NO840676L - Krystallisert karbohydratmatrise for biologisk aktive stoffer, fremgangsmaate for fremstilling av matrisen og dens anvendelse - Google Patents

Description

Ved tilførsel av biologisk aktive stoffer til en organisme omsettes disse i de fleste tilfeller hurtig av organismen. P.g.a. dette må tilførselen av stoffer gjentas med jevne tidsintervaller for å kunne oppnå en terapeutisk virksom konsentrasjon i organismen. En slik tilførsel av biologisk aktive stoffer til organismer er av betydning blant annet innen de humane og veterinærmedisinske områder, eller ved bekjempelse av forskjellige typer av skadedyr (f.eks. in-sekter, sopper, osv.I innen jord- og skogbruk.

For å unngå de ulemper som gjentatt administrasjon innebærer forsøker man å tilveiebringe matriser som sammen med stoffet gir depoteffekt. Med dette menes at stoffet på en eller annen måte er absorbert, koblet eller innesluttet i en matrise; via forskjellige mekanismer frigjøres deretter stoffet fra matrisen i løpet av en forlenget tid. Det man forøvrig vinner med denne type av administrasjon, er at tilførselen av stoffet til organismen skjer i jevn takt, man unngår de topper og daler i konsentrasjonen som normal administrasjon medfører. Med biologisk aktive preparater siktes det til preparater eller stoffer som kan påvirke organismer. Som eksempler kan angis terapeutisk aktive preparater, insektisider eller herbisider, enzymer, antistoffer, antigener, allergener, hormoner, levende eller døde og hele eller nedbrudte mikroorganismer eller virus.

Som praktiske eksempler på anvendelsesområder for denne oppfinnelse kan nevnes følgende: 1. Insulin: Pasienter med diabetes må med jevne inter-valler eller i forbindelse med måltider injisere insulin for å holde innholdet av blodsukker på et akseptabelt nivå. Store fordeler skulle kunne oppnås dersom et depotpreparat av insulin på enkel måte kunne administreres og innebære at frekven-sen av injeksjoner kunne minskes kraftig. 2. Vaksinasjon: For humant bruk kan man ikke benytte seg av adjuvans ved vaksinasjon. Man har imid-lertid vist i litteraturen at det immunogene svaret blir meget bedre dersom kroppen ut-settes for lang eksponering av antigene.

Det som er viktig ved vaksinasjon, er således at depotmatrisen ikke selv er immunogen, samt at den kan utsondres fra kroppen. Som eksempel kan nevnes at ved forsøk med vaksinasjon av mennesker mot biallergener, utsondres disse, i vann oppløste og subkutant injeserte allergener, innen 4 timer.

Tilvirkning av depotmatriser for forskjellige typer av preparater er veldokumentert i litteraturen, og visse prepare-ringer finnes også kommersielt tilgjengelige.

Oppfinnelsen som beskrives i denne patentsøknad, anvender polymerer som depotmatrise. Forskjellige typer av polymerer er beskrevet i litteraturen. (Chem. Eng. Commun. (1980)

6, 1-48 eller Int. J. Pharm. (1980) 7, 1-18)ønskelige egenskaper for en slik polymerpreparering bør innbefatte følgende: 1. Polymeren bør i seg selv være kjemisk inert i biologiske systemer.

2. Polymeren bør være biologisk velkarakterisert.

3. Polymeren bør være ikke-toksisk og ikke-immunogen.

4. Polymeren bør kunne utsondres fra kroppen via normale veier. 5. Polymerpreparatet bør kunne administreres på lett måte. 6. Polymerpreparatet skal kunne frigjøre et biologisk aktivt stoff, hvorved frigjøringsharigheten av de aktive stoff bør kunne styres på en enkel måte.

7. Polymerpreparatet bør kunne anvendes for inneslutning

og frigjøring av stoffer med forskjellig molekylvekt.

Forekommende polymersystemer som beskrives i ovennevnte oversiktsartikler, er samtlige av typen kovalent, kryssbundne polymerer der den kovalente kryssbindingen i visse tilfeller er ustabil i biologiske systemer, og der det biologisk aktive stoff er kovalent bundet til polymeren. Denne ustabilitet leder til nedbryting av polymersammensetningen hvorved preparatet frigjøres.

En annen type av frigjøring oppnås dersom krystallinske stoffer (f.eks. krystalliserte proteiner) innesluttes i den kovalent kryssbundne polymersammensetningen. Ved utnyttelse av varierende porøsitet i polymersammensetningen oppnås varierende frigjøringstider. Generelt kan det sies at ved arbeidet med å tilveiebringe polymersammensetninger for administrasjon av biologisk aktive stoffer søker man å anvende så "rene" polymerer som mulig. En slik "ren" klasse av polymerer representeres av karbohydratene. Eksisterende metoder for fremstilling av karbohydratmatriser innbefatter kovalent kobling mellom de inngående polymerkjedene (GB 924054)

eller varmebehandling (SW 4024/69) for å oppnå stabile matriser .

Oppfinnelsen baserer seg på en ny teknikk for stabilisering av karbohydratpolymerer ifølge vedlagte patentkrav. Teknikken innebærer at en oppløsning av polymeren emulgeres i et hydro-fobt emulgeringsmedium hvorved sfæriske dråper av den opp-løselige karbohydratpolymeren oppnås i emulgeringsmediet.

Ved at nevnte emulsjon deretter helles ned i en væske hvis egenskap er at den krystalliserer karbohydratpolymeren til et i vann relativt uoppløselig kompleks, oppnås en stabili-

sering av sfæren.

Krystallisasjon innebærer at den type bindinger som holder karbohydratpolymerene sammen til en mikrosfære kjemisk karakteriseres som ikke-kovalente av typen hydrogenbindinger, ionebindinger eller van der Waals-krefter, hovedsakelig dog hydrogenbindinger.

Den således oppnådde polymermatrisen har slike egenskaper at den kan holde på biologisk aktive stoffer i det ikke kovalent kryssbundne polymere nettverk, hvorved frigjøringen av det biologisk aktive stoff skjer i samme takt som den krystalliserte karbohydratmatrisen sakte gjenoppløses.

Inkorporeringen av det biologisk aktive stoffet skjer på enklest måte ved å blande dette stoffet med den oppløste karbohydratpolymeren før denne blandes med emulgerings-middelet.

Matrisematerialet ved fremstilling av disse sfærer eller partikler er karbohydratpolymerer. Med den teknikk som beskrives i denne oppfinnelse, kan karbohydratene dextran, pullullan, glykogen, stivelse, agarose, cellulose, alginat, chitosan eller carrageenan, samt forskjellige derivater av disse anvendes.

I visse tilfeller kan også karbohydratet i seg selv være

av interesse som et biologisk aktivt stoff. Et eksempel på dette er karbohydratet heparin, som benyttes terapeutisk som antikoagulans.

Hva angår karbohydratenes molekylvekt, har teknikken vist seg å fungere innen et meget stort område. Således har f.eks. krystalliserte karbohydratsfærer blitt fremstilt av glykose, sukrose og maltose. Dekstraner og dekstriner med en middel-molekylvekt fra ca. 800 opp til flere millioner har også vist seg å fungere. Den øverste grensen for molekylvekten ved fremstilling av krystalliserte karbohydratsfærer ifølge foreliggende oppfinnelse, begrenses bare av de respektive karbohydraters oppløselighet i deres oppløsningsmiddel.

Modifiseringen av disse karbohydratpolymerer til forskjellige typer av derivater kan skje på en slik måte at karbohydrat-polymerenes evne til å absorbere f.eks. hydrofobe eller ladede stoffer, forandres. Som eksempel på veldokumenterte hydrofobe substituenter kan nevnes kolesterol, DEAE, eller cibakromblått, som alle på enkel måte kan kovalent kobles til karbohydratpolymeren. På tilsvarende måte kan ladede grupper av typen -S04 eller -NH2 kovalent kobles til karbohydratmatrisen for å kunne absorbere ladede stoffer. Ovennevnte substituenter finnes kommersielt tilgjengelige, oppkoblet på karbohydratpolymeren dekstran, fra Pharmacia AB i Uppsala.

Av de ovenfor nevnte karbohydratpolymerer foretrekkes poly-merene dekstran, stivelse, glykogen eller pullulan av år-saker som tidligere er beskrevet (se pkt. 1-7 ovenfor). Den fremste årsaken er at disse polymerer er meget velkarakte-riserte i biologiske systemer. Av de ovennevnte settes imid-lertid dekstran i første rekke som eksempel på i vevnad,

ikke enzymatisk nedbrytbar matrise for biologisk aktive stoffer. I tilfellet med stivelse, glykogen eller pullullan,

er alfa-amylasekonsentrasjonen bestemmende for nedbrytnings-tiden og dermed også frigjøringstiden for de biologisk aktive stoffene. I tilfellet med dekstran, er det bare fysi-kalske parametre slik som pH eller ionestyrke som gjenopp-løser den krystalliserte matrisen og derved s£rer frigjørin-gen .

Ulempen med en enzymatisk styrt frigjøring er at i til-

felle med f.eks. alfa-amylase kan dennes konsentrasjon variere innen store områder i kroppsvæsker ved forskjellige sykdomstilstander. I andre tilfeller kan enzymkonsentrasjoner variere mellom pasienter eller i samme pasient ved forskjel-..

lige tidspunkter på døgnet og derved påvirke frigjørings-tiden av det biologisk aktive stoff.

I oppfinnelsen beskrives hvordan man fremstiller krystalliserte karbohydratsfærer med innesluttende biologisk aktive stoffer. Fremgangsmåten kjennetegnes ved at karbohydratpolymeren oppløses i et oppløsningsmiddel med høy dielektrisi-tetskonstans til en konsentrasjon som ligger innen området 0,1-200% ( w/ v). Med høy dielektrisitetskonstant menes her oppløsningsmidler eller kombinasjoner av oppløsningsmidler med dielektrisitetskonstant over ca. 35. Anvendbare opp-løsningsmidler av en slik type er bl.a. dimetylformamid, etylenglykol, dimetylsulfoksyd, vann og formamid eller blandinger derav. Til denne oppløsning tilføres det biologisk aktive stoffet. Den oppnådde blanding av oppløst karbohydratpolymer og biologisk aktivt stoff emulgeres deretter i et emulsjonssystem bestående av nevnte oppløsning og et emulsjonsmedium bestående av en væske som ikke er blandbar med nevnte oppløsning og hvis ytterligere egenskap er at det medvirker ved dannelsen av dråper av karbohydrat-oppløsningen i emulsjonsmediet.

Som eksempel på anvendbare emulsjonsmedier kan nevnes vegetabilske oljer, fortrinnsvis raps eller maisolje,

andre anvendbare hydrofobe emulsjonsmedier innbefatter parafinolje eller silikonoljer. En annen type av emulsjonsmedium innbefatter organiske oppløsningsmidler hvori det er oppløst en eller flere emulgatorer. Anvendbare organiske oppløsningsmidler av en slik type innbefatter bl.a.

xylen, toluen, etylbenzen, dietylbenzen, propylbenzen, etylenklorid og andre lignende oppløsningsmidler samt blandinger derav.

Den teknikk angående hvordan man benytter emulsjonsmedier

i kombinasjon med forskjellige emulgatorer for å oppnå varierende diametre ved fremstilling av mikrosfærer, er veldokumentert i litteraturen, og belyses ikke nærmere her.

For å emulgere emulsjonen benyttes sonikator eller høy-trykkshomogenisator. Den oppnådde emulsjon der karbo-hydratoppløsningen er emulgert i form av dråper, stabiliseres ved at den overføres til en væske hvis egenskap er at den kan krystallisere karbohydratpolymeren hvorved det biologisk aktive stoffet innesluttes. Anvendbare væsker av denne type er etanol, metanol eller aceton, fortrinnsvis benyttes dog aceton. Etter krystallisasjonen vaskes den oppnådde matrisen ytterligere med aceton, hvoretter tørking foretas på enklest måte ved rotasjonsinndamping eller i varmeskap. Av betydning i disse sammenheng er at de innesluttende stoffene bibeholder sin biologiske aktivitet selv etter frigjøring fra matrisen. Oppfinnelsen viser derved at hormonelle proteiner av typen insulin og interferon, enzymer slik som plasmin og beta-galaktosidase samt mono-klonale antistoffer, bibeholder sin biologiske aktivitet eller inneslutning og etterfølgende frigjøring fra matrisen.

I visse tilfeller kan man ikke inneslutte stoffer i matrisen. Det finnes da mulighet for på kovalent måte å fastkoble stoffet til matrisen. I dette tilfelle er det av betydning at teknikken for kovalent kobling ikke innebærer kryssbinding i noen større utstrekning av matrisen ettersom en slik kryssbinding heltødelegger de frigjøringsmekanismer ved oppløsning av karbohydratmatrisen som tidligere er omtalt.

En slik type av kovalent kobling får man dersom man benytter tresylklorid som aktiverende stoff siden denne koblings-metode ikke gir kryssbinding av karbohydratmatrisen (Biochem. Biophys. Res. Comm. (1981) 102, 449-457). Nedenstående eksempler skal ikke betraktes som begrensende, men snarere som illustrerende for oppfinnelsens hovedtrekk.

Eksempel 1

1 g av en 50% (w/v) vannoppløsning av dekstran, med en mole kylvekt på 40.000, ble blandet med 100 yl av en ovalbumin-oppløsning inneholdende 100 mg ovalbumin/ml vann. Til denne sistnevnte oppløsning var det forut tilsatt 5 yl 125-J-merket ovalbumin.

Dekstran-ovalbuminoppløsningen ble suspendert i 25 ml vegeta-bilsk olje i et 100 ml begerglass og avkjølt til +4°C. Blandingen ble emulgert med ultralyd i løpet av 1 min. hvoretter emulsjonen ble helt i 200 ml aceton, hvori emulgatoren Tween 80 var oppløst til en konsentrasjon på 0,1% (w/v). Mens emulsjonen forsiktig ble helt ned i acetonoppløsningen, ble denne omrørt med ca. 1000 omdr./min. De således oppnådde ved hjelp av krystallisjon stabiliserte dekstransfærer med innesluttet ovalbimun ble vasket ytterligere 4 ganger med nevnte acetonoppløsning hvoretter de ble lufttørket.

Normalt oppnås ved et slikt forsøk en utvinning på ca.

250 mg sfærer der 60-70% av tilsatt ovalbumin er innesluttet i karbohydratmatrisen. Størrelsesintervallet for sfærene som fremstilles ifølge den ovenfor beskrevne teknikk ligger mellom 0,01 og 10 ym. Ved å variere sammensetningen for emulsjonsmediet kan det lett fremstilles sfærer med en dia-meter opp til 1 mm.

Eksempel 2

Samme som eksempel 1, med den forskjell at dekstranet ble krystallisert i metanol eller etanol, i stedet for aceton.

Eksempel 3

Samme som i eksempel 1, med den forskjell at 0,2 g stivelse ble oppløst i vann, og at stivelsesoppløsningen ble emulgert i toluen inneholdende emulgatoren Gafac PE-510 (5% w/v), i

stedet for dekstran og olje.

Eksempel 4

Samme som i eksempel 1, med den forskjell at 1 g 0,2%

agarose eller karagenan ved en temperatur på +40°C ble benyttet i stedet for dekstran.

Eksempel 5

Samme som i eksempel 1, men med den forskjell at 1 g alginat ble benyttet i stedet for dekstran og emulgert ved hjelp av 0,1% innblanding av emulgatoren Gafac RM-410 i oljen i stedet for ren olje.

Eksempel 6

Samme som i eksempel 1, med den forskjell at 1 g 1% chitosan oppløst ved pH 5, ble benyttet i stedet for dekstran.

Eksempel 7

Samme som i eksempel 1, med den forskjell at 3 g cellulose ble oppløst i 150 N-etylpyridinklorid og 75 g dimetylformamid, og 1 g av denne oppløsning ble benyttet i stedet for dekstran.

Eksempel 8

Samme som i eksempel 1, med den forskjell at en 200% (w/v) vannoppløsning av sukrose ble benyttet i stedet for dekstran.

Eksempel 9

Samme som i eksempel 1, med den forskjell at en 30% (w/v) vannoppløsning av glykogen ble benyttet istedenfor dekstran.

Eksempel 10

Samme som i eksempel 1, med den forskjell at ovalbumin ikke ble benyttet, samt at den i seg selv biologisk aktive karbohydratpolymeren heparin ble oppløst til en konsentrasjon av 50% (w/v) i vann, og benyttet istedenfor dekstran for fremstilling av krystalliserte sfærer.

Eksempel 11

100 mg tørkede sfærer ifølge eksempel 1 ble oppslemmet i 10 ml PBS ved pH 7,2. Ved forskjellige tidsintervaller ble det undersøkt hvor meget av det innesluttede ovalbuminet som var frigjort fra sfærene ved å filtrere blandingen gjennom et filter med molekylær "cut-off" på 100.000. Med de oven-

for nevnte sfærer ble det oppnådd en halveringstid av frigjort avalbumin på ca. 12 dager.

Ved å variere konsentrasjonen mellom molekylvekten til dekstranpolymeren kan man på enkel måte variere halverings-tidene. Ved å øke konsentrasjonen eller ved å benytte høyere molekylvekt for polymeren oppnås lengre halveringstid.

Eksempel 12

På samme måte som i eksempel 1 er det mulig å benytte substituerte dekstraner ved fremstilling av sfærene. For å undersøke den dokumenterte adjuvanseffekten av DEAE og S04-substituerte dekstraner, ble disse blandet med ikke-substituert dekstran i forholdet 0%, 33%, 66% og 100%. Slike sfærer med innesluttet ovalbumin ble deretter injesert subkutant på mus, hvoretter IgG og IgM antistoffer mot ovalbimun ble bestemt ved hjelp av en såkalt mikrotiter-ELISA-metode. Det viste seg at det immunologiske svaret var direkte korrelert mot mengden adjuvans samt at antistoff samt at antistoff-titeren hos de mus som fikk ovalbumin i ikke-substituerte dekstransfærer, var signifikant høyere sammenlignet med de mus som fikk ovalbuminet injesert bare oppløst i vann.

Eksempel 13

For å teste om et biologisk aktivt protein bibeholder sin aktivitet ble insulin innesluttet i dekstransfærer fremstilt av en 20% (w/v) dekstranoppløsning. Den biologiske aktivitet ble deretter vurdert ved at det insulin som var frigjort fra sfærer viste seg å bibeholde sin evne til in vitro å stimulere fettceller til å produsere fettsyrer. Ved fri-gjøringsforsøk med innesluttet insulin testet på samme måte som i eksempel 2, dog med 125-J-insulin, ble det fra sfærer fremstilt fra en 35% oppløsning av dekstran med molekylvekt på 500.000 oppnådd en halveringstid på ca.

6 døgn.

Eksempel 14

På samme måte som i eksempel 10 ble interferon innesluttet

i dekstransfærer hvoretter interferonets anti-virale effekt ble bestemt i en såkalt plaque-prøve.

Ca. 35% av den anti-virale effekt til det tilførte interferon kunne derved detekteres.

Eksempel 15

På samme måte som i eksempel 10 ble enzymet plasmin innesluttet i dekstransfærer hvoretter \dets enzymatiske aktivitet ble bestemt ved hjelp av substratet H-D-Val-Leu-Lys-pNA etter frigjøring fra sfærene. De tørkede sfærer inneholdt ca. 1% plasmin med gjenvinning av den biologiske aktivitet på ca. 75%.

Eksempel 16

På samme måte som i eksempel 10 ble enzymet beta-galaktosidase innesluttet i dekstransfærer hvoretter den enzymatiske aktivitet ble bestemt etter frigjøring fra matrisen ved hjelp av substratet ONPG. De tørkede sfærer inneholdt ca. 5% av enzymet med gjenvinning av biologisk aktivitet på 70%.

Eksempel 17

På samme måte som i eksempel 10 ble et monoklonalt antistoff rettet mot proteinet PHA innesluttet i sfærene hvoretter dets bindingsaktivitet ble bestemt i en såkalt sandwich-ELISA etter frigjøring fra matrisen. Gjenvinning av den biologiske aktivitet var 65%.

Eksempel 18

På samme måte som ved eksempel 10 ble 125-J-merket biosynte-tisk veksthormon innesluttet, dog ved anvendelse av en 80% oppløsning av et dekstrin (Awedex W90, Stadex AB, Malmo). Gjenvinning av radioaktivitet var 100%.

Eksempel 19

En 200% (w/v)Joppløsning av maltose ble fremstilt hvoretter legemiddelet metotreksat resp. vincristin ( 3H-merket) ble innesluttet i sfærer ifølge samme teknikk som beskrevet i eksempel 1. Gjenvinning for metotreksat var 82% og for vincristin 22%.

Eksempel 20

På tilsvarende måte som i eksempel 19 ble metotreksat og vincristin innesluttet i karbohydratene dekstran Tl og glykose. Gjenvinning for metotreksat var for' begge karbohydratene 65%, for vincristin var tilsvarende sifre 40%.

Eksempel 21

På samme måte som i eksempel 1 ble det fremstilt sfærer

med den forskjell at 1 g 30% (w/v) dekstran T500 ble benyttet som karbohydrat samt at 250 yl albumin (100 mg/ml) ble tilsatt før inneslutning. På denne måte oppnådde man 65% av tilsatt protein innesluttet, hvilket tilsvarer 40% av tørrvekten av sfærene.

Eksempel 2 2

Ved nåværende behandling av de allergier hos mennesker inji-seres suksessivt høyere doser av en vannoppløsning av allergenet. For å teste om det immunologiske svaret forandres hvis et depotpreparat av biallergen benyttes, ble diallergen innesluttet i dekstransfærer ifølge eksempel 1 og injisert subkutant på mus hvoretter det immunologiske svaret m.a.p. IgG og bestemt ved forskjellige tidsintervaller. Som sammenligning ble biallergen i rent vann henholdsvis biallergen suspendert i Freunds complete adjuvans, injisert, innholdet av antistoffer i gruppen som fikk biallergen oppløst i vann, viste en svak oppgang etter 1 uke, for deretter å gå tilbake til ikke-detekterbare innhold. Ved sammenligning mellom depotpreparatet og Freunds adjuvans viste det seg at innholdet av antistoffer steg hurtigere når biallergenene var innesluttet i depotmatrisen. Etter 10 uker var fremdeles IgG-innholdene i serum stigende for begge gruppene, hvilket viser at depotpreparatet er meget effektivt når man vil oppnå høye innhold av antistoffer.

Eksempel 23

1 g av en vannoppløsning av dekstran med molekylvekt på 10.000 ble blandet med 50 yl av det lavmolekylære legemiddeelet metotreksat. Total mengde som derved ble tilsatt, var 5 mg som dessuten var 3-H-merket. Blandingen ble behandlet ifølge eksempel 1 og som resultat ble det oppnådd at 92% av tilsatt metotreksat ble funnet å være innesluttet i de tørkede sfærer.

Eksempel 24

For å teste frigjøring fra en av enzymer nedbrytbar matrise ble følgende testet: 100 mg sfærer fremstilt av stivelse oppløst i formamid ifølge eksempel 1 ble aktivert med tresylklorid hvoretter 125-J-myoglobin ble koblet fast til sfærene. Etter grundig vasking for å eliminere absorbert myoglobin ble alfa-amylase til-

satt i en konsentrasjon som var 100 ganger høyere enn i normalt humanserum. Innen 2 timer hadde ca. 25% av koblet myoglobin blitt frigjort fra matrisen. I løpet av de følgende 4 timer ble alfa-amylaseikonsentrasjonen øket ytterligere

ti ganger hvorved ytterligere ca. 10% ble frigjort. Ved ytterligere å øke mengden av alfa-amylase ti ganger i løpet av de neste følgende 24 timer ble det oppnådd en fri-gjøring på totalt ca. 45% av koblet myoglobin. I løpet av de siste 24 timene var alfa-amylasekonsentrasjonen i prøven ca. 20.000 ganger høyere enn i normalt humanserum.

Claims (9)

1. Karbohydratsfære eller partikkel i størrelses-intervallet 0,01-1000 ym med innesluttede, absorberte eller kovalent bundne biologisk aktive stoffer i et prosentuelt tørrvekstforhold mellom innesluttet stoff og matrise i området 0,001-50, karakterisert ved at karbohydratsfæren eller partikkelen er stabilisert ved krystallisasjon.

2. Sfære eller partikkel ifølge krav 1, karakterisert ved at den har en middeldiameter i området 0,01-1000 ym, fortrinnsvis under 1 ym.

3. Sfære eller partikkel ifølge krav 1-2, karakterisert ved at karbohydratet er valgt fra gruppen: dekstran, stivelse og derivater derav.

4. Sfære eller partikkel ifølge krav 1-2, karakterisert ved at karbohydratet er valgt fra gruppen: alginat, chitosan, agarose, carageenan , cellulose, glykogen, pullullan og derivater derav.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av sfæren eller partikkelen ifølge krav 4, karakterisert ved at karbohydratet ved fremstillingen oppløses i ett eller flere opplø sningsmidler til en klar oppløsning hvoretter den hydrofile karbohydrat <p> olymeroppløsningen emulgeres i en hydrofob fase for dannelse av sfæriske dråper som stabiliseres ved krystallisasjon.

6.F remgangsmåte for fremstilling av sfæren eller partikkelen ifølge krav 5, karakterisert ved at det som krystalliserende medium anvendes aceton, etanol eller metanol, fortrinnsvis dog aceton.

7. Anvendelse av sfærene eller partiklene ifølge krav 1-6 sammen med antigen.

8. Anvendelse av sfærene eller partiklene ifølge krav 1 - 6 sammen med insulin.

9. Anvendelse av sfærene eller partiklene ifølge krav 1-6 sammen med allergener.