JPS5945893A - 光学活性を有するジヒドロオキソホロンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は３，５．５−）ジメチル−２−シクロヘキセン
−１，４−ジオン（通称名オキソホロン）の微生物変換
による光学活性な（６Ｒ）−２，２，６−）リフチル−
１，４−ンクロへキサジオン構造式（１）（通称名　ジ
ヒドロオキソホロン）の製造方法に関するものである。

（１） 近年、たばこの嗜好は喫味が軽く、香気の豊かな製品へ
と移りつつあるが、これに伴って製品たばこに配合され
る原料葉たばこは喫味が軽くニコチン含量の少ないもの
が多く使用される１、ようになってきた。しかしながら
、このような原料葉たばこは、一般に香気に乏しく、う
ま味に欠けるために、種々の香味料を添加して製品の香
喫味の向上をはかることが必要とされる。

光学活性を有するジヒドロオキソホロンは葉たばこに含
まれる香味成分の一つであることが知られている。〔タ
バコサイエンス１ｊ巻１０７頁１９７２年〕また本化合
物は、ゼアキサンチンやクリプトキサンチン等のヒドロ
キシカロチノイドの合成出発原料となる。〔ヘルベテイ
力・ケミ力・アクタ５９巻１８３２頁１９７６年〕本発
明は光学活性を有するジヒドロオキソホロンの新規かつ
すぐれた製造方法を提供することを目的とする。

従来、光学活性なジヒドロオキソホロンの製造方法に関
しては、オキソホロンをパン酵母によって微生物変換す
るバルク・ボグトの方法が知られている。（特開昭５１
−８２７８９号）しかしこの方法では、培地１を当り湿
菌重で５０１Ｆという大量のパン酵母を使用する必要が
ある。また、最大の変換率を得るためには、３２時間と
いう比較的長時間を要し、その変換率は約８０％である
。さらに、比較的長い時間の培養に伴ない副変換物も増
加し、本化合物の収率は６８％程度にすぎない。

一般に化学反応において、反応温度が１０℃上利用し、
発酵法による香料化合物を製造する研究を行なった。そ
の結果ある種の高温菌が、オキソホロンを従来の公知の
菌に比べて鎧時間で変換し、かつ、高い変換収率でジヒ
ドロオキソホロンを生成することを見出し本発明をなす
にいたった。

本発明は、サーモモノスポラ風に属する菌を接種した培
養液にオキソホロンを添加し、？、１続き培養して得ら
れる変換物より、光学活性なジヒドロオキソホロンを分
離することを特徴とするオキソホロンの微生物変換によ
るジヒドロオキソホロンの製造法である。

つぎに本発明について詳細に説明する。

微生物変換の基質として用いるオキソホロンは通常の化
学工衆的合成品で十分であるが、純度は高いほど望まし
い。

本発明で使用される篭生物としては、サーモモノスポラ
Ｍ　Ｅ　Ｆｉｔする高温菌でサーモモノスポラ・クルバ
ータＩＦ０１２３８４．サーモモノスポラ・フスカＡＴ
ＣＣ２７７３０等である。なおＩＦＯは、日本微生物株
保存連盟に属する機関で財団法人醗酵研究所であり、Ａ
ＴＣＣはアメリカン・タイプ番カルチャー・コレクショ
ンである。

つぎに本発明の方法を順を追って説明する。

菌の胞子を以下の様な方法で培養して種菌とする。固形
培地に４６〜４７℃で静置培養し、十分胞子を形成させ
る。通常、接種後４日目頃より菌叢上−面に胞子の形成
が紹められる。一般には、培養６〜８日目の胞子が望ま
しい。

この種菌をさらに液体培地に接種し、４８〜５３℃望ま
しくは５０〜５２℃にて振とうまたは通気かく拌培養を
行なう。

これらの培養に用いる、固形及び液体培地は、　５− 肝臓浸出液を含む培地が望ましい。一般に高温菌は栄養
要求性が厳しく、培養困難なものが多い。本発明者らは
、種々検討の結果、肝臓浸出液を用いる場合には、菌が
、極めて良好な生育を示すことを見出した。

これらの培地は１２１℃に加熱して無菌化した後使用す
る。

次に菌体の生育の対数増殖期の初期に、オキソホロンを
添加し、上記の温度でひき続き振とりまたは通気かく拌
培養を行なう。この操作によって、オキソホロンは添加
後約１６時間という短い培養時間でジヒドロオキソホロ
ンに変換される。

変換基質としてのオキソホロンの添加量は、通常培養液
１を当り１〜１．５Ｆが適当である。これは、菌体湿重
１ｆ当り基質０．８５〜１．２５９に相当する。

オキソホロン添加後の培養液中において、ジヒドロオキ
ソホロンの生成が十分性なわれているか否かは、例えば
次のような操作によって迅　６− 速に知ることができる。

すなわち、変換が進行中のフラスコまたは培養槽より３
〜５　ｍＡの菌体を含む培養液を採取し、ｐＨ３，０以
下にして酢酸エチル等の有１機溶媒で抽出し、直ちにガ
スクロマトグラフィーにて分析する。り四マドグラムパ
ターンは、変損培養の賭争件（菌株、温度９通気、かく
拌条件等）を一定にした場合、はとんど同じ経過をたど
る。

したがって、予め一定条件下での変換状況を水素イオン
濃度、溶存酵素、り四マドグラム・パターン等により把
握しておけば、容易に変換条件のどの時点で培養を中止
すれば、ジヒドロオに変換し終えた際の典型的なガスク
ロマトグラムを示す。（１）は溶媒、（２）はオキソホ
ロン、（３）はジヒドロオキソホロンの各ピークを示す
。

威勢も生じる。よって分離・採取を行なう必要ロマトグ
ラフ（日立０６３型、　Ｆ’ＩＤ検出器つき）にポリエ
チレングリコール６０００をコーティングした長さ３ｏ
ｍ、直ｆｆ０．２８鰭のキャピラリーカラムを装着し、
カラム温度１５０℃で、キャリアーガスとしてヘリウム
を１　ｍ２１分の流速で流しつつ、前記の培養液の酢酸
エチル抽出液１μｔを試料として注入し測定した。

次にオキソホロンの交換生成物より、ジヒドロオキソホ
ロンを分離する方法について述べる。

変換培養物を常法により酢酸エチル等の有機溶媒で抽出
し、抽出液を５％炭酸水素ナトリウム溶液で２度洗浄し
、さらに蒸留水で一度洗浄する。この抽出液に直ちに、
無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧下で溶媒を留
去する。得られた中性区分を該当区の１０倍重量以上の
シリカゲルを吸着剤とするカラムにかけ、ｎ−ヘキサン
、ベンゼン、クロルホルム、酢酸工讐ル等の混合液によ
り溶出を行なう。溶出液をフラクションコレクターで分
取し、各分取管中の溶出液を先に記した条件でガスクロ
マトグラフィーを行なって、ジヒドロオキソホロンを純
品として含む分取管より溶媒を留去し、本化合物を得る
。

次に本発明の利点を列記する。

１、　菌体型当りの変換活性が高い。すなわち、公知の
パン酵母の場合は湿菌重１を当りの変換しうる基質量は
、約０．３ｆに過ぎないのに対し、本発明によれば、湿
菌重１ｆ当り基質０．８５〜１．２５１Ｆを変換しうる
。

２、　変換に要する時間が、公知のパン酵母を使用する
場合約３２時間であるのに比較して１６時間と短い。

３、　基質変換率が高く、本化合物の収率も９２９− グと高い。また、副変換物の生成もほとんどみられない
。

次に実施例を掲げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ 重肝２５ｆ相当）、−ｌグＬコース３１塩化ナトリウム
３　ｔ、グリセリン１５入水道水１ｔ（ｐＨニア、ｏ）
からなる組成の培地を用いた。斜面培地としては、上記
の培地に寒天を３％（ｗｔ／Ｖｏ７　）加えついで、上
記組成の液体培地１ｔを入れた３を容王角フラスコを、
１２１℃で滅菌後、前記菌株の胞子を、その濃度が培地
１　ｍＡ当り約２万個になるように接種し回転振とう機
にかけ、１６０ｒｐｍ　、　５１℃で培養した。培養開
始後６時間で、１０− 生育は、対数増殖期に達した。このときオキソホロン１
２を添加し、さらに５１℃にて培養を１６時間行なった
。このとき、菌体の乾重は１．２２であった。

この培養物より、ジヒドロオキソホロンの単離を行なっ
た。すなわち該培養物を酢酸エチル２５０　ｍＡで抽出
した。次いで、抽出液を５％炭炭酸水ナナトリウム溶液
４０ｔで２回洗浄し、さらに純水で１回洗浄した。無水
硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧下４０℃で留去し
、中性区分９６０■を得た。

ついで１０２のシリカゲル（和光純薬９２００メツシュ
）を用いてカラムを作り、中性区分をｎ−ヘキサン：酢
酸エチル（９５：５．Ｖ／Ｖ）で溶出し、５０ｍｔずつ
分取した。ジヒドロオキソホロンは２〜７番目の分取管
中にほとんど純品として溶出した。これらを合し、溶媒
を留失し、白色粉状物質９２０ｍｇを得た。得られた化
合物のスペクトロメトリーの結果は以下のようであった
。

分子式：　Ｃ，Ｈ，４０２（高分解能質量分析による）
質量スペクトルｍ／ｚ　　１５４（Ｍ”）、１３９．１
１２核磁気共鳴スペクトル：’ｉ：［（−ＮＭＲδｎｐ
ｐｍ（ＣＤＣ４８）　　１．１１（３Ｈ，ｓ、−ＣＨ８
）１．１７（３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　２．’ＩＩ−Ｔｚ　、
−ＣＨ５）　１．１９（３Ｈ，ｓ　、−ＣＨ５）他の５
個の水素に相当するシグナルは２．０〜３．０の間に極
めて複雑なシグナルを与えるっ赤外吸収スペクトル：１
７１０ｃｒｎ　（非共役カルボニル） 紫外吸収スペクトル；吸収なし 旋光度：〔α：ｌ、、＝−２６４．１°（Ｃ＝０．３９
６％メタノール〕これは光学純度性９８％に相当する。

以上の結果は、光学活性なジヒドロオキソホロンのスペ
クトル　データーとよく一致した。

〔ヘルベテイカ　ケミ力　アクタ　５９巻１８３２頁　
１９７６年〕　したがって得られた化合物は前記構造式
（１）を持つ化合物であることが確認された。

実施例２ 用いる菌をサーモモノスポラ・クルバータのかわりにサ
ーモモノスポラ・フスカ（ＡＴＣＣ２７７３０）とし、
他は実施例１とまったく同様に培養を行ない、さらに変
換安打なった。オキソホロンの添加１１ｙに対し得られ
た光学活性なジヒドロオキソホロンの量は８４０■であ
った；、また、その光学純度は９８％であった。

実施例３ 実施例１と全く同様に操作して菌を１ｔの培地に培養し
、オキソホロン１ｆを最初に添加した後６時間及び１２
時間経過後に各々０．５１のオキソホロンを添加した。

さらに５１℃の温度で引き続き１６時間培養して培養を
終了した。ついで、実施例１と同様の方法でジヒドロオ
キソホロンを単離し、実施例１と同様のスペクトルデー
ターを示す光学活性な本化合物１．８１を得た。

以上詳細に説明したように、本発明は、高温菌を用い、
高い培養温度下で変換反応を行なわせる点に特徴を有す
る。本発明によれば、比較的短い時間で、かつ容易にジ
ヒドロオキソホロンを製造することができる。また、変
換反応は、１３− 極めて選択的でありかつ高収率である。さらにパ；で よりジヒドロオキソホロンに変換した培養液よ゛り抽出
した試別のガスクロマトダラムである。

１は溶媒のピーク、２はオキソホロンのピーク、３はジ
ヒドロオキソホロンのピークを示す。

出　願　人　日本専売公社 １４−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　サーモモノスポラ属から選ばれる菌を接種した培養
   液にオキソホロンを添加し、ひきつづき培養して得られ
   る変換培養物より光学活性なジヒドロオキソホロンを分
   離採取することを特徴とする光学活骨なジヒドロオキソ
   ホロンの製造法。 ２　サーモモノスポラ属に属する菌がサーモモノスポラ
   ・クルバータである特許請求の範囲第１項記載の光学活
   性を有するジヒドロオキソホロンの製造法。 ３　サーモモノスポラ属に属する菌がサーモモノスポラ
   ｅフスカである特許請求の範囲第１項記載の光学活性を
   有するジヒドロオキソホロンの製造法。 ４　オキソホロンの添加を間けつ的に行なう特許請求の
   範囲第１項記載の光学活性を有するジヒドロオキソホロ
   ンの製造法。