JPS5953033B2 - 微生物培養法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は炭化水素或いは炭化水素誘導体を主炭素源とし
て微生物を培養するに際し、その培地中にトルロプシス
（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属酵母が産生する糖脂質を添
加して微生物を培養する方法に関する。

炭化水素又はその誘導体を主炭素源とする発酵生産研究
は近年著しい進歩を遂げ、微生物菌体蛋白質の生産が実
用化段階に達しているのを筆頭に、各種アミノ酸、核酸
関連物質、ビタミン、有機酸、糖質或いは抗生物質等の
生理活性物質の生産等幅広く多岐に渡っており、従来、
糖質を主炭素源とする発酵により生産されていたものは
殆んどその糖質を炭化水素に代替することが可能になっ
てきている。

一方炭化水素又はその誘導体は、炭素と水素のみを構成
元素とするか、或いはこれらを主構成元素とし、その他
の若干の元素、例えば酸素、ハロゲン等を含むものであ
り、多数の酸素を含む糖質に比べて、単位重量当りの有
効炭素の存在量が約２倍であり、発酵炭素源としては、
糖質より明らかに有利である。

しかしながら、炭化水素又はその誘導体を炭素源として
発酵を行う場合には、その物理的、化学的性質から、次
に掲げるような問題点を有する。

その１つは、炭化水素又はその誘導体は分子中に酸素を
含まないか、含んでも僅かであるために、微生物を生育
させるためには非常に多量の酸素の供給を必要とするこ
とであり、もう１つは、炭化水素又はその誘導体は水に
不溶性であるために、微生物による取り込み様式が糖質
等の水溶性炭素源とは異なっており、取り込み速度が小
さく、生育速度は一般的には糖質炭素源による場合の約
半分であると言われている。

第１の酸素供給の問題に対しては、近年、培養工学の著
しい進歩によって、効率の良い酸素供給を行える発酵槽
の工夫改良によって解決されつつある。

しかし第２の問題である炭化水素又はその誘導体を微生
物に効率良く取り込ませる点については、水不溶性基質
と微生物との単純な機械的接触チャンスの頻度に依るも
のと考えられ、水不溶性基質のｉ機械的物理的乳化分散
方法、ｉｉ界面活性剤等による物理化学的乳化分散方法
の工夫にその努力が集中されてきたが、いずれも限定さ
れた微生物に応用できるにすぎない。

このような炭化水素又はその誘導体のような水不溶性基
質を強制的に微生物に取り込ませる人為的な方法は、微
生物自体の生理的性質を無視した方法であり、実用的に
はあまり成果のないものであった。

これら結果は、水不溶性基質の微生物による取り込み機
構は、主として、微生物自身の生理的性質に基づくもの
であることを示唆するものであり、本発明者らは、この
観点から検討を加えた結果、水不溶性基質を資化する微
生物は、次のいずれかの水不溶性基質を取り込む固有の
機構を有していることがわかった。

即ちｉ微生物自身が細胞表層に水不溶性基質と親和性の
大きな組織体を有していること、ｉｉ微生物自身が菌体
外に水不溶性基質を取り込み運搬（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
）する機能を有する物質を産生じ、積極的な取り込みを
行っていることである。

ｉの機構はその微生物の本来の機能であって、人為的に
調整することのできないものと考えられるが、ｉｉの機
構は、その物質を把えてコントロールすれば調整可能で
あると考えられる。

本発明者らは以上の考察をもとにさらに検討した結果、
炭化水素或いはその誘導体を主炭素源として微生物を培
養する際に、培地に下記の一般式（Ｉ）で表わされる糖
脂質を添加すれば、これらの炭素源がすみやかに取り込
まれ、微生物の生育が促進されることを見出し本発明を
完成した。

（式中Ｒ１、Ｒ２はＨ又は−ＣＯＣＨ３、Ｒ３はＨ又は
−ＣＨ３、Ｒ４は、Ｒ３がＨのときは炭素数１２〜１６
の飽和又は不飽和の炭化水素基、Ｒ３が−ＣＨ３のとき
は炭素数１１〜１５の飽和又は不飽和の炭化水素基を示
す。

）一般式（Ｉ）で表わされる糖脂質は、トルロプシス（
Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属のある種の酵母、例えば、ト
ルロプシス・マグノリエ（Ｔ、 ｍａｇｎｏｌｉａｅ）
、トルロプシス・アビコーラ（Ｔ、 ａｐｉｃｏｌａ）
、トルロプシス・グロツペンギーゼリ （Ｔｏｇｒｏｐｅｎｇｉｅｒｓｓｅｒｉ）、トルロプシ
Ｘ−ボンヒコーラ（Ｔ、 ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）等によ
って産生されることが知られている （Ｊ、Ｆ、Ｔ、５
ｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ。

Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ３９ 、 ８４６（１９６１））。

この場合、産生される糖脂質は、次の式（Ｉ）及び（Ｉ
Ｉ）で表わされる化合物、及び式（ＩＩ）の糖ラクトン
結合位置の異なる異性体（ＩＩＩ）からなる混合物であ
る。

以下本明細書では、これらを総称してソホロリピッド（
ＳＬと略すことがある）と呼ぶ。

式（Ｉ）：■−ａ；Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＯＣＨ３■−ｂ；Ｒ
１−ＣＯＣＨ３、Ｒ２＝ Ｈ Ｉ−Ｃ；Ｒ□＝Ｈ，Ｒ２−Ｃ０ＣＨ３ Ｉ −ｄ ； Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ （式中Ｒ３及びＲ４は前記に同じ） ＩＩ−ａ；Ｒ１−Ｒ２＝Ｃ０ＣＨ３ ＩＩ −ｂ ： Ｒ１＝ＣＯＣＨ３、Ｒ２＝ ＨＩＩ−
Ｃ；Ｒ１＝Ｈ，Ｒ２−Ｃ０ＣＨ５ ＩＩ ｄ ； Ｒ１＝ Ｒ２＝ Ｈ ソホロリピツドは、例えば、トルロプシス・ボンビコー
ラの培養液から、酢酸エチル、クロロホルム或いはエチ
ルエーテル等の糖脂質を溶解する有機溶媒で抽出するか
、ソホロリピッドが培養液中で沈殿する性質を利用して
分離することによって粗ソホロリピツドを得、これに培
養液の成分、例えば脂溶性の物質が爽雑している場合は
、ソホロリピツドを溶かさず、脂溶性物質のみを溶解す
る有機溶媒、例えば、ｎ−ヘキサン、石油エーテル等で
数回洗浄して精製するのが望ましい。

本発明においては、式（Ｉ）で表わされる糖脂質を含む
上記ソホロリピッド混合物をそのまま添加しても良いし
、ソホロリピッド混合物から、式（Ｉ）で表わされる糖
脂質を分離して用いても良い。

式（Ｉ）で表わされる糖脂質は、例えば、上記ソホロリ
ピツド混合物を、水中に分散溶解させ、放置して沈殿す
る成分（主に式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）から成る、以下
本明細書中では水不溶性ソホロリピツドと呼ぶことがあ
る）と、水中に溶解している成分（主に式（Ｉ）で表わ
される糖脂質からなる、以下本明細書中では水溶性ソホ
ロリピツドと呼ぶことがある）とに分画することによっ
て混合物から分離することができる。

分画に当っては、一般的には、ソホロリピツド混合物を
水中に分散溶解させることによって行うことができるが
、処理時間を短くするためには、温水中にソホロリピツ
ド混合物を超音波処理等によって強制的に分散溶解させ
、次いで低温に放置して水不溶性ソホロリピットを沈殿
させ、ろ過等によってろ液と沈殿に分け、ろ液を減圧蒸
留により大部分の水を除き、真空乾燥する等９方法によ
り水溶性ソホロリピツドの固体を得るのが適当である。

また前記ソホロリピツド混合物を、メタノール、エタノ
ールなどの低級アルコール水溶液に溶解させ、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム等のアルカリ試薬と共に加熱
して、ソホロリピツドのグリコシド結合を分解せずに機
上のアセチルエステル結合及びラクトン結合のみを切断
（加水分解）してほぼ全量を式ＣＩ−ｄ）で表わされる
糖脂質（以下本明細書ではアシッドソホロリピッドと呼
ぶことがある）に変換して使用することもできる。

本発明の式（Ｉ）で表わされる糖脂質による微生物の炭
化水素又はその誘導体の取り込み促進機構は、通常の合
成界面活性剤が有する非水溶性基質である炭化水素又は
その誘導体を乳化分散させる作用機能とは全く異なるも
のであることがわかった。

即ち、ｎ−パラフィン培地で慣習的に用いられている非
イオン性合成界面活性剤であるポリオキシエチレンアル
キル（Ｃ工２−０２゜）エーテル、ポリオキシエチレン
アルキル（Ｃ８Ｃ９）フェニルエーテル、ポリオキシエ
チレン高級脂肪酸（０□２ Ｃ１）エステル、ソルビ
タン高級脂肪酸（Ｃ１２−Ｃ１８）エステル、ポリオキ
シエチレンソルビタン高級脂肪酸（Ｃ１□−０１８）エ
ステル、ポリオキシエチレンソルビトール高級脂肪酸（
Ｃ１□−Ｃ□８）エステル、高級脂肪酸（Ｃ１２−０１
８）モノグリセリド、及び高級脂肪酸（Ｃ１゜−Ｃ１８
）ショ糖エステル等を同条件で添加しても、本発明の糖
脂質のような微生物促進効果は得られない。

主炭素源として使用される炭化水素又はその誘導体には
、一般的に水不溶性炭素源として使用されるものはいず
れも含まれるが、炭素数８〜２０の炭化水素又はその誘
導体が適当であり、特に炭素数１０〜１８のｎ−アルカ
ンが好適であり、著しい促進効果が見られる。

炭化水素は単品として用いても良く、それらを含有する
混合物である石油留分（例えば灯油、ケロシン留分等）
でも良いことは勿論である。

さらに不飽和結合を有する炭化水素類（アルケン、α−
オレフィン）、酸素を有する誘導体（アルコール、脂肪
酸、脂肪酸エステル等）、ハロゲン原子を有する誘導体
（アルキルハライド等）を主炭素源として用いても本発
明の微生物促進効果が見られる。

これらの炭素源は、培地中に０．２〜１０％ｗｔ／ｖ存
在させるのが適当である。

式（Ｉ）で表わされる糖脂質は、培地中に０、００２７
％ｗｔ／ｖ以上添加すれば有効であることがわかった。

従って、水溶性ソホロリピツドを添加する場合はこの量
以上で有効であり、また、これを含む混合ｖＩＪ（ソホ
ロリピツド混合物）を添加する場合には、その含有率７
よ種々に変わり得るので、水溶性ソホロリピツドに換算
して上記の量以上を使用すれば有効である。

添加量を増加すれば生育促進効果は向上するが、実用上
水溶性ソホロリピツドとして０．００２７〜０．２％ｗ
ｔ／ｖ添加するのが良い。

本発明による微生物の培養にあたって、その他の培養条
件は、炭化水素又はその誘導体を主炭素源とする微生物
培養に採用される通常の条件で行うことができる。

例えば窒素源としてはペプトン、酵母エキス、肉エキス
、コーンスチープリカー、アミノ酸、カザミノ酸、硝酸
アンモニウム等を用いることかで゛き、またカリウム、
ナトリウム、マグネシウム、リン等の無機イオン等も通
常使用されるものを使用することができる。

培養温度も通常の温度で浪いが、１８〜３７℃程度が好
適である。

式（Ｉ）で表わされる糖脂質の添加による炭化水素又は
その誘導体を主炭素源とする微生物発育促進効果は、広
く炭化水素又はその誘導体を資化する微生物に見られる
が、具体例を挙げれば、酵母では、子のう菌酵母に属す
る炭化水素資化性酵母の例としては、メチニコビア （Ｍｅｔｓｈｎｉｋｏｗｉａ）属に属するメチニコヒア
・プルヒエリマ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌ
ｃｈｅｒｒｉｍａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属す
るピヒア・ファリノーザ（Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏ
ｓａ）等があり、またウステイラジイナーＬ／ ス（Ｕ
ｓｔｉｌａｇｉｎａｌｅｓ）酵母に属する炭化水素資化
性酵母の例としては、ロドスポリデイウム（Ｒｈｏｄｏ
ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属酵母があり、また無胞子酵母に
属する炭化水素資化性酵母の例としては、キャンデイダ
（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属するキャンデイダ・モギー（
Ｃａｎｄｉｄａ ｍｏｇｉｉ）、キャンテ゛イダ・リポ
リテイカ （Ｃａｎｄｉｄａ １ｉｐｏ１ｙｔｉｃａ）
、）／１，１ニア７゜シス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属
に属するトルロプシス・ボンビコーラ（Ｔｏｒｕｌｏｐ
ｓｉｓ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、トルロプシＸ−グロツ
ペンギーゼリ （Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｇｒｏｐｅｎｇ
ｉｅｓｓｅｒｉ ）、トルロプシス・アヒコーラ（Ｔｏ
ｒｕｌｏｐｓｉｓ ａｐｉｃｏｌａ）、トルロプシス・
マグソリｙ−（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｍａｇｎｏｌｉ
ａｅ）等がある。

本発明によれば、従来炭素源たる炭化水素又はその誘導
体の取り込みが遅く、従って微生物の生育速度が遅く、
そのため培養に長時間を要していたものが、大いに短縮
されることとなった。

以下に本発明をさらに良く理解できるように、参考例、
試験例、及び実施例をもって説明するが、本発明はこれ
らの範囲に限定きれるものではない。

参考例 １ ソホロリピツドの調製 グルコース５００ｇ、酵母エキス２５ｇを５１の脱イオ
ン水に入れ、均一に溶解したのち、サフラワー油５００
ｇを加えた培地を１０１容量のジャーファメンターに入
れ、ジャーファメンターの中で滅菌をして培地液を調整
した。

ついであらかじめ滅菌しであるグルコース２．５ｇと酵
母エキス０．２５ｇとで調製した５０ｍ１の培養液の入
った振盪フラスコに、トルロプシス・ボンビコーラＡＴ
ＣＣ２２２１４を接種し、２５℃の温度で２日間振盪培
養し、充分菌が生育した培養液を全量接種菌液として、
上記のジャーファメンターに無菌的に接種した。

接種後、温度３０℃、攪拌数３００Ｏｒｐｍ、通気量ｌ
ｖｖｍ（１分間に培地と同量の空気）の培養条件下で７
日間発酵を行った。

発酵終了後、発酵液を取り出し、１０１容量の内径１５
ｃｍの円筒型分相分離管に移し、５０℃で発酵液中のソ
ホロリピツド留分の沈降分別を行った。

必要に応じて、数百ｍｌの酢酸エチルを添加し、ソホロ
リピツドの沈降分別を早めた。

次いで下層に沈降したソホロリピツド留分を抜き取り、
ロータリーエバポレーターで大部分の含有する水を留出
させ、ソホロリピツド濃縮物を７５０ｍ１の酢酸エチル
で抽出を行い、酢酸エチル抽出液を無水硫酸ソーダで脱
水したのち、ロータリーエバポレーターで大部分の酢酸
エチルを留去し、ついでｎ−ヘキサン２００ｍ１で２回
洗浄抽出したのち、ｎ−ヘキサン不溶分であるソホロリ
ピツドをシャーレの中に皮膜状に広げ、真空乾燥機の中
で、恒量に達するまで減圧乾燥した。

この操作により約３８０ｇのソホロリピツド（式（Ｉ）
、け■）及び（ＩＩＩ）であられされるものの混合物で
あり、その脂肪酸部分の炭素数が１６及び１８のものを
主体とする）を得た。

尚、発酵液の量が１１以下であれば上記操作のうちの分
相管による沈降分別操作を省略し、直接当量の酢酸エチ
ルで抽出し、得られる酢酸エチル層を上記の方法で処理
しても同様のソホロリピツドを得ることができる。

参考例 ２ 水溶性ソホロリピツドの調製 参考例１で得られたソホロリピツド３ｇを５００ｍ１の
フラスコに入れ、脱イオン水３００ｍ１を添加し、超音
波発信機によって超音波分散させた。

そのまま４℃で５日間放置し、沈殿物とる液にわけ、沈
殿物をそのまま真空乾燥して非結晶性の白色固体的２．
８ｇを得た。

これを水溶性ソホロリピツドとした。

ろ液は大部分の水を減圧で留去したのち、真空乾燥し、
非結晶性黄色固体物誓約０．８ｇを得た。

これを水溶性ソホロリピツドとした。

参考例 ３ アシツドソホロリピツドの調製 参考例１で得たソホロリピツド５ｇを１００ｍ■丸底フ
ラスコに採り、ついで、水１０ｍ１及びエタノール２５
ｍ１加え均一溶解したのち、水酸化カリウム０．５ｇを
加えて、２時間還流反応をさせる。

反応終了後希硫酸水溶液で沖和し、析出する硫酸カリウ
ムを戸別し、Ｐ液をロータリーエバポレータで減圧留去
し、残分として４．３ｇを得た。

本反応物質をシリカゲル薄層クロマト分析〔展開剤、ク
ロロホルム−メタノール−酢酸（７０：２５：５）、ｌ
を行うとＲｆ値０．３３にアンスロン発色試薬にて青
緑色に発色する単一スポットを与える。

ついで、本物質全量を５ｍｌのクロロホルムに溶かし、
シリカゲル５０ｇを充てんした内径１ｃｍ長さ５０ｃｍ
のカラムクロマトにてクロロホルム−エタノール（クロ
ロホルム１００部から０部、エタノール０部から１００
部）の溶出溶媒にてクロマト分離を行い、上記の薄層ク
ロマト分析にて、Ｒｆ値０．３３に相当する溶出留分を
集め、溶媒を留去し、精製物４．１ｇを得た。

本精製物は白色固形状物質であり、これがアシツドソホ
ロリピツドである。

本アシツドソホロリピツドをＫＢｒ錠剤法にて赤外スペ
クトル分析を行うと、３３８０〜３２００ｃｍ ’にか
けて糖の水酸基に由来する幅広い吸収帯、２８００ｃｍ
−１前後に脂肪族のメチレン及びメチル基に由来する強
い吸収帯、１７００ｃｍ−１に遊離カルボキシル基に由
来する吸収帯及び９００〜７５０ｃｍ ”にかけてグル
コビラノース環に特有な吸収帯を与える。

ピリジン溶媒中での核磁気共鳴スペクトル分析に於いて
、６５．５前後に不飽和脂肪酸に特有な二重結合の吸収
スペクトル、δ３．５〜５．０にかけ糖構造に由来する
幅広い吸収スペクトル及びδ１．１〜１．６にかけてメ
チレン基に由来する強い吸収スペクトルを与えた。

ついで、本精製物０．１ｇを１０ｍ１の５規定のＨＣｌ
−メタノール溶液中で１時間還流反応させ、メチルグリ
コキサイドとヒドロキシメチルエステルとなし、その各
々をガスクロマ１へグラフィー分析で定量分析した結果
、メチルグリコキサイドとヒドロキシ脂肪酸メチルエス
テルが２モル対１モルの比であることを確認した。

以上の結果より、本精製物はアシツドソホロリピツドで
あることを支持された。

試験例 １ 参考例１で得たソホロリピツドを０．７５ｗｔ／ｖ％酵
母用の炭素化合物同化試験用乾燥培地（Ｂａｃｔ。

Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ： Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
、社（米国ミシガン州）の商標）及び５ ｖ／ｖ％のｎ
−ヘキサデカンを配合した滅菌培地に、０．０６４ｗｔ
／ｖ％の濃度で無菌操作で添加し、次いでＹＭ寒天培地
に生育しているトルロプシス・ボンビコーラ（Ｔｏｒｕ
ｌｏｐｓｉｓｂｏｍｂｉｃｏｌａ） ＫＳＭ −３６ノ
コＴニア ニーを白金耳で採り、生理食塩水中で菌体濃
度が６５０部ｍの吸光々変針で測定したときの吸光度が
０．５〜０．６になるように調製した菌懸濁液を上記の
培地に対して２％、場合によっては１０％の量まで接種
し、３０℃で培養し、菌体の生育を観察した。

生育度の観察は、培養液の一部或いは全部を採取し、必
要に応じて鉱酸、例えば希塩酸或いは希硫酸により採取
した培養液のｐＨを２〜３に調整したのち、２倍量の酢
酸エチルで２回培養液を洗い、得られた菌体を含む水相
部を５５Ｑｎｍの吸光々変針で測定できる濃度に脱イオ
ン水で希釈したのち、水相部の吸光度を測定して行った
。

同一条件でソホロリピツドを添加しない場合との比較を
表１に示す。

表１の結果よりソホロリピツド混合物の添加により、明
らかに菌の生育が促進されることがわかる。

試験例 ２ 培地としてｎ−ヘキサテ勿ン（５％）−炭素化合物同化
試験用乾燥培地（０，７５％）−酵母エキス（０，２％
）培地（以下ＤＮＢ−ＹＥ培地と略す）を用いて、その
他は試験例１と同様な条件で培養を行い、ソホロリピツ
ド添加による生育の経口変化を調べた。

結果は表２の通りである。試験例 ３ 培地として各種ｎ−アルカン（５％）−炭素化合物同化
試験用乾燥培地（０，７５％）−酵母エキス（０，２％
）培地を用い、その他は試験例１と同様な条件で培養を
行い、ソホロリピツド添加による生育促進効果を調べた
。

結果を表３に示す。試験例 ４ ソホロリピツドに代えて、参考例２で得られた水溶性ソ
ホロリピツド及び水不溶性ソホロリピッドを用い、培養
日数が４日である以外は試験例２と同一条件で培養を行
ない、生育度を測定し、表４に示す結果を得た。

この結果より、ソホロリピッドによる微生物生育促進効
果は、水溶性ソホロリピッド〔式（Ｉ）で表わされる糖
脂質〕に依るものであることがわかる。

試験例 ５ 水溶性ソホロリピツドを約２７％含有するソホロリピツ
ド（参考例１で調整したもの）の添加量を変化させ、７
日間培養させた以外は試験例２と同様な条件で微生物を
培養し、その生育度を求めた。

結果を表５に示す。この結果からソホロリピツド添加量
が培地に対して０．０１％ｗｔ／ｖ以上で有効であるこ
とがわがり、水溶性ソホロリピッドの有効添加量は、そ
のソホロリピツド中の含有量から０．００２７％ｗｔ／
ｖ以上であることがわかる。

試験例 ６ 培地としてｎ−ヘキサデカン（２％） ＝ＤＮＢ−ＹＥ
培地を用いた他は試験例１と同様の条件で培養をおこな
い表６に示す結果を得た。

実施例 １ あらかじめ、酵母用炭素化合物同化試験用乾焔培地（Ｂ
ａｃｔｏ −Ｎｉｔｒｏｇｅｎ −ｂａｓｅ、以下ＤＮ
Ｂと呻す。

米国Ｄｉｆｃｏ社製）を０．７５％、酵母エキス（Ｙｅ
ａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、以下ＹＥと略す。

大五栄養器製）０．２％を配合した液体培地（以下ＤＮ
Ｂ −ＹＥ培地と略す。

）を調製し、内径２ｃｍ長さ２０ｃｍの名試験管に４ｍ
ｌずつ入れた。

次いでｎ−ヘキサデカンを０．５ｍｌ加えたのち、１１
５℃、３０分間蒸気滅菌した。

次にあらかじめ滅菌しである脱イオン水１０ｍにソホロ
リピツドを無菌的に加え、加温して均一に分散し、上記
ｎ−ヘキサデカン−ＤＮＢ−ＹＥ境地にその０．５ｍｌ
を無菌的に加えた。

ついでグルコース−酵母エキス−麦芽エキス（ＹＭ培地
、米国Ｄｉｆｃｏ社製）寒天培地で３０℃、２日間生育
させたトルロプシス・ボンビコーラ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓ
ｉｓｂｏｍｂｉｃｏｌａ）を白金耳で採取し、あらがし
め滅菌しである生理食塩水１０ｍ１に無菌的に加え、そ
の菌懸濁液の６５０ｎｍ波長の吸光々変針で測定したと
きの吸光度が０．５〜０．６になるよう調製した菌懸濁
液をつくり、その０．５ｍｌを採取して無菌的に上述の
ｎ−ヘキサデカン−ＤＮＢ−ＹＥ−エチルソホロリピツ
ド培地に加えた。

温度３０℃、毎分１２０回往復振盪する振盪培養機で５
日間菌体を生育させた。

培養終了後、培養液の液性を測定し、必要に応じて希塩
酸でｐＨ２−３に調整し、振盪試験管に培養液の２倍量
の酢酸エチルを入れて抽出を行った。

抽出操作を２回行った後、培養液水相部をよく振って均
一な菌懸濁液にし、その０．５ｍｌを採取し、１５ｍ１
容量の試験管に移し、脱イオン水で１０倍に希釈し、５
５Ｑｎｍの波長の吸光度を測定し菌の生育度”を求めた
。

結果は表７に示す通りであった。

実施例 ２ メチニコビア（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）属酵母ノ
ｎ−ヘキサデカン炭素源培地での生育に対するソホロリ
ピツドの生育促進効カニ方法は実施例１と同様にして行
い、その結果を表８に示す。

実施例 ３ ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母のｎ−ヘキサデカン炭素
源培地での生育に対するソホロリピツドの生育促進効カ
ニ方法は実施例１と同様にして行い、その結果を表９に
示す。

実施例 ４ トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属酵母の１’１
−ヘキサデカン炭素源培地での生育に対するソホロリピ
ツドの生育促進効カニ方法は実施例１と同様に行い、そ
の結果を表１０に示す。

実施例 ５ キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母のｎ−ヘキサデ
カン炭素源培地での生育に対するソホロリピツドの生育
促進効カニ培養までの方法は実施例１と同様に行い、そ
の後の生育度の測定は、培養液から一定量の培養液を採
取し、適当に希釈したのち、ＹＭ寒天培地で混釈培養な
し、３０℃、７日間培養したとき生育するコロニーの数
を算えて、生育度とした。

その結果を表１１に示す。実施例 ６ 石油資化性酵母のｎ−ヘキサデカン炭素源培地での生育
に対する水溶性ソホロリピツドの生育促進効カニ参考例
２より調製した水溶性ソホロリピツドならびに水不溶性
ソホロリピツドを実施例１の方法に準じて、試験を行い
、石油資化性酵母のｎ−ヘキサデカン炭素源培地での生
育に対する水溶性ソホロリピツドの生育促進効力を調べ
た。

その結果を表１２に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 炭化水素或いは炭化水素誘導体を主炭素源として微
   生物を培養するにあたり、培地に下記の一般式（Ｉ）、 （式中Ｒ１、Ｒ２はＨ又は−ＣＯＣＨ３、Ｒ３はＨ又は
   −ＣＨ３、Ｒ４は、Ｒ３がＨのときは炭素数１２〜１６
   の飽和又は不飽和の炭化水素基を示し、Ｒ３が−ＣＨ３
   のときは炭素数１１〜１５の飽和又は不飽和の炭化水素
   基を示す） で表わされる糖脂質を添加することを特徴とする微生物
   培養法。 ２ 主炭素源が炭素数１０〜１８のｎ−アルカンである
   特許請求の範囲第１項記載の微生物培養法。 ３ 微生物が酵母である特許請求の範囲第１項記載の微
   生物培養法。