JPS5945943B2 - 抗体検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は水性試料中の抗体の存在を検出する方法に関す
る。

この抗体はある抗原に特異的に指向されたものである。
生物学的試料中の特異的抗体の検出および定量のための
数種の異つた方法がすでに知られている。

これらの方法の一つにおいては、ガラス、重合体、金属
または同様物質の抗原でコーティングされた表面が使用
される。この表面上にコーティングさ１ れた抗原に対
して特異的に指向された抗体を含有すると思われる試料
をこの表面に適用し、その後抗体−抗原結合物の形成を
種種の方法によつて検出することができる。すなわち、
前記試料に加えられる放射性元素でラベルした抗体は、
試料中の１ 抗体中の抗体と拮抗しうるので次いで抗原
表面に特異的に結合された放射能を測定する。このよう
な方法における欠点は時間の浪費、高価かつ複雑な装置
の必要性およびまた放射性物質を使用する際の健康上の
危険性である。抗体−抗原結合物の検出方法としてはさ
らに、ｌ）前記表面を水蒸気にさらした場合の湿潤性の
増加を観察する方法、２）蛋白染料（例えばクマシー、
ブリリアント、ブルーＲ）で染色する方法および３）特
定の反射表面上の干渉色変化を観察する方法等が提案さ
れている〔アダムス外著、ジャーナル、オブ、イムノロ
ジカル、メソツズ（１９７３）第２２７〜２３２頁参照
〕。

これらの方法に関する一つの共通の欠点は、高蛋白濃度
の試料例えば未希釈血清が使用される場合には偽陽性反
応を防止し得ないことにより、それらが非特異的反応を
与えうるということである。そのうえ、感染症を診断す
る場合に非常に興味のある反応特異抗体に関するその免
疫グロブリン群への帰属の分析が不可能である。驚くべ
きことに、従来行なわれていた検出法の不利な点が本発
明によつて克服されうることがここに証明された。

本発明は、ある抗原に特異的に指向されている抗体１の
水性試料中の存在を検出する方法に関するが、この方法
によれば、前記の試料を、該抗原で被覆した平滑な、好
ましくは平面状または管状の表面と接触させて抗体１を
前記表面上の抗原と結合させ、このようにして該表面上
で結合された抗体１を検出するのであるが、前記の方法
は、抗体を検出するための前記表面を、抗体、好ましく
はある種の免疫グロブリン群に属し、そして好ましくは
非抗原結合性構造を有する抗体に特異的に結合する能力
を有する生体高分子が直接結合している水不溶性小粒子
の懸濁液と接触させ、それによつて前記粒子は抗体が特
異的に結合され、裸眼で明確に見ることのできる粒子の
コーテイングが形成されている表面部分上に吸着される
ことを特徴とする。

本明細書において「抗原」なる表現はハプテンをも包含
する。

平滑表面上の抗原のコーテイングは、抗原（ハプテン）
と該表面上の反応性基との間の吸着力または共有結合に
より、恐らく２官能性試薬の影響下に生成され得る。

表面・＼の抗原の結合を容易にするある種の物質でコー
テイングされ得る、ガラス、重合体、金属または同様の
物質の平滑な表面′を反応表面として使用することがで
きる。

この表面はまた、まずその抗原に特異的に指向された抗
体の層で被覆し、次いでこの抗体層上に抗原を吸着させ
てもよい。この表面は好ましくは表面状または管状であ
りうるが、あるいは小形のカツプまたは棒状であつても
よい。表面物質はまた所望により、紙、重合体、ガラス
その他の材料上の重合体、金属その他の薄い箔で構成さ
れていてもよい。薄い箔状の反応表面の利点はそれらが
抗原で被覆された表面の保存および輸送を可能ならしめ
、抗原を起り得る変性から例えば適当な液体の薄いフイ
ルムによつて保護することができることである。本明細
書中、表面上の抗原の「コーテイング」という表現は抗
原が表面上に、水性試料の接触時にその反応を妨げる程
度には該表面から溶出されないように固定されているこ
とを意味する。ガラス、重合体、金属または同様な物質
の表面に吸着または共有結合され得る抗原としては、蛋
白、糖蛋白、脂肪蛋白例えば血清アルブミン、免疫グロ
ブリン、ポリペプチド性ホルモンを含むその他の血漿蛋
白、細菌毒素およびその他の微生物ポリペプチド等を包
含するポリペプチド抗原、多糖類抗原例えば細菌および
その他の起源からのデキストラン、その他のカプセル多
糖類、リポ多糖類、リポ多糖類蛋白コンプレツクス、核
酸例えばＤＮＡおよびＲＮＡｌハプテン例えば、所望に
より表面への吸着を改良するために高分子物質に結合さ
せた低分子量ホルモンおよび医薬品、ウイルス抗原例え
ば肝炎Ｂ抗原（ＨＢＡｇ、以前オーストラリア抗原Ａｕ
−Ａｇと呼ばれていた）、特殊抗原例えば全菌細菌また
はその他の全微生物体、単細胞性または多細胞性寄生体
、動物細胞または適当な（亜）細胞フラグメント例えば
全菌サルモネラ、梅毒トレポネーマ（梅毒）およびクラ
ミジア細菌をあげることができる。

前述の［生体高分子」とは好ましくはその分子のどの部
分が、好適には免疫グロブリンの非抗原結合性構造に対
して親和性を有するかということには関係なく、ポリペ
プチド、蛋白、糖蛋白、多糖類、リポ蛋白一多糖類コン
プレツクスを包含することを意味する。

生体高分子は微生物すなわち細菌に由来するかまたはそ
の他の生物学的起源を有していてもよく、免疫グロブリ
ン〔前記抗体１）１ｆＣ指向された免疫グロブリン〔抗
体〕から構成されていてもよい。

以上のような生体高分子の非常に適当な例は、黄色ぶど
う球菌に由来する、いわゆるプロテインＡであるかまた
は前記プロテインのフラグメントであり、該フラグメン
トはポリペプチド性であり、抗体の非抗原結合構造に結
合する能力を有している。相当する性質を有する生体高
分子のその他の例は表皮ぶどう球菌に由来するポリペプ
チドおよびある種のぶどう球菌の表面構造上に存在する
生体高分子である。この生体高分子はそれを産生する微
生物の表面に結合していてもよい。生体高分子がプロテ
インＡまたはそのフラグメントから構成されている場合
には、その粒子はぶどう球菌、好ましくは殺菌ぶどう球
菌からなるのが極めて有利である。プロテインＡ含有ぶ
どう球菌試薬の製造はジヨンソンおよびクロンバルの方
法〔ＥｕｒＪ．ＩｍｍｕｎＯｌ４（１９７４）第２９〜
３０頁参照〕に従つて行なわれるが、その際少なくとも
１年間安定な１０％懸濁液が得られる．この懸濁液は、
表面上の抗原に結合したＩｇＧ抗体の検出に使用される
場合には、適当な表面活性剤を添加してりん酸塩一緩衝
化食塩水溶液中約！／２％の懸濁液に希釈するだけでよ
い。本発明によれば、前記生体高分子はまた水に不溶性
の重合体小粒子にも結合しうる。

そのような重合体の例としては、ポリヒドロキシ化合物
および２官能性物質の共重合体例えばデキストランおよ
びエピクロロヒドリンの共重合体〔フアルマシア。フア
イン。ケミカルズ社のセフアデツクス（登録商標名）〕
を含有するゲル粒子、アクリレートその他を含有するゲ
ル粒子等があげられる。水に不溶性の前記重合体小粒子
は水中において膨潤性であつてもよい。生体高分子と粒
子との結合はまた生体高分子の重合、恐らく別の重合体
との共重合、例えばある種の免疫グロブリン群に特異的
に指向された抗体を含有する血清の不溶性化によつても
起りうる。所望により、この小粒子は染色されていても
よい。０．１〜２０例えば０．２〜１０ミクロメートル
のサイズを有する粒子を使用するのが好ましい。

本発明によれば、前記生体高分子は共有性の結合または
吸着によつて小粒子の表面して結合され得る。

本発明によれば、細菌菌体はその表面層中に同一菌体に
由来する生体高分子またはその他の起源に由来する生体
高分子を含有しうる。

生体高分子は細菌菌体の表面上に、生体高分子と菌体と
の間の自然結合および（または）人為的方法によつて得
られる結合によつて結合され得る。接着性生体高分子を
有する細菌菌体はアルデヒド例えばホルムアルデヒドお
よび（′Ｊ．たは）グルタルアルデヒドで処理され得る
。それらはまた殺菌および（または）滅菌のために加熱
処理され得る。ＩｇＧ一群の抗体はプロテインＡ含有ぶ
どう球菌により検出され得る。

プロテインＡに結合し得ない抗体を検出する場合には、
これらの抗体と特異的に反応するその他の生体高分子が
直接結合している粒子を本発明に従つて使用することが
できる。

本発明の他の態様によれば、プロテインＡＶＣ．対する
結合能力を示さない抗体もまた、表面上の前記抗体一抗
原結合物を、プロテインＡとＦｃ一部を介して反応し、
前記プロテインＡと反応しない抗体に対して指向された
抗体の溶液と反応させることによつて検出することがで
きる。

次いで、プロテインＡ含有ぶどう球菌試薬を加え、起り
うる反応を前記と同様に観察する。本発明の更にその他
の態様によれば、抗原に結合した抗体１を有する表面を
、その表面は前記抗体１に指向された抗体が（そのＦｃ
部を介して）直接結合されている細菌菌体の懸濁液と接
触させて抗体１で被覆された表面部分を可視化させ得る
。

試料中の抗体の半定量的測定のためには別の技術を使用
することができる。

例えば、一連の異なつた希釈度の試料を試験し、その結
果を対照試料を使つた同様の試験の結果と比較し得る。
そして、正の反応を与える試料の最大希釈度が確立され
る。本発明の非常に有利な籠様によれば、試料中の抗体
の存在は該試料を、抗原で被覆された部分の外側の表面
上に適用し、そしてこの試料を１帯域中好ましくは狭い
帯域中、抗原で被覆された表面上を一方向に通過させる
ことによつて定量的に検出することができる。試料の通
過が終了した時、生体高分子を有する粒子の懸濁液を加
える。前記試料の通過は試料の染色その他によつて認め
ることができる．こうして前記粒子によつて被覆された
表面は前記試料中の抗体含量の尺度であり、既知の対照
試料の相当する表面と関連づけられる。抗原被覆表面上
の試料通過を行なうためには、例えば毛細管媒質例えば
セフアデツクスＧ−７５スーパーフ・ヤーン（フアルマ
シア．フアインケミカルズ社の交さ結合デキストランゲ
ル）のような粒子の単一薄層（または互いに重なりあつ
た数層）を適用することによる薄層ゲルクロマトグラフ
イ一技術において既知の方法を使用することができる。
液体輸送媒体としてはまた、紡糸繊維または未紡糸繊維
の糸を使用することができる。生体高分子含有粒子によ
る可視化の前に、前記媒体をまず除去しなければならな
い。さらに、抗原被覆表面上に何ら固体物質の支持体を
有さないスライド上に、単一の直線状液体流れまたは数
本の平行直線状液体流れを形成させることも可能である
。

その場合には、第一にこの表面を単一の直線状または数
本の平行直線状に湿らし、わずかに頃斜したスライドか
らのそれぞれの液体の流入および流出は適当な毛細管物
質によつて配置されなければならない。抗原被覆表面上
の一方向への試料中抗体の移動はまた電気泳動法によつ
ても達成することができる。

本発明（Ｃよれば、試料中の抗原は、その抗原に指向さ
れた抗体で被覆されたスライドを次いで第二の特異的抗
体溶液【さらし、そして最終的に試薬粒子の懸濁液にさ
らすことによつて、前記スライド上で（半）定量的に測
定することができる。

表面部分・＼の粒子の接着が試料中の抗原の存在を示す
。本発明の方法によれば、抗原含有試料とこの抗原に指
向された抗体の標準量の薬量との混合物を試験し、次い
で試料中の抗原により阻止されずに存在し得る過剰の抗
体を検出することによつて、試料中の抗原の濃度もまた
間接的かつ半定量的または定量的に測定することができ
る。

本発明の方法によれば、全く異なつたタイプの抗原に指
向された抗体を検出することができる。

すなわち、可溶性ならびに不溶性（例えば粒状）抗原を
表面上に適用することができる。不溶性（例えば粒状）
抗原に指向された抗体を前述のような簡単な方法妃より
そして抗原物質の損失を非常に小さくして検出しうるこ
とは、従来技術との関係において極めて顕著な利点であ
る。ここに本発明を次の実施例によつて更に説明するが
、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

例１ ７６×２６ｗｎのスライドガラスの表面を重クロム硫酸
中で洗い、水でよくすすぎそして圧搾空気で乾燥させる
。

約５分またはそれ以上の間、その表面をりん酸塩緩衝化
食塩水（以下ＰＢＳと称され、０．１２ＭＮａＣｔ１０
．０３Ｍりん酸塩を含有し、ＰＨ７．４である）中の２
×１０６の平均分子量を有するデキストラン（フアルマ
シア．フアインケミカルズ社のデキストラン２０００）
の１（ｆｌ）溶液と接触させる。次いで蒸留水中で充分
にすすぎ圧搾空気を使つて乾燥させる．次いでこのガラ
スを前記と同様にして該テスト系において不活性の蛋白
例えば前記試料を採取した種と同一の種からの血清アル
ブミンの１（ｆｌ）溶液にさらす。試料を自動ピペツト
によつて各列８滴までの、５〜１０μｔ小滴として列状
に適用する。１／１００以一ヒの試料の希釈は１／１０
０に希釈された同一種からの抗原不含血清中または０．
１％血清アルブミン溶液中で行なう。

５〜１０分後この小滴を０．１％トウイーン（登録商標
名）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー
トリアトラス。

ヘミ一ＧＯｍ．ｂ．Ｈ．）含有ＰＢＳ（以下Ｔ−ＰＢＳ
と称す）ですすぐ。次いでこのスライドを水平の位置に
置き、ホルマリン処理および加熱殺菌処理したプロテイ
ンＡ含有ぶどう球菌〔ジヨンソン、クロンバル、Ｅｕｒ
Ｏｐ．Ｊ．ＩｍｍｕｎＯｌ４（１９７４）第２９頁参照
〕のＴ−ＰＢＳ中の１／２％懸濁液で被覆する。５〜１
０分後、このスライドの水切りをし、Ｔ−ＰＢＳですす
いで過剰のぶどう球菌試薬を除去する。

次いでこのスライドをＴ−ＰＢＳ含有のキユベツト中に
浸す。その結果はそのような湿つたガラス上、または、
所望によりトウイーン２０を加えた蒸留水で連続してす
すぎ、吸い取り紙上で水切りしそして風乾させた後で観
察することができる。観察は暗い背景方向の斜めの透過
光線中で行なうのが最もよい。正の反応はテスト滴を落
した部分中ぶどう球菌の黄白色パツチとして現われ、負
の反応は該表面上にぶどう球菌が存在しないことにより
わかる。この方法によれば、１．３〜／Ｍｅの特異抗体
を含有する兎の抗デキストラン抗血清により正の反応が
起り、１／１００００の希釈後にも正の反応が得られた
。人および兎血清は希釈なしに適用することができる。
この場合負の反応は起らない。デキストランに指向され
た抗体は極めて高感度の放射線免疫学的技術によつての
み検出され得る人血清では、２５〜１２５倍の血清希釈
後においても前記のテスト系において正の反応が得られ
る。

同様に、それぞれハプテンおよびコンプレツクスを包含
するその他の化学構造を有する抗原、特殊抗原に指向さ
れた兎および人からのＩｇＧ抗体が検出された。本方法
により試験され、すぐれた結果を与えた抗原（抗体結合
体）の例としては、牛血清アルブミン、卵アルブミン、
臭化シアン活性化デキストラン２０００ＶＣ前以つて共
有結合させた後のゲンタマイシン（ハプテンの一例とし
ての抗生物質）、肝炎Ｂ抗原（ＨＢＡｇｌ以前オースト
ラリア抗原Ａｕ−Ａｇ．と呼ばれていた）、サルモネラ
菌、クラミジア菌があげられるが、これらすべての場合
に、従来使用されていた、より複雑なまたは本質的によ
り時間のかかる方法による結果に匹敵した。例２ 秤量した量のデキストランを含有する溶液の所定の量お
よびデキストランに対する抗体の希釈物の所定の量の混
合物からなる試料を使用して、例１の方法をくりかえす
。

この混合物は５〜１０分間室温において反応させておく
。試料中に抗原がない場合に、抗体の大過剰を意味する
ことなしに表面上に明白なぶどう球菌層を生成させるた
めに、使用される抗デキストランの希釈度として、抗原
含有溶液との混合後１／２０００が選ばれた。このよう
な条件下においては、最小量の抗原でさえも、存在する
小量の抗体との反応により表面上の抗原一抗体結合を阻
害するであろう。この結果抗原存在の指標としてのぶど
う球菌層が存在しなくなる．同一容量の前記抗デキスト
ラン抗血清希釈物と混合した既知濃度のデキストラン溶
液を試験する場合、ぶどう球菌吸着の完全阻害が０．１
μｒ／Ｍｅの濃度を有する抗デキストラン溶液によつて
得られ、正のぶどう球菌吸着は０．０１μｒ／７！１ｅ
の濃度を有するデキストラン溶液によつて得られる。こ
のことは、この技術の感度が放射線免疫学的試験によつ
て得られるものに相当することを示している。例３ 例１のようにして重クロム硫酸で洗つた２０×２０ｃｍ
のスライドグラスをＰＢＳ中の牛血清アルブミンの１％
溶液に、その溶液の約１ｍｅを２枚の同ガラススライド
間Ｇてのばし、約３ｃｍの抗原不含余地が残るように互
いに押さえることによつて接触させる。

すすぎおよび乾燥は例１のようにして行なわれるが、液
体および空気は前記抗原不含の余地からの方向に吹き込
まれなければならない。スライド全体に亘つて、セフア
デツクスＧ−７５スーパーフアイン（フアルマシア．フ
アイン。ケミカルズ社製）のゲルの薄層を適用する。次
いでこのスライドをいわゆる薄層ゲルクロマトグラフイ
一用装置に入れ、それぞれＰＢＳを含有する１個の上方
容器および１個の下方容器と濾紙を介して接触させる。
これら容器の間を液体はサイホンの原理に従つて流れる
。抗原不含の余地の上部に試料を、５〜１０μｔの血清
またはその希釈物の滴の形で適用する。液体間の高さの
差を試料がプレート上を約３時間で移動するように調節
する。その後、前記ゲルをＰＢＳで洗い、プレートをＴ
−ＰＢＳで再すすぎし、次いで約５分間、１／１００に
希釈された正常兎血清にさらし、Ｔ−ＰＢＳで再すすぎ
し、そして最後に例１のようにしてぶどう球菌試薬およ
びリンス流体にさらす。その結果は暗い背景方向の斜め
の透過光線中、抗原表面と前記余地との間の境界線を底
辺としそして液体の流れ方向に頂点を有する三角形の部
分として観察されるのが最もよい。この面積は前記試料
中の抗体の量に正比例する。例４ スライドに吸着させた抗原に特異的に結合した、兎の抗
デキストラン抗体（スライドをぶどう球菌試薬にさらす
工程を除外した、例１の方法の結果として得られる）も
また、このスライドを１μの平均サイズを有するポリメ
チルメタクリレート粒子を１／２５に希釈されたモルモ
ツトの抗兎免疫グロブリン抗血清またはそのような血清
の免疫グロプリンフラクシヨンで処理することによつて
製造された試薬粒子と接触させることによつて検出され
る。

前記粒子はりん酸塩緩衝化食塩水で洗い、そして使用前
ＶＣＯ．５〜１％（Ｖ４）懸濁液に調整された。この試
薬とスライドとの接触の間、前記懸濁液をスライド表面
上で注意して前後【動かし、スライドの表面上に吸着さ
れている抗原に結合した抗体への試薬粒子の特異的結合
を速やかならしめた。得られた結果は例１ＶＣよるぶど
う球菌試薬を使用して得られたものに対応する。以下【
本発明により開示された新規な技術的事項を列記する。

１水性試料を抗原で覆われた平滑な表面と接触させて該
表面上の抗原にそれと特異的な反応性を有する抗体を結
合させ、かくして該表面上に結合された抗体を検出する
ことにより前記水性試料中の抗体の存在を検出すること
からなり、その際前記表面を、ぶどう球菌に由来し且つ
プロテインＡおよび該プロテインのポリペプチドまたは
蛋白質を有するフラグメントよりなる群から選ばれ、さ
らに抗体の非抗原結合構造において抗体に特異的に結合
する能力を有する生体高分子が共有結合しているかある
いは吸着力によつて結合している黄色ブドウ状球菌たる
水溶性の懸濁液と接触させ、それによつて前記粒子を抗
体が特異的に結合している表面部分に吸着させて粒子の
可視コーテイングを形成させることを特徴とする、抗体
の検出法。

２．前記粒子がその表面層中にプロテインＡを含有する
ぶどう球菌体である、前記第１項記載の方法。

３．抗原結合抗体を前記抗体に関するプロテインＡ反応
性抗体と接触させ、その後プロテインＡ含有ぶどう球菌
の懸濁液を加えて抗体の二重層で被覆された表面を可視
化させて非プロテインＡ反応性抗体を検出する、前記第
１項記載の方法．試料を抗原被覆表面上の狭い帯域に一
方向で通過させる、前記第１項記載の方法。

１・場合により抗原を含有する試料を抗原に関する既知
量の抗体と混合し、その後試料中の抗原によつて阻害さ
れなかつた存在し得る過剰の抗体を試料中の抗原の量の
間接的目安として検出する、前記第１項記載の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 水性試料を抗原で覆われた平滑な表面と接触させて
   該表面上の抗原にそれと特異的な反応性を有する抗体を
   結合させ、かくして該表面上に結合された抗体を検出す
   ることにより前記水性試料中の抗体の存在を検出するこ
   とからなり、その際前記表面を、黄色ぶどう球菌に由来
   し且つプロテインＡおよび該プロテインのポリペプチド
   または蛋白質を有するフラグメントよりなる群から選ば
   れ、さらに抗体の非抗原結合構造において抗体に特異的
   に結合する能力を有する生体高分子が共有結合している
   かあるいは吸着力によつて結合している黄色ぶどう球菌
   菌体たる水不溶性小粒子の懸濁液と接触させ、それによ
   つて前記粒子を抗体が特異的に結合している表面部分に
   吸着させて粒子の可視コーティングを形成させることを
   特徴とする、抗体の検出法。