JPH0361678B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新抗生物質RK−1339B物質及びそ
の製造法に関するものである。 更に詳しくは、本発明はストレプトミセス
（Streptomyces）属に属する抗生物質RK−
1339B物質生産菌を培養して得られる培養物より
新抗生物質RK−1339B物質を分離、採取するこ
とを特徴とする新抗生物質RK−1339B物質の製
造法及び該抗生物質RK−1339B物質に係るもの
であり、前記RK−1339B物質は既知文献未載の
新規物質である。 本発明者らは、吉田肉腫細胞（Yoshida
sarcoma cells）に対して細胞変性作用を示す新
規活性物質の探索を目的として多数の土壌中より
微生物を分離し、その産生する二次代謝物質を分
離、探索した結果、先にストレプトミセス属に属
する微生物の培養液中に文献未載の新規抗生物質
RK−1339を分離、採取したが（特願昭58−
36930号明細書参照）、更に研究を続けた結果、前
記RK−1339物質とは理化学的性質の異なつた新
抗生物質RK−1339B物質が産生、蓄積されるこ
との知見を得、これを分離、採取することに成功
し、本発明を完成するに至つた。 以下に、本発明の新抗生物質RK−1339B物質
及びその製造法について詳述する。 本発明方法において用いる微生物は、新抗生物
質RK−1339B物質の生産能を有するストレプト
ミセス属に属する菌種である。 その一例として、ストレプトミセス・エスピ
ー・RK−1339（Streptomyces sp.RK−1339）
（以下、単に「RK−1339株」という。）と呼称さ
れる微生物が前記の特性を有する新菌株で、本発
明の新抗生物質RK−1339B物質を有利に生産す
るものであり、本発明方法に有効に利用し得る微
生物として挙げられる。 また、前記ストレプトミセス・エスピー．RK
−1339の自然的及び人工的変異株は勿論、ストレ
プトミセス属に属する菌種で、後述の新抗生物質
RK−1339B物質（以下、単に「RK−1339B物
質」という。）の生産能を有する微生物は、すべ
て本発明方法において使用することができる。 RK−1339株は本発明者により、岩手県宮古市
で採取した土壌試料中より発見されたストレプト
ミセス属に属する土壌放線菌であり、工業技術院
微生物工業技術研究所に昭和58年２月26和に寄託
され、その微生物受託番号は、微工研菌寄第6934
号（FERM Ｐ−6934）である。RK−1339株の
菌学的性質は次の通りである。 （） 形態的特徴 RK−1339株はストレプトミセス属に属し、ス
ターチ無機寒天培地、チロシン寒天培地、イース
ト麦芽寒天培地、オートミール寒天培地上で豊富
な気中菌糸の生育と共に良好な発育をする。シユ
ークロース硝酸塩寒天培地、グルコースアスパラ
ギン寒天培地、ペプトンイースト鉄寒天培地上で
の気中菌糸の発育は不良か又はないが、基底菌糸
は良好に生育する。グリセロールアスパラギン寒
天培地、栄養寒天培地上の発育はやや不良で気中
菌糸の発育も充分でない。検査対象の炭素源に対
しては全て生育するがＬ−アラビノースで発育が
若干悪い。気中菌糸は全般に灰白色で、可溶性色
素の生成は少ない。気中菌糸の光学顕微鏡観察で
は分枝は不規則に分枝し、その先端に約1μmの胞
子鎖を形成する。胞子は楕円形状で数十個がつら
なる。スターチ無機寒天培地に生育したものは菌
糸先端がカール状である。 （） 各種培地上での生育状態 特許庁産業別審査基準に従い、各種培地を調製
し、接種後３週間後に観察した結果を次に記載す
る。尚色調の記載に於て（ ）内の記号はデイス
クリプテイプ・カラー・ネームズ・デイクシヨナ
リー（Descriptive Color names dictionary）
第４版の色名記号に従つたものである。 １ シユークロース硝酸塩寒天培地 生 育：普通 気中菌糸の着生：なし 気中菌糸の色：不明 基底菌糸の色：（6ng インデイアンレツド） 可溶性色素：（6ieレツドウツド）生成は少な
い。 ２ グルコース・アスパラギン寒天培地 生 育：やや不良 気中菌糸の着生：不良、わずかに着生がみられ
る。 気中菌糸の色：（3cbサンド） 基底菌糸の色：（3neトパーズ） 可溶性色素：（3gcライトタン）生成は少ない。 ３ グリセロール・アスパラギン寒天培地 生 育：やや不良 気中菌糸の着生：やや不良 気中菌糸の色：（4ecベイジユ） 基底菌糸の色：（3ieキヤメル） 可溶性色素：なし ４ スターチ無機塩寒天培地 生 育：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色：（3cbサンド） 基底菌糸の色：（3eaライナメロンイエロー） 可溶性色素：なし ５ チロシン寒天培地 生 育：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色：（ｃライトグレー） 基底菌糸の色：（3caシエル） 可溶性色素：なし ６ 栄養寒天培地 生 育：やや不良 気中菌糸の着生：なし 気中菌糸の色：不明 基底菌糸の色：（3caシエル） 可溶性色素：なし ７ イースト麦芽寒天培地 生 育：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色：（ｄグレー） 基底菌糸の色：（3ieキヤメル） 可溶性色素：（3icライトアンバー）生成は少な
い。 ８ オートミール寒天培地 生 育：良好 気中菌糸の着生：豊富 気中菌糸の色：（ｂオイスターホワイト） 基底菌糸の色：（3ieキヤメル） 可溶性色素：なし ９ ペプトン・イースト鉄寒天培地 生 育：普通 気中菌糸の着生：なし 気中菌糸の色：不明 基底菌糸の色：（2eaライトメイズ） 可溶性色素：なし （） 炭素源の資化性（プリドハム・ゴツトリ
ーブ寒天培地） １ Ｌ−アラビノース ＋ ２ Ｄ−キシロース ＋＋＋ ３ Ｄ−グルコース ＋＋＋ ４ Ｄ−フラクトース ＋＋＋ ５ シユークロース ＋＋＋ ６ イノシトール ＋＋ ７ Ｌ−ラムノース ＋＋＋ ８ ラフイノース ＋＋＋ ９ Ｄ−マンニツト ＋＋＋ ＋ ：利用する。 ＋＋ ：よく利用する。 ＋＋＋ ：非常によく利用する。 （） 生理的性質 １ 至適生育温度 27−30℃ ２ ゼラチンの液化 （グルコース・ペプトンゼラチン培地上） なし ３ スターチの加水分解 （スターチ寒天培地上） 分解する。 ４ 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 なし ５ メラニン様色素の生成 （チロシン寒天培地及びペプトンイースト鉄
寒天培地上） なし 上記の諸性質を有するRK−1339株を野々村氏
によるジヤーナル・オブ・フアーメンテイシヨ
ン・テクノロジー52巻２号記載の放線菌l.S.P.458
菌種の分類法の記載（キイ・フオア・クラシイフ
イケイシヨン・アンド・アイデンテイフイケイシ
ヨン・オブ・458スペシス・オブ・ザ・ストレプ
トミセス・インクル−デツド・インl.S.P.）（Key
for classification and identification of 458
species of streptomyces included in l.S.P.）に
より探索すると、気中菌糸が、白から灰色を呈
する点、メラノイド色素を生成しない点、菌
の裏が特徴的な色を呈さない点、可溶性色素を
生成しない点、胞子がスムースである点及び
糖をすべて利用する点、等の特徴を有することか
ら、RK−1339株は、ストレプトミセス・スクレ
ロテイアラス（Streptomyces sclerotialus）、ス
トレプトミセス・カルブス（Streptomyces
calvus）、ストレプトミセス・グラミノフアシエ
ンス（Streptomyces graminofaciens）に近縁の
一菌種と考えられる。 次に、本発明を実施するに当つては、ストレプ
トミセス属に属する抗生物質RK−1339B物質生
産菌を、抗生物質を生産する通常の方法で培養す
ることができる。培養の形態は、液体培養でも固
体培養でもよく、工業的に有利に培養するために
は、前記生産菌の胞子懸濁液又は培養液を培地に
接種し、通常撹拌培養を行えばよい。 培地の栄養源としては特に限定されることはな
く、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素
源その他を培地中に含有させることができる。炭
素源としては、殿粉、デキストリン、グリセリ
ン、グルコース、シユークロース、ガラクトー
ス、イノシトール、マンニトールなどが、また窒
素源としてはペプトン、大豆粉、肉エキス、米ぬ
か、〓、尿素、コーンステイープリカー、アンモ
ニウム塩、硝酸塩、その他の有機または無機の窒
素化合物が用いられる。その他、無機塩類、たと
えば、食塩、燐酸塩類、カリウム、カルシウム、
亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加
してもよく、必要に応じて消泡剤として、動・
植・鉱物油等を添加してもよい。培養温度、培養
時間等の培養条件は使用菌の発育に適し、しかも
RK−1339B物質の生産が最高となるような条件
が選ばれる。たとえば培地のPHは４〜９、特に中
性付近がよく、培養の適温は25゜〜35℃程度がよ
い。 しかし、これらの培養組成物、培地の水素イオ
ン濃度、培養温度、撹拌条件などの培養条件は使
用する菌株の種類や、外部の条件などに応じて好
ましい結果が得られるように適宜調節されるべき
であることはいうまでもない。このようにして得
られる培養物からRK−1339B物質を得るには、
代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適
宜に利用し得る。たとえば、RK−1339B物質と
不純物との溶解度差を利用する手段、吸着親和力
の差を利用する手段のいずれも、それぞれ単独
で、または組合わせて、あるいは反覆して使用さ
れる。具体的には、培養液を遠心分離により上清
及び菌体に分ける。上清は酢酸エチル等により抽
出する。一方菌体は、含水アセトン等で撹拌抽出
し、次いで過、減圧濃縮して得た水溶液を酢酸
エチル等で抽出する。両抽出液を合わせ、水洗、
乾燥後、減圧乾固してシロツプ状物質を得る。得
られた粗物質は、更にシリカゲル、セルロース等
への吸着性を利用して、これらの吸着剤を用いた
カラムクロマトグラフイーに付し、活性区分を集
めて減圧濃縮してシロツプ状物質を得る。最終的
な精製は、調製用シリカゲル薄層クロマトグラフ
イーにより行い、活性ピーク部分を集め、濃縮、
抽出、粉末化して純粋なRK−1339B物質を得る
ことができる。 かくして得られたRK−1339B物質の理化学的
及び生物学的性状は次の通りである。 〔RK−1339B物質の理化学的性質及び生物学
的性状〕 (1) 元素分析値 炭素：64.58％，水素：9.37％， 窒素： 1.48％， (2) 分子量（FDマススペクトルによる）925 (3) 融点 147〜155℃ (4) 比旋光度 〔α〕²⁵ _D−16.7゜（ｃ＝0.5，メタノール） (5) 紫外線吸収スペクトル 第１図に示す通り、90％メタノール中及び
1N−NaOH：メタノール（１：９）中では
210nmに肩（ε13800）を示し、 1N−HCl：メタノール（１：９）中では256nm
（ε20400）と215nm（ε15300）に吸収を示す。 (6) 赤外線吸収スペクトル 第２図に示すとおり、臭化カリ錠剤中で次の
主な極大値を示す。 3450，2960，2930，2770，1718，1652，1576，
1452，1435，1380，1360，1305，1268，1228，
1163，1115，1079，1052，1010，998，972，916
cm^-1 (7) 13c−核磁気共鳴スペクトル CD₂Cl₂中で、第３図のスペクトルを示す。 (8) 溶解性 メタノール、クロロホルム、ベンゼン、酢酸
エチルに可溶、水、ヘキサンに難溶 (9) 呈色反応 過マンガン酸カリ、沃素、アニスアルデヒド
−硫酸反応陽性、ニンヒドリン反応陰性である。 (10) 塩基性、中性、酸性の区別 塩基性物質である。 (11) 物質の色 無色粉末 (12) 生物活性 (a) 吉田肉腫細胞（Yoshida sarcoma cells）
に対し0.001〜10mcg／mlの濃度で細胞変性
作用を示す。 (b) 抗菌スペクトル（寒天希釈法による） 以下に示すように、各種かび類、藻類、植物病
原菌及び細菌に対し、生育阻害活性を示す。

【表】 以上のRK−1339B物質の理化学的性質及び生
物学性質を、既知の抗生物質と比較すると、類似
のものとしてオサマイシン（ossamycin）） 〔J.Antibiotics ser.Avol.18，82〜88（1965）〕
が挙げられるが、高速液体クロマトグラフイーを
行うと（担体：Nucleosii5C18，カラムφ6m／
ｍ，流速：１ml／min，圧力：63Kg／cm²，溶媒：
１％ジエチルアミン−ギ酸（PH5.0）：アセトニト
リル：メタノール＝１：６：３），その保持時間
は、RK−1339B物質が14.5分であるのに対し、
オサマイシンは、13.1分であること、又¹³C−
NMR，¹H−NMRスペクトルにおいても明確な
差異が認められるので、RK−1339B物質は、新
規物質であると結論された。RK−1339B物質は、
吉田肉腫細胞に対して細胞変性作用を示すところ
から、抗腫瘍剤としての利用が期待される。又、
各種植物病原性糸状菌及び各種細菌に対して抗菌
作用を示すことから、農業用殺菌剤及び医薬とし
ての利用が期待される。 以下に、本発明を実施例によつて詳述するが、
本発明は、何らこれに限定されるものではない。 実施例 グルコース２％、可溶性殿粉１％、肉エキス１
％、乾燥酵母0.4％、食塩0.2％、第二燐酸カリ
0.005％、大豆粉2.5％よりなる培地に前記RK−
1339株〔微生物受託番号微工研菌寄6934号
（FERM Ｐ−6934）を接種して96時間28℃で振
盪培養した。この培養液400mlをジヤーフアーメ
ンター中の同一培地54に接種して28℃で66時間
通気撹拌培養を行う。 培養終了後、培養液40を遠心分離により菌体
と上清に分ける。上清は酢酸エチル40で一回抽
出する。菌体は20の80％アセトンで撹拌抽出
し、過後、減圧濃縮して得た水溶液を10の酢
酸エチルで抽出する。両酢酸エチル層を合し、水
洗後、減圧乾固して粗シラツプを得る。これをベ
ンゼン−アセトン（10：１）→（５：１）→
（１：１）と溶剤混合比を変えながらシリカゲル
カラムクロマトグラフイーを行う（カラムサイ
ズ：４×40cm）。溶出液を分取し、クロレラに対
する活性区分を集めて減圧濃縮してシラツプを得
る。このものは、調製用シリカゲル薄層を用い
て、クロロホルム−メタノール（６：１）で展開
し、Rf値0.59のクロレラに活性な部分をかき集
め、アセトンで抽出した。これを濃縮し、水に懸
濁した後、凍結乾燥するとRK−1339B物質50mg
が白色粉末として得られた。この粉末は、少量の
酢酸に溶かし、水を加えて振ることにより脱塩し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、RK−1339B物質のメタノール中の
紫外線吸収スペクトルを示す図面であり、第２図
は、RK−1339B物質のKBr錠剤中の赤外線吸収
スペクトルを示す図面であり、第３図は、RK−
1339B物質のCD₂Cl₂中の¹³C−核磁気共鳴スペク
トルを示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質及び生物学的性質を有す
   ることを特徴とする新抗生物質RK−1339B物質。 (1) 元素分析値 炭素：64.58％、水素：9.37％、 窒素： 1.48％ (2) 分子量（FDマススペクトルによる）925 (3) 融点 147〜155℃ (4) 比旋光度 〔α〕²⁵ _D−16.7゜（ｃ＝0.5、メタノール） (5) 紫外線吸収スペクトル 90％メタノール中及び1N−NaOH：メタノー
   ル（１：９）中では、210nmに肩（ε13800）を示
   し、1N−HCl：メタノール（１：９）中では
   256nm（ε20400）と215nm（ε15300）に吸収を示
   す。 (6) 赤外線吸収スペクトル （臭化カリ錠剤中の主な極大値） 3450，2960，2930，2770，1718，1652，1576，
   1452，1435，1380，1360，1305，1268，1228，
   1163，1115，1079，1052，1010，998，972，916
   （cm^-1） (7) 溶解性 メタノール、酢酸エチル、クロロホルム、ベン
   ゼンに可溶、水、ヘキサンに難溶 (8) 呈色反応 過マンガン酸カリ、沃素、アニスアルデヒド−
   硫酸反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰性であ
   る。 (9) 塩基性、酸性、中性の区別 塩基性物質 (10) 物質の色 無色粉末 (11) 生物活性 吉田肉腫細胞に対し、細胞変性作用を示し、各
   種かび類，植物病原菌，藻類及び細菌に対し生育
   阻害作用を示す。 ２ ストレプトミセス（Streptomyces）属に属
   する抗生物質RK−1339B物質生産菌を培養し、
   その培養物から新抗生物質RK−1339B物質を分
   離、採取することを特徴とする新抗生物質RK−
   1339B物質の製造法。 ３ ストレプトミセス（Streptomyces）属に属
   する抗生物質RK−1339物質生産菌がストレプト
   ミセス・エスピー・RK−1339（Streptomyces
   sp.RK−1339）である特許請求の範囲第２項記載
   の製造法。