 1993-02-12 | 1995-08-08 | Sematech, Inc. | Concentration measurement and control of hydrogen peroxide and acid/base component in a semiconductor bath |
| US5364510A (en) * | 1993-02-12 | 1994-11-15 | Sematech, Inc. | Scheme for bath chemistry measurement and control for improved semiconductor wet processing |
| RU2130189C1 (ru) | 1997-02-20 | 1999-05-10 | Александр Сергеевич Парфенов | Способ определения тканевого холестерина кожи |
| EP1357383B1 (en) * | 2002-04-09 | 2005-11-09 | Cholestech Corporation | High-density lipoprotein assay device and method |
| EP2126587B1 (en) * | 2007-01-09 | 2010-09-29 | Cholestech Corporation | Device and method for measuring ldl-associated cholesterol |
| US9828624B2 (en) | 2013-07-24 | 2017-11-28 | Boston Heart Diagnostics Corporation | Driving patient compliance with therapy |
| WO2022032178A1 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Mate Precision Technologies Inc. | Vise assembly |
| US11878381B2 (en) | 2020-08-06 | 2024-01-23 | Mate Precision Technologies Inc. | Tooling base assembly |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE173761C1 (ja) * | 1956-11-07 | 1960-12-20 | ||
| DE1256919B (de) * | 1961-02-22 | 1967-12-21 | Voith Gmbh J M | Verfahren und Einrichtung zum Bestimmen des Sauerstoffverbrauchs bei Oxydationsvorgaengen, insbesondere zur Bestimmung des biologischen Sauerstoffbedarfs |
| US3607093A (en) * | 1968-02-15 | 1971-09-21 | Schering Corp | Devices for testing biological liquids |
| FR2047147A5 (ja) * | 1969-05-06 | 1971-03-12 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | |
| SE401739B (sv) * | 1971-09-22 | 1978-05-22 | Nat Res Dev | Forfarande for bestemning av kolesterol jemte testsats for dess genomforande |
| JPS4855157A (ja) * | 1971-11-15 | 1973-08-02 | ||
| AR195000A1 (es) * | 1972-05-17 | 1973-08-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Procedimiento para la determinacion de colesterol |
| JPS6134800B2 (ja) * | 1974-03-28 | 1986-08-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | |
| JPS5199565A (ja) * | 1975-04-23 | 1976-09-02 | Citizen Watch Co Ltd |
-
1973
- 1973-05-08 AR AR247906A patent/AR195000A1/es active
- 1973-05-09 DK DK255673A patent/DK145234C/da not_active IP Right Cessation
- 1973-05-14 CH CH163077A patent/CH610108A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-05-15 DD DD170832A patent/DD103324A5/xx unknown
- 1973-05-15 ZA ZA733258A patent/ZA733258B/xx unknown
- 1973-05-15 US US05/360,515 patent/US4212938A/en not_active Expired - Lifetime
- 1973-05-15 HU HUBO1435A patent/HU169171B/hu unknown
- 1973-05-16 IT IT24188/73A patent/IT994863B/it active
- 1973-05-16 SE SE7306915A patent/SE387175B/xx unknown
- 1973-05-16 IL IL42289A patent/IL42289A/en unknown
- 1973-05-16 FI FI1573/73A patent/FI53507C/fi active
- 1973-05-16 YU YU01295/73A patent/YU129573A/xx unknown
- 1973-05-17 JP JP48055157A patent/JPS4962193A/ja active Pending
- 1973-05-17 SU SU731928101A patent/SU664536A3/ru active
- 1973-05-17 MX MX143632A patent/MX153761A/es unknown
- 1973-05-17 CS CS3543A patent/CS163299B2/cs unknown
- 1973-12-07 SU SU731981860A patent/SU637097A3/ru active
-
1976
- 1976-02-24 SU SU762325958A patent/SU622424A3/ru active
- 1976-08-20 JP JP9956576A patent/JPS52106856A/ja active Pending
-
1977
- 1977-03-09 JP JP2586977A patent/JPS53111792A/ja active Pending
- 1977-03-09 JP JP2586877A patent/JPS53111791A/ja active Granted
-
1986
- 1986-05-30 JP JP61127422A patent/JPS62272999A/ja active Pending
- 1986-05-30 JP JP61127423A patent/JPS62275700A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI53507B (ja) | 1978-01-31 |
| IL42289A0 (en) | 1973-07-30 |
| DK145234B (da) | 1982-10-11 |
| JPS52106856A (en) | 1977-09-07 |
| JPS6146115B2 (ja) | 1986-10-13 |
| MX153761A (es) | 1987-01-08 |
| CS163299B2 (ja) | 1975-08-29 |
| ZA733258B (en) | 1974-04-24 |
| DK145234C (da) | 1983-02-28 |
| JPS62272999A (ja) | 1987-11-27 |
| AR195000A1 (es) | 1973-08-30 |
| JPS53111792A (en) | 1978-09-29 |
| DD103324A5 (ja) | 1974-01-12 |
| US4212938A (en) | 1980-07-15 |
| SE387175B (sv) | 1976-08-30 |
| IL42289A (en) | 1976-12-31 |
| FI53507C (fi) | 1978-05-10 |
| JPS53111791A (en) | 1978-09-29 |
| SU637097A3 (ru) | 1978-12-05 |
| SU664536A3 (ru) | 1979-05-25 |
| HU169171B (ja) | 1976-10-28 |
| CH610108A5 (ja) | 1979-03-30 |
| JPS4962193A (ja) | 1974-06-17 |
| JPS62275700A (ja) | 1987-11-30 |
| YU129573A (en) | 1984-04-30 |
| IT994863B (it) | 1975-10-20 |
| SU622424A3 (ru) | 1978-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH059072B2 (ja) | ||
| Roschlau et al. | Cholesterol and esterified cholesterol | |
| JPH0147152B2 (ja) | ||
| JPH0687793B2 (ja) | 酵素酸化によるアナライトの比色定量方法および試剤、およびそのための還元発色性電子受容体 | |
| JPH11504808A (ja) | 糖化タンパク質の測定 | |
| JPH0431676B2 (ja) | ||
| JPS6225040B2 (ja) | ||
| EP0140589B1 (en) | Enzymatic determination of d-3-hydroxybutyric acid or acetoacetic acid, and reagents therefor | |
| JPH042240B2 (ja) | ||
| JPS5935599B2 (ja) | コリンエステラ−ゼ活性測定法 | |
| US5286627A (en) | Method of high-sensitive analysis of bile acid and reagent composition for the analysis | |
| JPS5818077B2 (ja) | グリセリンを測定する方法及び試薬 | |
| JPH0220239B2 (ja) | ||
| JPH03164198A (ja) | 成分の分析法 | |
| JP3034984B2 (ja) | Ｄ−ガラクトースの高感度定量法および定量用組成物 | |
| JPH0772157A (ja) | 糖化蛋白の定量方法およびその定量用キット | |
| JPH0731498A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量用キット及び該キットを使用する定量法 | |
| JPH1118798A (ja) | コレステロールの定量方法及び定量用試薬 | |
| JPH0362400B2 (ja) | ||
| CN112986584A (zh) | 总胆红素测定试剂盒的制作方法 | |
| JP3287879B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JPS59160764A (ja) | 総ビリルビンの定量法 | |
| JPS6139040B2 (ja) | ||
| JP2663257B2 (ja) | 生体成分測定用試薬の安定化方法 | |
| JPH0650997B2 (ja) | コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 |