JPS59501480A - 被検体の濃度の測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 被検体の濃度の測定 技術分野 本発明は、流体中の被検体の存在状態（ａｍｂｉｅｎｔ　）の濃度、特には体液 例えば唾液、血清、血液及び尿中のホルモン及び他の生物学的活性物質の濃度の 測定に関する。

背景技術 体液中のホルモンの濃度を測定するにあたシ、正確に容量を計った体液試料と、 ホルモンに対して特異的な結合部位を有する結合剤（通常は、抗体）及び放射性 ラベルを付したホルモンとを接触させることによって、前記濃度を測定すること は公知である。

前記ノ結合剤は、ラベルを付していないホルモンの一部分及びラベルを付したホ ルモンの一部分と結合するが、結合したラベルを付したホルモンの相対量は、前 記試料中に存在するラベルを付していないホルモンの量の関数となる。こうして 得られた結果は、ラベルを付していないホルモンの既知量を含む標準溶液を使っ て得られた結果と比較することによって検量し、こうして未知試料中のラベルを 付していないホルモンの実際の量を決める。

前記の公知技術の重要な欠点は、問題の体液試料を身体から取出して試験管等に 移す必要があり、しかもその絶対量を知る必要がある点である。これらの困難な 点の一方又は両方を避けることができれば有利である。

発明の開示 本発明によれば、流体中の被検体例えばホルモンの存在状態の濃度を、被測定流 体の容量を知る必要なく、測定することができ、しかも、体液が対象の場合には 、その体液を身体から取出す必要もなくなる手段が提供される。

本発明の基礎となる事実は、従来知られておらず、被検体例えばホルモンを含む 流体と、被検体に特異的な結合部位を有する抗体又はその他の結合剤とを接触さ せた場合に、被検体による結合部位の占有度（結合部位が塞がる又は占有される 割合）は、前記流体の絶対容量及び結合部位の絶対数と無関係であり、しかも結 合へ１１の絶対量とも無関係であるという事実である。但し、被検体と結合剤と の相対量及び両者の親和性は、流体内への結合剤の導入が被検体の濃度に有意な 効果をもたらさないものである場合に限られるという条件がある。すなわち、例 えば、結合剤の痕跡量だけを使用して、被検体の有意でない小部分のみが結合剤 と結合する場合には、流体中の被検体の全体の濃度は、決して顕著に変化しない 。

上記の条件下においては、流体中の被検体の濃度〔Ｈ〕と、占有された結合部位 の分数（ｆｒａｃｔｉｏｎ　）〔Ａｂ／Ａｂｏ〕とは、 式 （式中、Ｋａｂは結合部位に対する被検体の結合の平衡定数であり、一定の被検 体及び結合剤について一定温度下では一定値をとる） で表わされる関係がある。

この基本的な思想と非常に良く似た思想は、雰囲気温度を測定するために、簡単 な温度計を使用することである。温度計を、例えば室内に入れると、一般には温 度計によって熱が摂取されることとなり、計と比較して大きい場合には、温度計 が最終的に記録する温度は、元の室温を本質的に反映したものとなる。同様に、 生物学的流体等に導入した抗体又は他の結合剤プローブの結合部位占有度は、前 記の条件・が成立するとすれば、前記流体中に元から存在した被検体の濃度を反 映したものとなる。

従って、不動化した結合剤を低濃度で含むプロー４ ブを設計し、被検体の存在状態の濃度が測定対象となっている流体中に前記プロ ーブを導入し、平衡に達した後で、被検体が占有した抗体の部位の割合を決定す ることが可能になる。前記の決定は、しばしば流体から取り出した後のプローブ について行なわれる。もっとも、この点は本発明の必須の事項ではない。場合に よっては、検出した被検体濃度のあるかもしれない不均衡を修正するフィードバ ック測定を伴って、例えば、体液中のホルモン水準を特定のものに依持して、前 記決定をその場合で行なうことが好ましい場合もある。

従って、本発明は、広い意味では、一つの面で、流体中の被検体の存在状態濃度 を測定する方法を提供するものであり、前記の方法は、被検体に特異的な結合部 位を有する痕跡量の結合剤と容量を測定していない流体とを接触させ、前記結合 部位の占有割合から、流体中の被検体の濃度を定量することを含んでなるもので ある。本明細書において、「痕跡」なる用語は、流体中の遊離の被検体の全濃度 に対し、有意でない効果しか与えない量を意味する。

本発明方法は、特異的結合剤が利用可能である限り、すべての型の被検体の定量 に使用することができる。しかしながら、本発明方法は他の定量方法がより複雑 である、生物学的活性材料例えば医薬、ウィルス及び特にはホルモンの定量につ いて最も価値があると考えらユるう被検体としては、単純な水溶液からあらゆる 型の生物学的流体に至る任意の流体に存在するものとすることができるが、体液 中の濃度の定量が特に重要な領域である。他の成分の存在又は不在は、それらの 成分が被検体の結合を妨害しない限り、問題とはならない、ホルモンは、内因性 結合ホルモンをも含む流体中に存在するものでもよいが、このことは必須の事項 ではない。

結合剤は、問題の流体中に存在する他の成分と比較して、問題の被検体に特異的 な結合部位を有するものである限り、広い範囲のものを使うことができる。ホル モン又は池の天然に存在する生体化学物質の濃度を定量する場合には、問題の化 学物質の、簡単に得ることのできる抗体を使うことが有利である。

しかしながら、他の結合剤例えンス結合性タンパク質又は受容体調合物（問題の 化学物質が通常結合する身体の領域から誘導した、受容体部位を含む調合物）を 使うこともできる。

使用する結合剤は、固体支持体上に不動化することが便利である（もっとも、可 溶性結合剤を使用し、後にこれを沈澱させるか又は分離し、結合部位の占有度を 定量することもできる）。使用する固体支持体は、前記の目的に通常使用するも の、例えば、セルロース、ポリサッカライド例えばセファデックス（５ｅｐｈａ ｄｅｘ　：登録商標）等であることができる。本発明の好ましい態様に基づいて 、体液中の被検体濃度を、身体から体液を取り出さずに、定量する場合において は、□前記支持体は、身体の適当な部分に導入するのに便利な任意の形、例えば 、ｌ　ＩＪスチレン又は他の剛性で無害のプラスチック材料から成るプローブの 形であることができる。

選択する結合剤は、その平衡定数Ｋａｂ　（前記の式参照）が、流体中における 被検体の予想濃度において被検体によって塞がれる結合部位の割合が１００％よ シ可成り下、更に好ましくは７５係未満であるものであることが好ましい。これ によって、種々の濃度に対する一層大きな感度が提供される。従って、選択する 結合剤は、抗体上の結合部位の占有度かできるだけ高くそして平衡定数もできる だけ高いことが望ましい、ホルモン濃度の公知のラジオイミーノア、・セイ測定 法において開用するために選ばれる抗体とは、熱力学的特性の点で異なっている 。

その存在を認識することのできる試薬例えば放射性ラベルを付した形の被検体に よる、非占有部位への結合を含む方法により、結合剤上の結合部位の占有度を決 定する場合には、平衡定数Ｋａｂは、結合部位の実質的な割合が有利には少なく とも２５チ占有されるものであることが好ましい。なぜなら、これによって、最 終測定において感度がより大きくなるからである。前記の事情の下では、結合剤 の平衡定数は、これが５０係に近い結合部位占有度に導くので、予想される被検 体濃度の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　）に近いことが好ましい。

前述の結合性タンパク質上の結合部位の占有度を定量する種類の方法は、最も広 い形での本発明の必須の部分ではなく、種々の方法を使うことができる。

これらの中で最も簡単なものは、非占有部位と結合するラベル付き試薬を使用す ることによる、非占有部位の逆滴定であるが、サントイ、チ型又は複部位法も使 うことができる。あるいは、占有度合は、その場にある生物学的又は他の手段に より測定することができる。

逆滴定検出法を使用する場合には、被検体の結合剤からの早期解離のために生ず る測定誤差を避けるために、被検体の非結合解離定数が低い結合剤を使うことが 好ましい。平衡に達する速度は遅くてもよいが、被検体に対して使用する結合剤 の量が充分に少ない場合には、比較的速く平衡に達することが必要である。平衡 に達する前に測定を行ない、その結果から含有濃度を推定することも可能である が、この方法は操作を複雑にし、正確度を減するので、推８ 奨されるものではない。

前記試験方法に対して少量の結合剤の使用にあたり、存在する占有及び非占有結 合部位の絶対数は一般に少しなので、非占有結合部位の割合を決定するために逆 滴定用の高特異的活性のラベル付き試薬をもつことがよシ重要になる。従って、 通常の放射性同位体ラベルの代わりに、他の型のラベル例えば螢光ラベルを使う ことが望ましい。

被検体のラベル付は用に、非常（で高い特異的活性をもつ螢光ラベル等を使用す ることの更に有利な点は、それらの使用により、例えば適当なグラスチック材料 の表面上に付着する〔ラベル付き抗体及び（又は）ラベル付き被検体を含んでな る〕螢光ラベルの分配の走査に依存する非常に高感度の多波検体分析の開発を可 能にする点である。種々の抗体の混合物で「グリント」され、続いて試験下の生 物学的流体に露出される前記表面は、同−試料中の多数の異なる被検体の濃度を 知るために使用することのできる可能性がある。かかる要求があると考えられる のは、ウィルス性抗原及び（又は）抗体、腫瘍性抗原、ホルモン等の複合混合物 の存在に対して血液をモニターすることである。

「イミュノメータ」、すなわち上記段落で議論した被検体濃度検出装置、の概念 は、研究及び日常的臨床診断において大きな変化をもたらすものと考えられる。

例えば、ステロイド及び甲状腺ホルモンの水準を、現在一般的に行なわれている ように血液試料を分析することによってではなり、グラスチックプローブを２〜 ３分間被検者の日中に挿入して唾液中に存在するホルモンの存在状態水準に露出 してからグラスチックプローブにおける抗体結合部位占有度を検査することによ って、結果的にモニターをすることができる。

以下の実施例によって、本発明の基礎を更に説明体液中に存在するホルモンに対 する抗体を、ｐＨ８，７ｆ　０．０５　Ｍバルビタールパツフア−中で希釈し、 得られる流体をポリスチレン製のプラスチック支持体の形のプローブに、２〜１ ６時間雰囲気温度で露出する。次にこのプラスチック支持体を取り出し、充分に 洗うと、公知の方法によって親和性（平衡定数）及び結合容量を査定した後で、 本発明方法によって適当な流体中のホルモンの濃度を評価するプローブとして使 うことができる。

例　２ ウエーズのカルディフ（Ｃａｒｄｉｆｆ　）のウェルシュ・ナショナル・スクー ル・オブ・メディシン（ＷｅｌｓｈＮａｔｉｏｎａｌ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ　）　、テノビラス・インスティテユート・フォー・カンサー・ リサーチ（ＴｅｎｏｖｉｒｕｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　）で得た、ヒドロコルチゾン（コルチソル）に対する抗体を、 固体支持体と結合させ、得られた材料の平衡定数（Ｋａｂ　）及び結合容量をス キャチアード（５ｃａｔｃｈａｒｄ　）分析法によって測定したところ、それぞ れ２×１０１１モル及び１００ｐモル／ｍｌであった。

ゼラチン（イングランド、ゾーンのＢＤＨＣｈｅｍｉｃａｌｓＬｔｄ、の扁４４ ０４５）０．１重量％を含む、０．０５ＭＫＨ２ＰＯ４及び０．１５　ＭＮａＣ ｔ（ｐＨ７，４）のハｙ　７７−溶液（以下、ＰＢＳと称す）中と１純粋のコル チンル（イングランド、ゾーンのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、のＨ４ ００１）を溶かすことによって、コルチンルを１１００ｐ。

１ｎＭ、１０ｎＭ、１１００ｎ及び１μＭの濃度で含むコルチンル標準溶液を調 製した。

コルチン及１０ｆ 量の抗体調合物を、それぞれ０．　２、０．４及びＱ，　８ｍｌの容量のコルチ ソル標準溶液の各試料と２０℃で平衡に達するまで（１６時間、もっとも実用上 は２０分間以内に平衡が達成された）インキュベートした。

インキ−ベートした後、試料を氷上で４℃に冷却し、固体材料をＰＢＳで充分に 洗った。

コルチソルによる抗体結合部位の占有度合は、ウェールズ、カルディフのＲＩＡ 　Ｌｔｄから得た、高時異的沃素化コルチソル（約１　０　０　０　Ｃｉ／ｍモ ル　■）をラベル付キ材料として使う、ラノオイミーノアノセイ逆滴定により、 各々の場合に、決定した。

濃縮した１２５エーコルチソルを各試料中に加えて、固体材料と混合し、インキ −ベートを４℃で１時間続けた。固体材料を再び充分に洗い、結合した放射活性 を決定した。添付図面は、標準溶液の試料のコルチンル濃度（ｎＭ）と観察され た放射活性（１分間当りのカウント数）との関係を示すグラフである。

実験誤差の範囲内において、結合放射活性の水準はコルチソル同一濃度の３種の 試料すべてにおいて同一であシ、それらの容量の差によっては影響を受けなかっ た。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 昭和５９年４月ユ２日 特許庁長官　若　杉和夫殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８３１００２１０ ２　発明の名称 被検体の濃度の測定 ３　特許出願人 氏　名　イーキンス、ロジャー　フィリップ４代理人 住　所　東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル５　補正書の提出年 月日 １９８４年３月２日（受理臼） ６　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１通 補正　請　求　の　範　囲 １、被検体に対して流体中の他の成分に対するよりも特異的な結合部位を有する 結合剤と流体とを接触させ、被検体が結合剤に結合する程度を表わす数値を決定 し、その数値から流体中す被検体濃度を定量することによって、流体中の被検体 の存在状態濃度を測定する方法において、流体中の遊離被検体の全濃度に対して 高だか有意でない効果を与える痕跡量で前記結合剤を使用し、結合剤上の結合部 位の占有度割合を表わす数値を決定して流体中の被検体濃度を定量するのに使用 し、必須の中間工程として、結合剤と接触させる流体中の被検体の全量の評価を 行なうことなく、そして結合剤と接触した流体の容量の正確な測定を必ずしも必 要でないものとしたことを特徴とする、流体中の被検体の存在状態濃度を測定す る方法。

２　前記被検体が生物学的活性材料であり、前記結合剤が前記被検体の抗体であ る請求の範囲第１項記載の方法。

３　前記の生物学的活性材料がホルモンであシ、前記流体が遊離ホルモンの他に 内因性結合ホルモンを含んでおり、前記の遊離ホルモンの濃度だけを定量する請 求の範囲第２項記載の方法。

４　前記結合剤と接触させる流体の容量の正確な測定を行なわない請求の範囲第 １項記載の方法。

５　前記結合剤を、固体支持体上に不動化した状態で前記流体と接触させ、結合 剤と固体支持体とを流体から分離し、続いて結合部位の占有割合を表わす数値を 決定する請求の範囲第１項記載の方法。

６　前記流体が体液であシ、体液中に導入及び体液から取り出すことのできるゾ ローブ上に前記結合剤を不動化した請求の範囲第１項記載の方法。

７、　流体中における被検体の予想濃度において被検体が占有する結合剤の結合 部位が７５係未満となる、被検体の結合部位に対する結合の平衡定数を存するも のの中から結合剤を選ぶ請求の範囲第１項記載の方法。

８、　流体中における被検体の予想濃度において被検体が占有する結合剤の結合 部位が２５係を越えるものとなる、被検体の結合部位に対する結合の平衡定数を 有するものの中から結合剤を選ぶ請求の範囲第７項記載の方法。

９　結合剤の結合部位の占有度割合を表わす数値を、螢光ラベルを付した試薬を 使用する逆滴定によって決定する請求の範囲第５項記載の方法。

１０　生きている生物体から体液試料を取り出すことなく、生きている生物体の 体液中の被検体の濃度を測定する装置であって、 体液の他の成分に対するよシも被検体に対して特異的な結合部位を有する結合剤 を不動化して担持し、体液中に導入し及び体液から取シ出すように設計した固体 プローブであること、及び前記結合剤が、体液中へのプローブの導入によっては 体液中の遊離被検体の全濃度に高だか有意でない効果しか与えない痕跡量で存在 することを特徴とする前記の装置。

国際調査報告　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　被検体に対して流体中の他の成分に対するよりも特異的な結合部位を有す る結合剤と流体とを接触させ、被検体が結合剤に結合する程度を表わす数値を決 定し、その数値から流体中の被検体濃度を定量することによって、流体中の被検 体の存在状態濃度を測定する方法に＝−いて、流体中の遊離被検体の全濃度に対 して高だか有意でない効果を与える痕跡量で前記結合剤を使用し、結合剤上の結 合部位の占有度割合を表わす数値を決定して流体中の被検体濃度を定量するのに 使用し、これによって、結合剤と接触した流体の容量の正確な測定を必ずしも必 要でないものとしたことを特徴とする、流体中の被検体の存在状態濃度を測定す る方法。 ２　前記被検体が生物学的活性材料であシ、前記結合剤が前記被検体の抗体であ る請求の範囲第１項記載の方法。 ３　前記の生物学的活性材料がホルモンであり、前記流体が遊離ホルモンの他に 内因性結合ホルモンを含んでおり、前記の遊離ホルモンの濃度だけを定量する請 求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記結合剤と接触させる流体の容量の正確な測定を行なわない請求の範囲第 １項記載の方法。 ５　前記結合剤を、固体支持体上に不動化した状流体から分離し、続いて結合部 位の占有割合を表わす数値を決定する請求の範囲第１項記載の方法。 ６　前記流体が体液であり、体液中に導入及び一体液から取り出すことのできる グローブ上に前記結合剤を不動化した請求の範囲ｇ１項記載の方法。 ７　流体中に２ける被検体の予想濃度において被検体が占有する結合剤の結合部 位が７５チ未満となる、被検体の結合部位に対する結合の平衡定数を有するもの の中から結合剤を選一ぶ請求の範囲第１項記載の方法。 ８　流体中における被検体の予想濃度において被検体が占有する結合剤の結合部 位が２５チを越えるものとなる、被検体の結合部位に対する結合の平衡定数を有 するものの中から結合剤を選ぶ請求の範囲第７項記載の方法。 ９　結合剤の結合部位の占有度割合を表わす数値を、螢光ラベルを付した試薬を 使用する逆滴定によって決定する請求の範囲第５項記載の方法。 １０、生きている生物体から体液試料を取シ出すことなく、生きている生物体の 体液中の被検体の濃度を測定する装置であって、 体液の他の成分に対するよシも被検体に対して特異的な結合部位を有する結合剤 を不動化して担持し、体液中に導入し及び体液から取シ出すように設計した固体 プローブであること、及び前記結合剤が、体液中へのゾロープの導入によっては 体液中の遊離被検体の全濃度に高だか有意でない効果しが与えない痕跡量で存在 することを特徴とする前記の装置。