JPS5929239B2 - 光学活性を有するジヒドロオキソホロンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は３，５．５−）リフチル−２−シクロヘキセン
−１，４−ジオン（通称名オキソホロン）の微生物変換
による光学活性な（６Ｒ）−２，２゜６−ドリメチルー
１，４−シクロヘキサジオン構造式（１）（通称名ジヒ
ドロオキソホロン）の製造方法に関するものである。

近年、たばこの嗜好は喫味が軽く、香気の豊かな製品へ
と移りつつあるが、これに伴って製品たばこに配合され
ろ原料葉たばこは喫味が軽くニコチン含量の少ないもの
が多く使用されろようになってきた。

しかしながら、このような原料葉たばこは、一般に香気
に乏しく、うま味に欠けろために、種々の香味料を添加
して製品の香喫味の向上をはかることが必要とされろ。

光学活性を有するジヒドロオキソホロンは葉たばこに含
まれる香未成分の一つであることが知られている。

〔タバコナイエンス１６巻１０７頁１９７２年〕また本
化合物は、ゼアキサンチンやクリプトキサンチン等のヒ
ドロキシカロチノイドの合成出発原料となる。

〔ヘルベテイカ・ケミ力・アクタ５９巻１８３２頁１９
７６年〕 本発明は光学活性を有するジヒドロオキソホロンの新規
かつすぐれた製造方法を提供することを目的とする。

従来、光学活性なジヒドロオキソホロンの製造方法に関
しては、オキソホロンをパン酵母によって微生物変換す
るパルタ・ボグトの方法が知られている。

（特開昭５１−８２７８９号）しかしこの方法では、培
地１／ｌり湿菌重でＦｌ （１９）−いうす帯のパン酵
母を使用する必要があろ。

また、最大の変換率を得るためには、３２時間という比
較的長時間を要し、その変換率は約８０係である。

さらに、比較的長い時間の培養に伴ない副変換物も増加
し、本化合物の収率は６８係程度にすぎない。

一般に化学反応において、反応温度が１０℃上昇すると
、反応速度がおよそ２倍になることに着目し、本発明者
らは、従来使われてきた常温菌とはまったく異なる高温
菌の物質変換作用を利用し、発酵法による香料化合物を
製造する研究を行なった。

その結果ある種の高温菌が、オキソホロンを従来の公知
の菌に比べて短時間で変換し、かつ、高い変換収率でジ
ヒドロオキソホロンを生成スることを見出し本発明をな
すにいたった。

本発明は、サーモモノスポラ属に属する菌を接種した培
養液にオキソホロンを添加し、ひき続き培養して得られ
る変換物より、光学活性なジヒドロオキソホロンを分離
することを特徴とするオキソホロンの微生物変換による
ジヒドロオキソホロンの製造法である。

つぎに本発明について詳細に説明する。

微生物変換の基質として用いろオキソホロンは通常の化
学工業的合成品で十分であるが、純度は高いほど望まし
い。

本発明で使用されろ微生物としては、サーモモノスポラ
属に属する高温菌でサーモモノスポラ・クルバータＩＦ
０１２３８４．サーモモノスポラ・アスカＡＴＣＣ２フ
フ３０等である。

なおＩＦＯは、日本微生物株保存連盟に属する機関で財
団法人醗酵研究所であり、ＡＴＣＣはアメリカン・タイ
プ°カルチャー・コレクションである。

つぎに本発明の方法を順を追って説明する。

菌の胞子を以下の様な方法で培養して種菌とする。

固形培地に４６〜４７℃で静置培養し、十分胞子を形成
させろ。

通常、接種後４日目頃より菌叢上一面に胞子の形成が望
められる。

一般には、培養６〜８日目の胞子が望ましい。

この種菌をさらに液体培地に接種し、４８〜５３℃望ま
しくは５０〜５２℃にて振とりまたは通気かく拌培養を
行なう。

これらの培養に用いろ、固形及び液体培地は、肝蔵浸出
液を含む培地が望ましい。

一般に高温菌は栄養要求性が厳しく、培養困難なものが
多い。

本発明者らは、種々検討の結果、肝蔵浸出液を用いる場
合には、菌が、極めて良好な生育を示すことを見出した
。

これらの培地は１２１℃に加熱して無菌化した後使用す
る。

次に菌体の生育の対数増殖期の初期に、オキソホロンを
添加し、上記の温度でひき続き振とうまたは通気かく拌
培養を行なう。

この操作によって、オキソホロンは添加後約１６時間と
いう短い培養時間でジヒドロオキソホロンに変換されろ
。

変換基質としてのオキソホロンの添加量は、通常培養液
１を当り１〜１．５１が適当である。

これは、菌体湿重１１当り基質０．８５〜１．２５ｆに
相当する。

オキソホロン添加後の培養液中において、ジヒドロオキ
ソホロンの生成が十分性なわれているか否かは、例えば
次のような操作によって迅速に知ることができる。

すなわち、変換が進行中のフラスコまたは培養槽より３
〜５−の菌体を含む培養液を採取し、ｐ Ｈ３，０以下
にして酢酸エチル等の有機溶媒で抽出し、直ちにガスク
ロマトグラフィーにて分析する。

クロマトグラムパターンは、変換培養の諸条件（菌体、
温度、通気、かく拌条件等）を一定にした場合、はとん
ど同じ経過をたどる。

したがって、予め一定条件下での変換状況を水素イオン
濃度、溶存酸素、クロマトグラム・パターン等により把
握しておけば、容易に変換条件のどの時点で培養を中止
すれば、ジヒドロオキソホロンが最大の収率で得られる
かを知ることができる。

第１図にオキソホロン、第２図にオキソホロンを本発明
により、ジヒドロオキソホロンに変換し終えた際の典型
的なガスクロマトグラフを示す。

１は溶媒、２はオキソホロン、３はジヒドロオキソホロ
ンの各ピークを示す。

第２図から明らかなように、本発明によれば、オキソホ
ロンはその大部分が、ジヒドロオキソホロンに変換され
るが、同時に若干の副生成物も生じろ。

よって分離・採取を行なう必要がある。なお、第１図お
よび第２図のクロマトグラムは次のような条件で得られ
たものである。

すなわち、ガスクロマトグラフ（日立０６３型、ＦＩＤ
検出器つき）にポリエチレングリコール６０００をコー
ティングした長さ３０ｍｔ直径０．２８ｒｒａＦｌのキ
ャピラリーカラムを装着し、カラム温度１５０℃で、キ
ャリアーガスとしてヘリウムを１ｍ／／分の流速で流し
つつ、前記の培養液の酢酸エチル抽出液１μｔを試料と
して注入し測定した。

次にオキソホロンの交換生成物より、ジヒドロオキソホ
ロンを分離する方法について述べる。

変換培養物を常法により酢酸エチル等の有機溶媒で抽出
し、抽出液を５係炭酸水素ナトリウム溶液で２度洗浄し
、さらに蒸留水で一度洗浄する。

この抽出液に直ちに、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水
し、減圧下で溶媒を留去する。

得られた中性区分を該当区の１０倍重量以上のシリカゲ
ルを吸着剤とするカラムにかけ、ｎ−ヘキサン、ベンゼ
ン、クロロホルム、酢酸エチル等の混合液により溶出を
行なう。

溶出液をフラクションコレクターで分取し、各分取管中
の溶出液を先に記した条件でガスクロマトグラフィーを
行なって、ジヒドロオキソホロンを純品として含む分取
管より溶媒を留去し、本化合物を得る。

次に本発明のオ聰を列記する。

１ 菌体型箔りの変換活性が高い。

すなわち、公知のパン酵母の場合は湿菌重１ｆ？当りの
変換しう石基質量は、約０．３１に過ぎないのに対し、
本発明によれば、湿菌重Ｉｆ？当り基質０．８５〜１．
２５Ｓ’ を変換しりろ。

２ 変換に要する時間が、公知のパン酵母を使用する場
合約３２時間であるのに比較して１６時間と短い。

３ 基質変換率が高く、本化合物の収率も９２％と高い
。

また、副変換物の生成もほとんどみられない。

次に実施例を掲げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例 １ 本発明に用いる液体培地の一例として酵母エキス５グ、
トリプトン１０１、豚肝浸出液１５０ｍ（湿重肝２５グ
相当）、グルコース３ｆ塩化ナトリウム３１、グリセリ
ン１５ｆ１水道水１ｔ（ｐＨ： ７．０ ）からなる組
成の培地を用いた。

斜面培地としては、上記の培地に寒天を３％（ｗｔ／Ｖ
ｏ／、）加えたものを用いた。

この斜面培地に高温菌サーモモノスポラ・クルバータ（
ＩＦＯ＝１２３８４）を１白金耳接種し、４６℃で６日
間静置培養し胞子を形成させた。

ついで、上記組成の液体培地１ｔを入れた３を容三角フ
ラスコを、１２１℃で滅菌後、前記菌株の胞子を、その
濃度が培地１ｒｎｌ当り約２万個になるように接種し回
転振とう機にかけ、１６０ ｒｐｍｓ５１℃で培養した
。

培養開始後６時間で、生育は、対数増殖期に達した。

このときオキソホロン１グを添加し、さらに５１℃にて
培養を１６時間行なった。

このとき、菌体の乾重は１．２１であった。この培養物
ヨリ、ジヒドロオキソホロンの単離を行なった。

すなわち該培養物を酢酸エチル２５〇−で抽出した。

次いで、抽出液を５係炭酸水素ナトリウム溶液４０−で
２回洗浄し、さらに純水で１回洗浄した。

無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を減圧下４０℃で留
去し、中性区分９６０ｍｒを得た。

ついてｌ０ｆｉのシリカゲル（和光紬薬製２００メツシ
ュ）を用いてカラムを作り、中性区分をｎ−ヘキサン：
＃酸エチル（９５：５．Ｖ／Ｖ）で溶出し、５０−ずつ
分取した。

ジヒドロオキソホロンは２〜７番目の分取管中にほとん
ど純品として溶出した。

これらを合し、溶媒を留去し、白色粉状物質９２０ ｍ
ｆを得た。

得られた化合物のスペクトロメトリーの結果は以下のよ
うであった。

分子式： Ｃ９Ｈ１４０２（高分解能質量分析による）
質量スペクトルｍ／ｚ １５４ （Ｍ”） 、 １３９
、１１２核磁気共鳴スペクトル： ＩＨ−ＮＭＲδＨ
ｐＰｍ（ＣＤＣ６３）１．１１（３Ｈ，ｓ、−ＣＨ５）
１．１７（３Ｈ。

ｄ 、 Ｊ＝２．９Ｈｚ、−ＣＨ３） １．１９（３Ｈ
、ｓ 、 −ＣＨ３）他の５個の水素に相当するシグナ
ルは２．０〜３．０の間に極めて複雑なシグナルを与え
ろ。

赤外吸収スペクトル： １７１０ｃｍ−’ （非共役
カルボニル） 紫外吸収スペクトル；吸収なし 旋光度：〔α〕Ｄニー２６４．１°（Ｃ＝０．３９６係
メタノール）これは光学純度約９８係に相当する。

以上の結果は、光学活性なジヒドロオキソホロンのスペ
クトル データーとよ＜ 一致した。

〔ヘルベテイカ ケミ力 アクタ ５９巻１８３２頁１
９′７６年〕したがって得られた化合物は前記構造式（
１）を持つ化合物であることが確認された。

実施例 ２ 用いろ菌をサーモモノスポラ・クルバータのかわりにサ
ーモモノスポラ・フスカ（ＡＴＣＣ２７７３０）とし、
他は実施例１とまったく同様に培養を行ない、さらに変
換を行なった。

オキソホロンの添加量１１に対し得られた光学活性なジ
ヒドロオキソホロンの量は８４０ｍ？であった。

また、その光学純度は９８係でｈつだ。

実施例 ３ 実施例１と全く同様に操作して菌をｌｔの培地に培養し
、オキソホロン１グを最初に添加した後６時間及び１２
時間経過後に各々０．５１のオキソホロンを添加した。

さらに５１℃の温度で引き続き１６時間培養して培養を
終了した。

ついで、実施例１と同様の方法でジヒドロオキソホロン
を単離し、実施例１と同様のスペクトルデーターを示す
光学活性な本化合物１．８１を得た。

以上詳細に説明したように、本発明は、高温菌を用い、
高い培養温度下で変換反応を行なわせろ点に特徴を有す
る。

本発明によれば、比較的短い時間で、かつ容易にジヒド
ロオキソホロンを製造することができる。

また、変換反応は、極めて選択的でありかつ高収率であ
る。

さらに光学収率も極めて高い。

【図面の簡単な説明】

第１図は、オキソホロンのガスクロマトグラムである。 第２図は、オキソホロンを本発明によりジヒドロオキソ
ホロンに変換した培養液より抽出した試料のガスクロマ
トグラムである。 １は溶媒のピーク、２はオキソホロンのピーク３はジヒ
ドロオキソホロンのピークを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サーモモノスポラ属から選ばれろ菌を接種した培養
   液にオキソホロンを添加し、ひきつづき培養して得られ
   ろ変換培養物より光学活性なジヒドロオキソホロンを分
   離採取することを特徴とする光学活性なジヒドロオキソ
   ホロンの製造法。 ２ サーモモノスポラ属に属する菌がサーモモノスポラ
   、クルバータである特許請求の範囲第１項記載の光学活
   性を有するジヒドロオキソホロンの製造法。 ３ サーモモノスポラ属に属する菌がサーモモノスポラ
   ・フスカである特許請求の範囲第１項記載の光学活性を
   有するジヒドロオキソホロンの製造法。 ４ オキソホロンの添加を間けつ的に行なう特許請求の
   範囲第１項記載の光学活性を有するジヒドロオキソホロ
   ンの製造法。