JPS59501213A - 生物学的活性物質用の結晶化炭水化物マトリックス、該マトリックスの製造方法、及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的活性物質用の結晶化炭水化物マ）ＩＪッ生体に与えられた生物学的に活 性女物質は、多くの場合、生体によって急速に消化される。この観点から、生体 内で治療上活性な濃度を得るために、物質の供給が規則的な間隔で繰シ返される 。生物学的活性物質の生体へのこのような投与は人間及び家畜の医学に、あるい は農業及び林業における多種の寄生虫（例えば昆虫、真菌類など）の抑制におい て重要である。

繰シ返し投与の欠点を避ける目的で、上記物質をひとつの又は他の手段でマトリ ックス中に吸着し、結合し又は包み込み、その後長期間にわたシ異々る機構を経 てこれを放出するという貯蔵効果を提供するマトリックスを発見する努力がおと なわれた。とのタイプの投与の大きな利点は物質が均等ガ速度で生体に与えられ ることである；通常の投与に伴なう濃度の頂点及び谷間を避けられる。生物学的 活性調合剤とは生体に影響を与うるよう々調合剤又は物質を意味する。かがる調 合剤の例は、治療学士活性な調合剤、殺虫剤又は除草剤、酵素、抗体、抗原、ア レルゲン、ホルモン。

生きている又は死んでいる及び全体の又は分割された微生物又はビールスである 。本発明の用途分野の典型例として次のものを示す： １、インシュリン 糖尿病に苦しむ患者は血糖量を許容レベルに維持するため忙規則的間隔で又は食 事中にインシーリンを注射し々ければ力ら々い。もしインシュリンの貯蔵調合剤 を簡単な方法で投与できれば、注射の回数を非常に減少することができ、大変有 利である。

２、ワクチン接種 人間のワクチン接種には抗原補強体は使用でき々かった。しかし、もし身体が抗 原に長時間さらされるのならば、免疫的応答がはるかに好ましいととが文献に示 された。ワクチン接種の目的のためには、貯蔵マトリックスはそれ自体は免疫性 を産出す、身体から排泄され得ないことが重要である。例えば、人間で実施され た蜂抗原に対するワクチン接種テストでハ、水ニ溶解され皮下注射されたこれら の抗原は４時間以内に排泄されることがわかった。

種々のタイプの調合剤のための貯蔵マトリックスの製造は文献に記載され、得ら れた幾つかの貯蔵調合剤は市販されている。

ここに述べる本発明は貯蔵マトリックスとしてポリマーを使用する。種々のタイ プのポリマーが文献（例えば、　Ｃｈｅｗ、　Ｅｎｇ＊　Ｃｏｍｍｕｎ、　１９ ８０年、第６巻、第１−４８頁、又はＩｎｔ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　１９８０ 年、第７巻、第１−１８頁）に記載されている。かかるポリマー調合剤に望まれ る性質のうちの幾つかを下記する：１、ポリマーは生物学系中で本質的に化学的 に不活性である。

２、ポリマーは生物学的に十分に形質表現されている。

３、ポリマーは無毒性で免疫性を産出しない。

４、ポリマーは身体から通常経路で排泄されうる。

５、ポリマー調合剤は容易に投与できる。

６、ポリマー調合剤は生物学的活性物質を放出でき、放出速度は容易にコントロ ールされうる。

７、ポリマーは種々の分子量の物質を取シ込みそして放出できる。

上記に概要を述べた既存のポリマー調合剤は全てが共有交差結合ポリマーのタイ プであり、その幾つかのケースにおいて共有交差結合は生物等系中で不安定であ シ、及び生物学的活性物質はポリマーに共有結合する。この不安定性はポリマー 調合剤の退化をまねき、従って調合剤が放出されてしオう。

結晶性物質（結晶蛋白質のような）が共有交差結合ポリマー調合剤中に取シ込ま れる場合、種々のタイプの放出が得られる。ポリマー調合剤の多孔性の程度を変 えることによって、各種の放出時間が得られる。

一般に、生物学的活性物質の投与のためのポリマー調合剤の開発において、出来 るだけ純粋なポリマーを用いるよう努力されて来た。かかる純粋なポリマーのひ とつのクラスは炭水化物によって代表される。炭水化物マトリックスの現在の製 法は、安定カマトリクラスを得るために、ポリマー鎖の共有カップリング（英国 特許第９２４０５４号）又は熱処理（スウェーデン特許第４０２４／６９号）を 含んでいる。

発明の説明 本発明は、請求の範囲による炭水化物ポリマーを安定化する新規ガ技術に基づい ている。この技術は、疎水性のエマルジョン化媒質中にポリマー溶液を乳化する ことを含み、これによりこのエマルジョン化媒質中に可溶性炭水化物ポリマーの 球状小滴が得られる。

この小滴を安定化するために、その後上記エマルジョンを、炭水化物ポリマーを 水に比較的不溶性の錯体に結晶化しうる液体中に注ぎ込む。

結晶化とは、炭水化物ポリマーを微不滴中に保持する結合の形が水素結合、イオ ン結合又はファンデルワール２力などの非共有結合の形で化学的に特長づけられ ることを意味するが、大部分は水素結合から寿っている。

得られた？リマーマ）　ＩＪソックス、その非共有的な交差結合ポリマー格子中 に生物学的活性物質を保持でき、この生物学的活性物質を結晶化炭水化物マトリ ５ クラスのゆっ〈シした再溶解と同時に放出するという特性を有する。

生物学的活は物質を合体させる最も簡単々方法は、これを溶解された炭水化物ポ リマー中に混入し、その後これをエマルジョン化媒質と混合することである。

これらの小滴即ち粒子の製造におけるマｌクラス物質は炭水化物ポリマーから々 る。本発明に述べた技術ニよって、炭水化物としてデキストラン、ピュルラン、 グリコ−ダン、デン粉、アガロース、セルロース、アルギン酸塩、キトーザン、 又はカラダーナン。

及びこれらの種々の誘導体を使用することが可能となる。

幾つかの場合、炭水化物はそれ自体が生物学的活性物質として重要であシうる。

そのひとつの例は抗凝固剤として治療に使用される炭水化物へ・セリンである。

炭水化物の分子量に関して、この技術は非常に広い範囲で有効であることが判明 した。例えば、結晶化炭水化物の小滴はグルコース、スクロース、及びマルトー スから作られた。約８００から数１００万の平均分子量をもつデキストラン及び デキストリンもまた有効であった。本発明による結晶化炭水化物の製造における 分子量の上限はそれぞれの炭水化物のそれらの溶媒への溶解度によってのみ限定 される。

これらの炭水化物ポリマーは、例えば疎水性物質又は電荷物習を吸着する能力を 変えるような方法で、種々の誘導体に変えることができる。十分実証された疎水 性物質の例はコレステロール、　ＤＥＡＥ＋又はチパ（Ｃ１ｂＡ　）クロムブル ーであり、これらは全て簡単な方法で炭水化物ポリマーと共有結合し得る。他方 、−８０４又は−Ｎｒ■２のよう方電荷を有する基は、電荷物質の吸着のために 、炭水化物マトリックスと共有結合し得る。炭水化物ポリマーデキストランに結 合した上記の物質はウプサラのＰｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢから市販されている。

上記した炭水化物ポリマーの々かで、ポリマーデキヌトラン、デン粉、グリコー ゲン、又はビールランが上記条件に基づいて（上記必要ガ性質１−７参照）好ま しい。主力理由は、これらのポリマーが生物系中で極めて十分に形質表現されて いる点である。しかし、上記ホリマーの力かで、生物学的活性物質のための非酵 素的に（組織中で）減成しうるマトリックスの例として、デキストランを第−位 に置くべきである。デン粉、グリコーゲン、又はビールランの場合、アルファー アミララーゼ濃度が減成時間を決定し、従ってまた生物学的活性物質の放出時間 を決定する。デキストランの場合、この結晶性マトリックスを再溶解し、従って 放出をコントロールするのは、−又はイオン強度のように物理的因子のみである 。

酵素的にコントロールされた放出、例えばアル７ァーアミラーゼの場合の欠点は 、その濃度が種々の病気によって体液中で大巾に変わりうることである。酵素濃 度は患者によって、若しくは同じ患者でも一日の時間によって変化し、従って生 物学的活性物質の放出時間に影響を与える。

本発明は、生物学的活性物質を取シ込んだ結晶化された炭水化物小球の製法を含 む。乙の方法は、炭水化物ポリマーを高誘電率を有する溶媒中に０．１〜２００ チ（重量／容積）の範囲内の濃度まで溶解することを特徴とする。高誘電率とは 、約３５以上の誘電率をもつ溶媒又は溶媒の組合せを意味する。有用方かかる溶 媒は、中でも、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、ジメチル２ルホキ シド、水、及びホルムアミド、又はこれらの混合物である。この溶液に生物学的 活性物質を加える。溶解された炭水化物ポリマーと生物学的活性物質の得られた 混合物はその後、上記溶液とエマルジョン媒質とを含む工、マルジョン系中で乳 、　化され、このエマルジョン媒質は上記溶液と混和できず且つエマルシコン媒 質中゛で炭水化物溶液の小滴の形成に寄与する特性を有する液体からなる。

前述した有用なエマルジョン媒質の例は植物油、好ましくけ菜種油又はとうもろ こし油である。他の有用な疎水性のエマルシコン媒質は７千ラフイン油又はシリ コーン油を含む。別のタイプのエマルジョン媒質はひとつ又はそれ以上の乳化剤 を溶解した有機溶媒を含む。有用力かかる有機溶媒は、なかでもキシレン、トル エン、エチルベンゼン、ジエチルベンゼン、フロビルベンゼン、エチレン　クロ ライド及び他の類似の溶媒、及びこれらの混合物である。

微小球を得るために種々の乳化剤と一緒にエマルジョン媒質を用いる技術は文献 に十分記載されておシ、ここでは詳しく述べない。

エマルジョンを作るために、超音波発生器又は高圧ホモジナイザーを使用しうる 。炭水化物溶液が小球の形で乳化されている゛得られたエマルジョンは、炭水化 物ポリマーを結晶化できる液体中に移すことによ多安定化され、これによシ生物 学的活性物質が包み込まれる。有用々かかる液体はエタノール、メタノール。

又はアセトンであるが、後者が好ましい。結晶化の後、得られたマトリックスを 更にアセトンで洗浄し、回転蒸発により又は乾燥棚中で乾燥する。

包み込まれた物質がマトリックスから放出された後もその生物学的活性を保持し ていることが重要である。

この点に関して、本発明では、インシュリン及びインターフェロンのようなホル モン蛋白質、ゾラズミン及びベーターガラクトシダーゼのよう々酵素、及びモノ クロナル抗体はマトリックスに包み込まれ次に放９ 出された後もその生物学的活性を保持する。

幾つかの場合、マトリックスに物質を包み込むことが不可能である。この場合、 物質をマトリックスに共有結合させる可能性があるが、共有結合の技術はマトリ ックスの相当程度の交差結合を含まないととが重要である。何故ならば、かかる 交差結合は前述したように炭水化物マトリックスの再溶解に基づく放出メカニズ ムを完全に崩壊するからである。

活性化剤として塩化トレシルを使用すれば上記タイプの共有結合が得られる。こ の結合技術は炭水化物マトリックスの交差結合を導かないからである（　Ｅｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１９８１年、第１０２ 巻、第４４９−４５７頁）。

以下の実施例は本発明を限定するものではガく、更に説明するためのものである 。

実施例１ 分子ｉ４０，０００のデキストランの５０チ（重量／容積）水溶液１ｇ−を、１ ００ｉオバルブミン／ｍ７！水を含む１００μ！のオノ々ルプミン溶液と混合し た。後者ノ溶液にｉｌ：１２５−Ｉでラベルしたオパルブミンが前もって加えら れていた。

このデキ２トランーオパルブミン溶液を、１００−ビーカー中の２５−の植物油 中に懸濁させ、＋４℃に冷却した。この混合物を超音波で１分間乳化させ、１° 　特許昭５９−５０１２１３　（４）乳化剤Ｔｗｅｅｎ　８０を濃度０．１１　 Ｃ重量／容積）まで溶解させたアセトン２００　ｍ７！中に上記エマルジョンを 注ぎ入れた。このエマルジョンをアセトン溶液に注意深く注ぎながら、約１００ 　Ｏｒｐｍで攪拌した。オ／？ルプミンを包み込み、結晶化によって安定化され たデキストランの小球を上記アセトン溶液で４回洗浄し、その後それらを空気乾 燥した。

標準的に、かかる実験によって、炭水化物マトリックス中に添加オバルブミンの ６０〜７０％が包み込まれた約２５０ｍｇの小球が回収される。作られた小球の 寸法は００１〜１０μｍである。エマルジョン媒質の組成を変えることによって 、直径１間才での小球を容易に作ることができる。

実施例２ 実施例１と同様であるが、アセトンの代ルにメタノール又はエタノール中でデキ ストランを結晶化させたＯ 実施例３ 実施例１と同様であるが、デキストランと油の代りに、０．２５’のデン粉を水 に溶解し、このデン粉溶液を乳化剤ＧａｆａｃＰＥ−５１０（５％重量／容積） を含むトルエン中で乳化した。

実施例４ 実施例１と同様であるが、デキストランの代シに０．２チのアガロースまたはカ ラダーナン１デを＋４０℃で使用した。

実施例５ 実施例１と同様であるが、デキストランの代シに１ｆｆのアルギン酸塩を使用し 、純粋な油の代りに油中に乳化剤Ｇａｆａｃ　ＲＭ　−４１０の０１チ混合物を 用いて実施例１と同様であるが、デキストランの代りにＰＨ５で溶解した１チキ トーサンのＩＪを使用した。

実施例７ 実施例１と同様であるが、３９−のセルロースを１５０ＰのＮ−エチル　ピリジ ンクロライドと７５１ｉ１−のジメチルホルムアミドに溶解し、この溶液１ｚを デキストランの代シに使用した。

実施例８ 実施例１と同様であるが、スクロースの２００チ（Ｍ量／容積）水溶液をデキス トランの代シに使用した。

実施例９ 実施例１と同様であるが、デキストランの代シにグリコーゲンの３チ（重量／容 積）水溶液を使用した。

実施例１０ 夾施例工と同様であるが、オバルブミンを使用せず、それ自体が生物学的に活性 な炭水化物ポリマーであるヘパリンを水中に５０チ（重量／容積）濃度に溶解し 、結晶化小球の製造にデキストランの代シに使用実施例１により製造した１００ ｇ−の乾燥小球を１０ｒｎＡＯＰＢＳ中でｐＨ７，２にてスラリーとした。種々 の時間において、１００，０００の分子遮断をもつフィルターで上記混合物を沖 過することによって、包み込まれたオパルブミンの幾つが゛小球から放出された か調べた。

上記の小球について、放出されたオバルブミンの半減期は約１２日であった。

デキストランテリマーの濃度または分子量を変えることによって、半減期を簡単 に変えるととができる。

ポリマーの濃度を増すことによって、またはより高分子量のポリマーを用いるこ とによって、より長い半減期が得られる。

実施例１２ 実施例１のようにして、置換されたデキストランを小球の製造に用いることが可 能である。ＤＥＡＥ及び５０４−置換デキストランの補助効果を調べるために、 これらを未置換のデキストランと０％、３３％、６６％及び１００チの割合で混 合した。包み込まれたオ／々ルプミンを含むこれらの小球がその後はっかねずみ に皮下注射され、所謂ミクロ滴定−ＥＬＩＳＡ法を用いてオパルブミンに対する ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体を測定した。

免疫学的応答は補助剤の量に直接的に関係するとと、及び未置換デキストラン小 球中のオパルプミンを与えられたはっかねずみの抗体力価は、単に水にとがした オパルブミンを注射したはっかねずみと比較して相当に高いことが判明した。

実施例１３ 生物学的活性物質がその活性を保持するが否かを調べるために、２０チ（重量／ 容積）デキストラン溶液から作ったデキストラン小球中にインシーリンを包み込 んだ。その後、小球から放出されたインシュリンがガラス容器内で脂肪細胞の刺 激のために脂肪酸を生産する能力を保持するかについて評価した。包み込まれた インシュリンについて行なった放出テストにおいて、１２５−Ｉインシュリンを 用いた以外は実施例２と同様にテストして、分子量５００．　ＯＯＯのデキスト ランの３５％溶液から作られた小球から、約６日の半減期が得られた。

実施例１４ 実施例１０におけるごとく、インターフェロンをデキストラン小球中に包み込み 、インターフェロンの抗ウイルス効果を所謂プラーク評価分析にて決定した。

約３５％の抗ウイルス効果が検出された。

実施例１５ 実施例１０におけるごとく、酵素プラズミンをデキストラン小球中に包み込み、 その酵素活性を小球から放出の後に基板Ｈ−Ｄ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｉ、ｙ ｓ　−ｐＮＡ　Ｋよって決定した。乾燥小球は約７５チの生物学的活性の回復を もつ約１％のプラズミンが含まれていた。

実施例１６ 実施例１０におけるごとく、酵素ベーターガラクトシダーゼをデキストラン小球 中に包み込み、酵素活性をマトリックスからの放出後に基板０ＮＰＧによって決 定した。

乾燥小球は７０％の生物学的活性の回復をもつ約５％の酵素を含んでいた。

実施例１７ 実施例１０におけるごとく、蛋白質ＰＥＴＡに対するモノクロナール抗体を小球 中に包み込み、その結果効果をマトリックスからの放出後に所謂サンドイッチ− ＥＬＩＳＡで決定した。生物学的活性の回復は６５チであ実施例１０におけると と＜、１２５−Ｉラペルサれた生合成成長ホルモンを包み込んだが、８０％のデ キストラン（Ａｖｅｄｅｘ　Ｗ＠ａ−＋　５ｔａｄｅｘ　ＡＢ　、　Ｍａｌｍｏ 　）溶液を使用した。

放射能の回復は１００チであった。

実施例１９ マルトースの２００％（重量／容積）溶液を準備し、薬剤のメトトレキセイト（ ｍｅｔｏｔｒｅｘａｔｅ　）及びビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｓ　ｍ 　’）Ｉ−ラベル）をそれぞれ実施例１と同一技術によシ小球中に包み込んだ。

メトトレキセイトの回復１ｄ８２ｆ５及びビンクリスチンの回復は２２チであっ た。

実施例２０ 実施例１９と同様に、メトトレキセイト及びビンクリスチンを炭水化物デキスト ランＴ１及びグルコースに包み込んだ。

メトトレキサンの回復は両脚水化物について６５チ、及びビンクリスチンの回復 は４０チであった。

実施例２１ 実施例１と同様に小球を作ったが、炭水化物としてＩＰの３０チ（重量／容積） デキストランＴ５００を使用し、２５０μ！のアルブミン（ｚｏｏダ／ｉ）を包 み込みのために添加した。

この方法において、加えた蛋白質の６５チが包み込まれ、これは小球の乾燥重量 の４０チに相当する。

ンの水溶液を高投薬量で連続的に注射する。

蜂アレルダンの貯蔵調合剤を使用した場合に免疫的応答が変化するか否かをテス トするために、実施例１に従って蜂アレルダンをデキストラン小球中に包み込み 、はつかねずみに皮下注射した後、種々の時間におけるＩｇＧに関する免疫的応 答を測定した。比較のために、蜂アレルダンと純水及びフロイント完全補助液中 に懸濁した蜂アレルゲンを注射した。水に溶解した蜂アレルゲンが与えられた群 の抗体量は１週間後にわずかに上昇したがその後検知でき力い量に減退した。

フロイント補助液に対して貯蔵調合剤を比較すると、貯蔵マトリックス中に蜂ア レルゲンを包み込ゝんだ場合に抗体量はよシ一層急激に増加することが見い出さ れた。１０週間後、血清中のＩｇＧ量は両群ともまだ増加し、このことは抗体の 高含有量を得ることを望む場合に貯蔵調合剤が極めて有効であることを示してい る。

実施例２３ 分子ｉ１０，０００のデキストランの水溶液１？を低分子量薬剤メトトレキセイ ト５０μ！と混合した。添加量は５ｙ−で、３−Ｈでラベルされた。混合物を実 施例１のごとく処理した結果、添加メトトレキセイトの９２チが乾燥小球中に包 み込まれた。

調べるために、以下の実験を行につだ。

実施例１に従ってホルムアミドに溶解したデン粉から作った１ｏｏｍ９の小球を 、塩化トレシルで活性化し、この／Ｊ＼球に１２５−Ｉミオグロビンを結合させ た。

吸着したミオグロビンを除くために注意深く洗浄し、通常の人血清中よシも１０ 倍高濃度でアルファーアミラーゼを添加した。２時間後、結合ミオグロビンの約 ２５係がマトリックスから放出された。次の２４時間にアルファーアミラーゼ量 を更に１０倍に増すことによシ、結合ミオグロビンの約４５チが全放出量として 得られた。最後の２４時間には、アルファーアミラーゼ濃度は人血清中の２０． ０００倍であった。

国際調査報告　゛−゛゛″′−１′″

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　生物学的活性物質を包み込み、吸着しまたは共有結合した、寸法００１〜１ ０００μｍの、炭水化物の小球または粒子で、マトリックスに対する上記物質の 乾燥重量百分率比が０．００１〜５０であるものにおいて、該小球または粒子が 結晶化によ多安定化されていることを特徴とする、上記炭水化物の小球または粒 子。 ２　平均直径が０．０１〜１０００μｍ１好ましくは１μｍ以下であることを特 徴とする請求の範囲第１項による上記小球または粒子。 ３、炭水化物が、デキストラン、デン粉、及びこれらの誘導体から万る群から選 ばれることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項による小球才だは粒子。 ４　炭水化物が、アルギン酸塩、キト−サン、アガロ−スル力５’ｌ　ダン、セ ルロース、グリコ−ダン。 ビールラン、及びこれらの誘導体からガる群から選ばれるととを特徴とする請求 の範囲第１項または第２項による小球または粒子。 ５　請求の範囲第１項ないし第４項による小球または粒子の製造方法において、 炭水化物をひとつまたはそれ以上の溶媒に溶かした後、この親水性炭水化物ポリ マー溶液を疎水性相中に乳化して球状の小滴を形成し、これを結晶化によ多安定 させることを特徴とする、上記ｌト球または粒子の製造方法。 ６　使用する結晶化のだめの媒質は、アセトン、エタノール、またはメタノール であり、々かでもアセトンが好ましい、ことを特徴とする請求の範囲第５項によ る小球または粒子の製造方法。 ７、抗原をともなう、請求の範囲第１項ないし第６項による小球または粒子の使 用。 ８　インシュリンをともなう、請求の範囲第１項ないし第６項による小球または 粒子の使用。 ９、アレルゲンをともなう、請求の範囲第１項ないし第６項による小球または粒 子の使用。