JPS5941718B2 - 新規物質ｍ−９３３７およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な物質Ｍ−９３３７及びその製造法に関す
る。

レンサ球菌、ブドウ球菌、破傷風菌等によつて排出され
る毒素は溶血反応を起し、種々の疾病を惹起する。

本発明者はこれ、らの毒素を中和する抗毒素物質を見出
すべく種々ｉ研究を行つた結果、本発明者によつて分離
された：ストレプトマイセス属に属する新菌が上記溶血
斥”応を阻止する新規な物質Ｍ−９３３７を産生するこ
とを見出し、本発明を完成した。本発明の物質Ｍ−９３
３７を産生する菌は次のような菌学的性質を有する、。

（１）形態 気菌糸はイースト・麦；芽寒天、チロシン寒天、オート
ミール寒天に良好”に着生し、直径は０．６〜１．０μ
ｍである。

分生子は単純分生子で形態は波状乃至螺旋状で１〜２回
捲いている。螺旋の径は４．０〜５．０１ｔｍである。
胞子は気菌子より形成され、直径０．７〜１．１×１．
１〜１．２μｍの円形乃至楕円形を呈し、竜頭学的には
表面構造は平滑である。胞子の連鎖数は１０以上と推定
される。（２） 各培地における生育状態 （３）生理的性質 １デンプンの加水分解： ２硝酸塩の還元：± ３セルロースの分解： ４脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：＋ ５硫化水素の生成：± ６インドールの生成：＋ ７アンモニアの生成：＋ ８ＶＰテスト：＋ ９カタラーゼ：＋ ［相］ メラニン様色素の生成：＋ ◎ ゼラチンの液化：＋ ＠ 生育の範囲 ＰＨ：５．０〜７．５ 温度：２５〜４００Ｃ ＠ 炭素源の利用 Ｌ−アラビソース、Ｄ−キシロース、Ｄ一グルコース、
Ｄ−フラグドーズ、シェークロース、イノシトール、Ｌ
−ラムノース、ラフイノース、Ｄ−マンニツトを利用す
る。

以上の菌学的諸性状についてＩＳＰ及び Ｂｅｒｇｅｙ５ｓＭａｎｕａｌＯｆＤｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅＢａｃｔｅｒ−１０１０ｇｙ第８版を参照して
検討すると、本菌株はストレプトマイセス属に属し、こ
の属の中のＳ●ＲＯｂｅｆｕｓｃｕｓ，Ｓ．ａｌｂａｄ
ｕｎｃｎｓ及びＳ．ｎａｇａｎｉｓｈ言に近似する。

しかし、Ｓ．ｒＯｂｅｆｕ−Ｓｃｕｓは栄養菌糸が褐色
である点、Ｓ．ａｌｂａｄｕ−Ｎｃｕｓはシェークロー
スの利用がＴである点、胞子にトゲを有する点、また、
Ｓ．ｎａｇａｎｉｓｈｉｉはシェークロースを利用せず
、分子形態が波状乃至螺旋状を呈しない点で本菌株と相
違する。

そこで、本発明者は本菌株を新菌種と認め、ストレプト
マイセス・アンチヘモリテイクス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙ
ｃｅｓａｎｔｉｈａｅｍ］１Ｃ）１ｙｔｉＣＵＳ）と命
名し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
４６５１号（ＦＥＲＭ−Ｐ黒４６５１）として寄託した
。本発明の物質Ｍ−９３３７は、例えばストレプトマイ
セス・アンチヘモリテイクスを培養し、この培養物から
該物質を単離することによつて製造される。

ストレプトマイセス・アンチヘモリテイクスの培養法は
、ストレプトマイセス属に属する菌において一般に採用
されている方法によつてなし得るが、通常は液体培地に
よる振盪培養あるいは深部培養が好ましい。

培養に用いられる培地としては当該菌が利用する栄養源
を含むものであれば、合成培地、半合成培地、天然培地
の何れでもよい。炭素源としては、例えばグルコース、
キシロース、フラグドーズ、ラムノース、アラビノース
、シェークロース、イノシトール、ラフイノース、マン
ニツト、スターチ等が、窒素源としては、例えばペプト
ン、酵母工キズ、肉工キズ、塩化アンモン、大豆粉、Ｌ
−アスパラギン等が使用される。培養中発泡の著しいと
きは、シリコン、大豆油等の植物油、アデカノール等の
鉱物油などの消泡剤を添加するのが好ましい。工業的規
模で行う場合には、上記菌を前培養したものを上記培地
に加えて本培養を行うのが好ましい。

培養温度は２７〜３５℃が好適であり、培養時間は２〜
５日位が適当である。このようにすれば、その培養物中
に物質Ｍ一９３３７が蓄積される。

物質Ｍ−９３３７は通常菌体及び培養液中に存在するの
で、培養物を遠心分離又は淵過等によつて菌体を分離し
、その菌体及び培養Ｐ液から通常の分離法、例えば溶媒
抽出法、沈澱法、イオ７交換樹脂法、ゲルろ過法、吸着
カラムクロマトグラフ法、透析法、電気泳動法等を組合
せて物質Ｍ−９３３７を分離精製する。好ましい分離精
製法としては次の方法が挙げられる。すなわち、培養液
を遠心分離等によつて菌体と淵液に分ける。

次いで、この淵液をＰＨ３付近に調整して沈澱物を採取
し、これを冷アセトン、冷エーテル等で洗浄、あるいは
凍結乾燥し、更にこれをクロロホルムリメタノール（２
：１）混液等で抽出して粗Ｍ−９３３７物質を得る。こ
の粗Ｍ−９３３７物質は、ＤＥＡＥセフアデツクス、シ
リカゲル等を用いるカラムクロマトグラフイ一によつて
精製してＭ−９３３７物質を得る。以上の如くして得ら
れる本発明の物質Ｍ一９３３７は次のような物理化学的
性状を有する。

１性状：中性（１Ｔｆ９／Ｒｎｅ：ＰＨ６〜７）の白色
乃至淡黄色の粉末２元素分析値（約）：Ｃ：５２〜５３
％、Ｈ：７〜８（ｆ）、Ｏ：３９〜４１％３溶解性：ジ
メチルスルホキシド、クロロホルムリメタノール混液に
可溶、水、メタノールにやや可溶ｊ酢酸エチル、クロロ
ホルムに不溶４呈色反応：アンスロン、ヨウ素、モリブ
デン酸アンモニウム一過塩素酸、アニスアルデヒド反応
は陽性、ニンヒドリン、ドラーゲンドルフ反応は陰性５
融点：１７０〜１７５ンＣ（分解） ６紫外線吸収スペクトル：第１図 ７赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：第２図８薄層クロ
マトグラフイ一ｎ−プロパノール一１水（４：１） Ｒｆ＝約０．５ ｎ−ブタノール−酢酸一水（４：１：５）Ｒｆ＝約０．
２８ トルエンーギ酸−ギ酸エチル（５：１：４）Ｒｆ一約０
．０１３ｎ−ブタノールービリジン一水（３：２：１）
Ｒｆ＝約０．５１ｎ−プロパノール−Ｎアンモニア一水 （６：２：１）Ｒｆ＝約０．４１ 検定法： 培養経過ならぴに抽出精製におけるＭ−９３３７物質の
抗溶血素作用はＡ群溶血レンサ球菌の産生したストレフ
トリシンＯをもつて試験する。

すなわち、試験管内に順次希釈したＭ−９３３７物質試
料を１ｄずつ取、り、これにそれぞれストレフトリシン
Ｏ（栄研化学ＫＫ）溶解液０．５Ｔｎｆ．を加え、よく
混合し、３７℃恒温槽中で１５分放置したのち、５％ウ
サギ赤血球浮遊液０．５Ｔｎｅを各試験管に加え、よく
振つて再び３７℃の恒温槽中で４５分反応させ、溶血の
有無を判定する：。次に実施例を挙げて本？明を更に詳
細に説明する。

実施例 １ 振盪フラスコ発酵： （４）種培養 ストレプトマイセス●アンチヘモリテイクス（微工研菌
寄第４６５１号）の凍結乾燥したものを生理食塩水で浮
遊液・とし、寒天斜面培地（グルコース１０ｇ、Ｌ・−
アスパラギン０．５９Ｋ２ＨＰ０４０．５９、ペプトン
２．０９、寒天１５．０９、精製水１０００ｄ，．ｅＨ
６．８〜７．０）に接種し、２７℃で１週間培養する。

菌は旺盛に発育し、多量の胞子を着生ずるので、これを
種とする。（Ｂ）発酵 下記培養基を５００ｍｅ容量の振盪フラスコ（坂ロフラ
スコ）に１００ｄ宛分注したもの１００本に（４）の培
地からかきとつた胞子を２白金耳宛無菌的に接種する。

このフラスコを往復型振盪機により（１１０ストローク
、振幅９？）、３０℃で９６時間培養する。署養基：グ
ルコース２０９、ＮａＮＯ３２．Ｏ９、Ｋ２ＨＰＯ４ｌ
．Ｏ９、ＫＣＩＯ．５ｆｌ，．ＭｇＳＯ４Ｏ、５９、Ｆ
ｅｓＯ４、０．０１９、肉工キズ（ＤｉｆｃＯ社）２．
０９、酵母工キズ（ＤｉｆｃＯ社）２．０ｆ！、ペプト
ン（極東）２．０ｆ１、脱脂大豆（脱脂大豆２０９を精
製水約１０００７ｎｅで１００℃、２０分間抽出し、そ
の淵液を用いる）２０．０ｆ１１アデカノールＬＧ−１
０９（旭電化工業）０．１ｙ、精製水１０００ｍｅ，．
ＰＨ６．８〜７．０。

（０単離精製上で得た培養物を集め、連続遠心分離機に
よつて菌体を除去する。

この上澄約１０１自出３．０に調節し、沈澱物を遠心分
離して集め、凍結乾燥する。この凍結乾燥物にクロロホ
ルムリメタノール（２：１）混液を加えて抽出し、抽出
液を減圧下濃縮乾固すると粗Ｍ−９３３７物質１．１９
が得られる。シリカゲル（タルク社、２３０〜４００メ
ツシユ）４０９をｎ−ヘキサンに浸漬し、直径２０？の
カラム管につめ、エーテル、クロロホルムで担体を洗浄
してカラムを作成する。

このカラムに、粗Ｍ−９３３７物質５００Ｔ１１９を少
量のクロロホルムリメタノール（２：１）混液に溶解し
たものを添着し、クロロホルムリメタノール（２：１）
混液で溶出を行う。夾雑物が溶出された後にＭ−９３３
７物質を含有する活性画分が溶出される。この画分を集
め、減圧下濃縮乾固すると粉末８０Ｔ１ｆを得る。この
粉末をメタノールに溶解し、シリカゲル薄層クロマトグ
ラフイ一に付し、クロロホルムリメタノール：水（６５
：２５：４）混液で展開し、活性部分の単一スポツトを
かきとり、メタノールで抽出し、減圧下溶媒を留去する
とＭ−９３３７物質１０Ｗ１９が得られる。このものの
抗溶血素佃は前記検定法で測定した結果３２．０Ｔ０ｄ
ｄ単位／ｄであつた。

実施例 ２ジヤーフアーメンタ一発酵 囚 種培養 実施例１と同様にして４８時間培養したものを種とする
。

（Ｂ）発酵 ３０１容量のジャーフアーメンタ一４基に夫夫１６１の
下記組成の培養液を仕込み、常法によつて高圧減菌する
。

これに（Ａ）で得た種を１．５％になるように接種し、
培養温度３０℃、攪拌２５０ｒｙｆ／分、無菌空気の流
量は培養液の０．５容／分で、９６時間発酵を行う。培
養液：グルコース２０９、ＮａＮＯ３２９、Ｋ２ＨＰＯ
４ｌ９、ＫＣＩＯ．５ｇ、ＭｇＳＯ４Ｏ．５９、ＦｅＳ
Ｏ４Ｏ．Ｏｌ９、肉工キズ（ＤＩｆｃＯ社）２ｇ、酵母
工キズ（Ｄ！ＦｃＯ社）２ｆ１、ペプトン（極東）２９
、脱脂大豆（実施例１と同じ）２０９、アデカノールＬ
Ｇ−１０９（旭電化工業）０．１９、精製水１０００ｍ
ｅ，．ＰＨ６．８〜７．０。Ｃ）単離精製 上で得た培養液（約６０１）を連続遠心分離機によつて
菌体を除去する。

上澄に１モル塩酸を加えてＰＨ３．Ｏに調整し、沈澱物
を集める。この沈澱物を冷アセトン、次いでエーテルで
洗浄したのち、クロロホルムリメタノール（２：１）混
液で抽出し、抽出液を蒸発乾固して粗Ｍ−９３３７物質
５．１９を得る。ＤＥＡＥセフアデツクスＡ−５０（フ
アルマシア）３．５９をクロロホルムリメタノール：０
．８Ｍ酢酸ソーダ（３０：６０：８）混液に浸漬し、直
径１５？のカラム管につめ、クロロホルムリメタノール
：水（３０：６０：８）で担体を洗浄してカラムを作成
する。

このカラムに、粗Ｍ−９３３７物質１００Ｔ！１９を少
量の８５％エタノールに溶解したものを添着し、クロロ
ホルムリメタノール：０．８Ｍ酢酸ソーダ（３０：６０
：８）混液で溶出する。活性画分を集め、溶媒を留去す
れば粉末１４ηが得られる。この粉末を実施例１と同様
にしてシリカゲル薄層クロマトグラフイ一に付し、Ｍ−
９３３７物質１．９４７Ｔ９を得る。このものの抗溶血
素価は前記検定法で測定した結果３２．０Ｔ０ｄｄ単位
／ｍｌであつた。

′Ｘ！面の簡単な説明 第１図は本発明の物質Ｍ−９３３７の紫外線吸又スペク
トル、第２図は同物質の赤外線吸収スベクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の性状を有する物質Ｍ−９３３７。 （１）性状：中性（１ｍｇ／ｍｌ：ｐＨ６〜７）の白色
   乃至淡黄色の粉末（２）元素分析値（約）：Ｃ：５２〜
   ５３％、Ｈ：７〜８％、Ｏ：３９〜４１％ （３）溶解性：ジメチルスルホキシド、クロロホルム：
   メタノール混液に可溶、水、メタノールにやや可溶、酢
   酸エチル、 クロロホルムに不溶 （４）呈色反応：アンスロン、ヨウ素、モリブデン酸ア
   ンモニウム−過塩素酸、アニスアルデヒド反応は陽性、
   ニンヒ ドリン、ドラーゲンドルフ反応は 陰性 （５）融点：１７０〜１７５℃（分解） （６）紫外線吸収スペクトル：第１図 （７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：第２図（８）
   薄層クロマトグラフィーｎ−プロパノール−水（４：１
   ） Ｒｆ＝約０．５ ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：５）Ｒｆ＝約０．
   ２８ トルエン−ギ酸−ギ酸エチル （５：１：４ ）Ｒｆ＝約０．０１３ ｎ−ブタノール−ピリジン−水 （３：２：１）Ｒｆ＝約０．５１ ｎ−プロパノール−Ｎアンモニア−水 （６：２：１）Ｒｆ＝約０．４１ ２ ストレプトマイセス属に属する物質Ｍ−９３３７生
   産菌を培養し、その培養物から物質Ｍ−９３３７を採取
   することを特徴とする物質Ｍ−９３３７の製造法。 ３ ストレプトマイセス属に属する物質Ｍ−９３３７生
   産菌がストレプトマイセス・アンチヘモリテイクスであ
   る特許請求の範囲第２項記載の物質Ｍ−９３３７の製造
   法。