JPH08325285A - 新規な細胞接着阻害剤マクロスフェライドａ及びｂ並びにそれらの製造法 - Google Patents
新規な細胞接着阻害剤マクロスフェライドａ及びｂ並びにそれらの製造法Info
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- JPH08325285A JPH08325285A JP7131362A JP13136295A JPH08325285A JP H08325285 A JPH08325285 A JP H08325285A JP 7131362 A JP7131362 A JP 7131362A JP 13136295 A JP13136295 A JP 13136295A JP H08325285 A JPH08325285 A JP H08325285A
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- chloroform
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- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 細胞接着阻害作用という新たな作用機序を有
するマクロスフェライドＡおよびＢ並びにそれらの製造
法を得るものである。 【構成】 ミクロスフェロプシス属に属するマクロスフ
ェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微生物を培地
に培養し、該培養物中にマクロスフェライドＡ及びＢを
蓄積せしめ、該培養物からマクロスフェライドＡ及びＢ
を採取する。 【効果】 細胞接着が深く関与する疾患、例えば癌転
移、あるいは関節炎などの慢性炎症や喘息、アレルギー
疾患に対しての効果が期待される。
するマクロスフェライドＡおよびＢ並びにそれらの製造
法を得るものである。 【構成】 ミクロスフェロプシス属に属するマクロスフ
ェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微生物を培地
に培養し、該培養物中にマクロスフェライドＡ及びＢを
蓄積せしめ、該培養物からマクロスフェライドＡ及びＢ
を採取する。 【効果】 細胞接着が深く関与する疾患、例えば癌転
移、あるいは関節炎などの慢性炎症や喘息、アレルギー
疾患に対しての効果が期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト臍帯静脈血管内皮細
胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄成白血病（ＨＬ−６０）細
胞の接着に関与する接着因子を阻害する新規な細胞間接
着阻害剤マクロスフェライドＡ及びＢ並びにそれらの製
造法に関する。
胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄成白血病（ＨＬ−６０）細
胞の接着に関与する接着因子を阻害する新規な細胞間接
着阻害剤マクロスフェライドＡ及びＢ並びにそれらの製
造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌治療の方法は、主として外科療法、放
射線療法、化学療法に大別される。今日におけるこれら
の方法の技術の向上あるいは新たな制癌剤の開発によ
り、癌の治療率は５０％程にも達している。胃癌や子宮
癌などは集団検診や定期検診等も整備されてきており、
死亡率は減少している一方、最近、食生活や生活習慣の
変化あるいは高齢化により、肺癌、肝臓癌、大腸癌、前
立腺癌などが増加しているのが現状であるが、これらに
対する有効な化学療法剤は未だ満足すべきものはなかっ
た。
射線療法、化学療法に大別される。今日におけるこれら
の方法の技術の向上あるいは新たな制癌剤の開発によ
り、癌の治療率は５０％程にも達している。胃癌や子宮
癌などは集団検診や定期検診等も整備されてきており、
死亡率は減少している一方、最近、食生活や生活習慣の
変化あるいは高齢化により、肺癌、肝臓癌、大腸癌、前
立腺癌などが増加しているのが現状であるが、これらに
対する有効な化学療法剤は未だ満足すべきものはなかっ
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このように、癌の治療
率が５０％を越えた現在、患者のクオリティ・オブ・ラ
イフ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ；以下、ＱＯＬ
と呼称する）の重要性が注目されている。しかしなが
ら、制癌剤は癌細胞に対して直接殺細胞作用を示す事を
指標に開発されているため、効力が強い反面、副作用も
強力である。そこで、治療は勿論のこと、術後の再発や
予後不良を防止するため、従来とは異なる新たな作用機
序を持った化学療法剤の開発が強く望まれていた。
率が５０％を越えた現在、患者のクオリティ・オブ・ラ
イフ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ；以下、ＱＯＬ
と呼称する）の重要性が注目されている。しかしなが
ら、制癌剤は癌細胞に対して直接殺細胞作用を示す事を
指標に開発されているため、効力が強い反面、副作用も
強力である。そこで、治療は勿論のこと、術後の再発や
予後不良を防止するため、従来とは異なる新たな作用機
序を持った化学療法剤の開発が強く望まれていた。
【０００４】癌細胞の血管内皮細胞への接着は癌転移に
おいて重要な役割を担っていると考えられており、接着
阻害は癌転移阻害剤として期待されている。Ａｋｉｙａ
ｍａ，Ｓ．Ｋ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１
８０１１〜１８０１８（１９８９）。
おいて重要な役割を担っていると考えられており、接着
阻害は癌転移阻害剤として期待されている。Ａｋｉｙａ
ｍａ，Ｓ．Ｋ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１
８０１１〜１８０１８（１９８９）。
【０００５】従って、本発明は細胞接着阻害という新た
な作用機序を有する新規な細胞接着阻害剤マクロスフェ
ライドＡ及びＢを提供するものであり、更に、本発明は
分生子果不完全菌綱、ミクロスフェロプシス属に属する
マクロスフェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微
生物を培地に培養して培養物中にマクロスフェライドＡ
及びＢを蓄積せしめ、該培養物からマクロスフェライド
Ａ及びＢを採取することを特徴とする新規な細胞接着阻
害剤マクロスフェライドＡ及びＢの製造法である。
な作用機序を有する新規な細胞接着阻害剤マクロスフェ
ライドＡ及びＢを提供するものであり、更に、本発明は
分生子果不完全菌綱、ミクロスフェロプシス属に属する
マクロスフェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微
生物を培地に培養して培養物中にマクロスフェライドＡ
及びＢを蓄積せしめ、該培養物からマクロスフェライド
Ａ及びＢを採取することを特徴とする新規な細胞接着阻
害剤マクロスフェライドＡ及びＢの製造法である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規な生
理活性物質の探索を目的として種々の土壌から菌株を分
離し、その生産する代謝産物について種々の検索を続け
た結果、新たに静岡県伊豆町で採取された土壌から分離
した菌株ＦＯ−５０５０の培養物中に、ヒト臍帯静脈血
管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄性白血病（ＨＬ−
６０）細胞の接着を阻害する物質が産生されることを見
出した。
理活性物質の探索を目的として種々の土壌から菌株を分
離し、その生産する代謝産物について種々の検索を続け
た結果、新たに静岡県伊豆町で採取された土壌から分離
した菌株ＦＯ−５０５０の培養物中に、ヒト臍帯静脈血
管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄性白血病（ＨＬ−
６０）細胞の接着を阻害する物質が産生されることを見
出した。
【０００７】次いで、該培養物からヒト臍帯静脈血管内
皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄性白血病（ＨＬ−６
０）細胞の接着を阻害する有効物質を分離、精製した結
果、後記の理化学的性質を有するマクロスフェライドＡ
及びＢ物質は従来全く知られていないことから、この物
質をマクロスフェライド類と呼称することにした。更
に、後記の理化学的性質を有するマクロスフェライド類
は、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏ
ｐｓｉｓ）属に属する生産菌を培地に培養して、培養物
にマクロスフェライド類を蓄積せしめ、該培養物からマ
クロスフェライド類を採取する。
皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄性白血病（ＨＬ−６
０）細胞の接着を阻害する有効物質を分離、精製した結
果、後記の理化学的性質を有するマクロスフェライドＡ
及びＢ物質は従来全く知られていないことから、この物
質をマクロスフェライド類と呼称することにした。更
に、後記の理化学的性質を有するマクロスフェライド類
は、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏ
ｐｓｉｓ）属に属する生産菌を培地に培養して、培養物
にマクロスフェライド類を蓄積せしめ、該培養物からマ
クロスフェライド類を採取する。
【０００８】本発明のマクロスフェライド類を使用する
ために使用される菌株としては、ミクロスフェロプシス
（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）属に属するが、
例えば本発明者らが分離した分生子果不完全菌綱、ミク
ロスフェロプシス属に属するミクロスフェロプシス エ
スピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．）
ＦＯ−５０５０菌株は本発明に最も有効に使用される菌
株の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと下記の
通りである。
ために使用される菌株としては、ミクロスフェロプシス
（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）属に属するが、
例えば本発明者らが分離した分生子果不完全菌綱、ミク
ロスフェロプシス属に属するミクロスフェロプシス エ
スピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．）
ＦＯ−５０５０菌株は本発明に最も有効に使用される菌
株の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと下記の
通りである。
【０００９】Ｉ．形態的性質 バレイショ・ブドウ糖寒天培地、イーストエキストラク
ト・ソルブルスターチ寒天培地（ＹｐＳｓ）などで良好
に生育し、柄子殻の形成も良好である。バレイショ・ブ
ドウ糖寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察する
と菌糸は透明で隔壁を有しており、柄子殻の形成も良好
である。柄子殻は黒色、まれに菌糸に覆われ白色、球
状、ときに孔口または頚部が顕著で培地上に半突出す
る。大きさは２００〜２５０μｍで、成熟後、頂部の孔
口から黒い胞子泥をだす。殻壁組織は暗褐色である。分
生子は淡褐色、卵形〜楕円形、単泡で大きさは４．５〜
５．５μｍ×３．８μｍである。
ト・ソルブルスターチ寒天培地（ＹｐＳｓ）などで良好
に生育し、柄子殻の形成も良好である。バレイショ・ブ
ドウ糖寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察する
と菌糸は透明で隔壁を有しており、柄子殻の形成も良好
である。柄子殻は黒色、まれに菌糸に覆われ白色、球
状、ときに孔口または頚部が顕著で培地上に半突出す
る。大きさは２００〜２５０μｍで、成熟後、頂部の孔
口から黒い胞子泥をだす。殻壁組織は暗褐色である。分
生子は淡褐色、卵形〜楕円形、単泡で大きさは４．５〜
５．５μｍ×３．８μｍである。
【００１０】II．培養性状 各種培地上で２５℃、１４日間培養した場合の肉眼的観
察結果を表１に示す。なお、各培地において、菌の生育
に伴う分泌液および菌核の形成は観察されなかった。
察結果を表１に示す。なお、各培地において、菌の生育
に伴う分泌液および菌核の形成は観察されなかった。
【００１１】
【表１】
【００１２】III ．生理的、生態的性状 １）本菌株の最適生育条件はＧＰ液体培地においてｐＨ
４〜１０、最適生育温度はＹｐＳｓ寒天培地において１
５〜３０℃である。 ２）本菌株の生育範囲はＧＰ液体培地においてｐＨ３〜
１０、生育温度はＹｐＳｓ寒天培地において７〜３５℃
である。 ３）好気性、嫌気性の区別：好気性
４〜１０、最適生育温度はＹｐＳｓ寒天培地において１
５〜３０℃である。 ２）本菌株の生育範囲はＧＰ液体培地においてｐＨ３〜
１０、生育温度はＹｐＳｓ寒天培地において７〜３５℃
である。 ３）好気性、嫌気性の区別：好気性
【００１３】以上の形態的観察および培養、生理的性状
に基づき既知菌株との比較を試みた結果、本菌株は分生
子果不完全菌綱、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓ
ｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）属に属する菌株と同定し、ミク
ロスフェロプシス エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒ
ｏｐｓｉｓ ｓｐ．）ＦＯ−５０５０と命名した。な
お、本菌株は、ミクロスフェロプシス エスピー ＦＯ
−５０５０として工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。寄託日は平成７年２月２０日で、受託
番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４７７６である。
に基づき既知菌株との比較を試みた結果、本菌株は分生
子果不完全菌綱、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓ
ｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）属に属する菌株と同定し、ミク
ロスフェロプシス エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒ
ｏｐｓｉｓ ｓｐ．）ＦＯ−５０５０と命名した。な
お、本菌株は、ミクロスフェロプシス エスピー ＦＯ
−５０５０として工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。寄託日は平成７年２月２０日で、受託
番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４７７６である。
【００１４】本発明の好ましい菌株として、マクロスフ
ェライド類生産菌を説明したが、糸状菌の一般的性状と
しての菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したも
のではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照
射、Ｘ線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジン、エチルメタンス
ルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異する
ことは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿
論、自然変異株も含め、ミクロスフェロプシス属に属
し、マクロスフェライド類を生産する能力を有する菌株
はすべて本発明に使用することができる。
ェライド類生産菌を説明したが、糸状菌の一般的性状と
しての菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したも
のではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照
射、Ｘ線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジン、エチルメタンス
ルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異する
ことは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿
論、自然変異株も含め、ミクロスフェロプシス属に属
し、マクロスフェライド類を生産する能力を有する菌株
はすべて本発明に使用することができる。
【００１５】また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工
学的に変異させた菌株も本発明のマクロスフェライド類
生産菌として包含される。本発明においては、先ずミク
ロスフェロプシス属に属するマクロスフェライド類生産
菌が、適当な培地に培養される。本菌の培養において
は、通常の糸状菌の培養方法が一般に適用される。培地
としては微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素
源、さらに必要に応じ無機塩などを含有させた栄養培地
が用いられる。
学的に変異させた菌株も本発明のマクロスフェライド類
生産菌として包含される。本発明においては、先ずミク
ロスフェロプシス属に属するマクロスフェライド類生産
菌が、適当な培地に培養される。本菌の培養において
は、通常の糸状菌の培養方法が一般に適用される。培地
としては微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素
源、さらに必要に応じ無機塩などを含有させた栄養培地
が用いられる。
【００１６】同化し得る炭素源としては、ブドウ糖、糖
密、澱粉、デキストリン、セルロース、コーン・スティ
ープ・リカー、グリセリン、有機酸などが単独または組
み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、例
えば市販されているペプトン、肉エキス、酵母エキス、
乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、綿実
粉、カゼイン、大豆蛋白分解物、アミノ酸、尿素などの
有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化
合物が単独または組み合わせて用いられる。
密、澱粉、デキストリン、セルロース、コーン・スティ
ープ・リカー、グリセリン、有機酸などが単独または組
み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、例
えば市販されているペプトン、肉エキス、酵母エキス、
乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、綿実
粉、カゼイン、大豆蛋白分解物、アミノ酸、尿素などの
有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化
合物が単独または組み合わせて用いられる。
【００１７】更に、必要に応じてナトリウム塩、カリウ
ム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの
無機塩類が添加される。更に、培地には、必要に応じ
て、本菌の生育やマクロスフェライド類の生産を促進す
る微量栄養素、発育促進物質、前駆物質を適当に添加し
てもよい。
ム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの
無機塩類が添加される。更に、培地には、必要に応じ
て、本菌の生育やマクロスフェライド類の生産を促進す
る微量栄養素、発育促進物質、前駆物質を適当に添加し
てもよい。
【００１８】培養は通常振とうまたは通気攪拌培養など
の好気的条件下で行うのがよい。工業的には深部通気攪
拌培養が好ましい。培地のｐＨは中性付近で培養を行う
のが好ましい。培養温度は２０〜３７℃でも行い得る
が、通常は２４〜３０℃、好ましくは２７℃付近に保つ
のがよい。培養時間は、液体培養の場合、通常３〜６日
培養を行うと、マクロスフェライド類が生成蓄積され
る。好ましくは培養中のマクロスフェライド類の蓄積量
が最大に達したときに培養を終了すればよい。
の好気的条件下で行うのがよい。工業的には深部通気攪
拌培養が好ましい。培地のｐＨは中性付近で培養を行う
のが好ましい。培養温度は２０〜３７℃でも行い得る
が、通常は２４〜３０℃、好ましくは２７℃付近に保つ
のがよい。培養時間は、液体培養の場合、通常３〜６日
培養を行うと、マクロスフェライド類が生成蓄積され
る。好ましくは培養中のマクロスフェライド類の蓄積量
が最大に達したときに培養を終了すればよい。
【００１９】これらの培養組成、培地の液性、培養温
度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の
種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液
体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物
油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用してもよい。
度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の
種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液
体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物
油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用してもよい。
【００２０】このようにして得られた培養物中に蓄積さ
れた活性物質は培養濾液または培養菌体中に含まれてい
る。培養濾液を必要に応じて濾過補助剤、例えばセライ
ト、ハイフロースーパーセル等を加えて濾過するか、ま
たは遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し、培養濾液
と菌体との有機溶媒抽出物を濃縮したものの混合物から
マクロスフェライド類を採取するのが有利である。
れた活性物質は培養濾液または培養菌体中に含まれてい
る。培養濾液を必要に応じて濾過補助剤、例えばセライ
ト、ハイフロースーパーセル等を加えて濾過するか、ま
たは遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し、培養濾液
と菌体との有機溶媒抽出物を濃縮したものの混合物から
マクロスフェライド類を採取するのが有利である。
【００２１】また、培養濾液及び菌体を分離しないで、
そのまま非親水性有機溶媒により抽出することができ
る。また、マクロスフェライド類の含有量が培養濾液と
菌体のどちらかに極端に多いときはその多い方から抽出
してもよい。培養菌体からマクロスフェライド類を分離
精製するためには、通常、培養ろ液と菌体の有機溶媒抽
出物を濃縮した物の混合物またはそれぞれを非浸水性溶
媒、例えば酢酸エチル、クロロホルムで抽出することに
より、マクロスフェライド類が有機溶媒に転溶される。
そのまま非親水性有機溶媒により抽出することができ
る。また、マクロスフェライド類の含有量が培養濾液と
菌体のどちらかに極端に多いときはその多い方から抽出
してもよい。培養菌体からマクロスフェライド類を分離
精製するためには、通常、培養ろ液と菌体の有機溶媒抽
出物を濃縮した物の混合物またはそれぞれを非浸水性溶
媒、例えば酢酸エチル、クロロホルムで抽出することに
より、マクロスフェライド類が有機溶媒に転溶される。
【００２２】このようにして得られた有機溶媒層は、必
要に応じ種々の脱水剤、たとえば無水硫酸ナトリウム、
ビーズゲルなどを加えて脱水された後、減圧下で有機溶
媒が留去される。この濃縮操作においてマクロスフェラ
イド類は安定な物質であるが、通常加熱温度を５０℃以
下となるように行うのが好ましい。残渣にヘキサン、石
油エーテルなどの有機溶媒を加えてマクロスフェライド
類を沈澱させることができる。
要に応じ種々の脱水剤、たとえば無水硫酸ナトリウム、
ビーズゲルなどを加えて脱水された後、減圧下で有機溶
媒が留去される。この濃縮操作においてマクロスフェラ
イド類は安定な物質であるが、通常加熱温度を５０℃以
下となるように行うのが好ましい。残渣にヘキサン、石
油エーテルなどの有機溶媒を加えてマクロスフェライド
類を沈澱させることができる。
【００２３】得られた沈澱物は数回ヘキサンなどで洗浄
後、吸引濾過または遠心分離によりマクロスフェライド
類の粗製物を採取することができる。この粗製物をさら
に精製するためには、マクロスフェライド類と混雑物と
の溶解度の差や混じり合わない二液相関の分配の差や各
種吸着担体に対する吸着力の差を利用した多くの手段が
可能であるが、特にクロマトグラフィーはマクロスフェ
ライド類の精製に有効な方法である。
後、吸引濾過または遠心分離によりマクロスフェライド
類の粗製物を採取することができる。この粗製物をさら
に精製するためには、マクロスフェライド類と混雑物と
の溶解度の差や混じり合わない二液相関の分配の差や各
種吸着担体に対する吸着力の差を利用した多くの手段が
可能であるが、特にクロマトグラフィーはマクロスフェ
ライド類の精製に有効な方法である。
【００２４】マクロスフェライド類の精製に有効なクロ
マトグラフィーとしては、シリカゲル、アルミナ、活性
炭セルロース、ヒドロキシアパタイトＨＰ−２０などの
吸着樹脂などによる吸着クロマトグラフィー、シラン化
シリカゲル、オクタデシルシラン化シリカゲルなどを用
いる逆相分配クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ
−２０、トヨパール（商品名、東ソー社製）などを用い
る分子ふるいにもとずくゲル濾過クロマトグラフィーな
どが挙げられる。
マトグラフィーとしては、シリカゲル、アルミナ、活性
炭セルロース、ヒドロキシアパタイトＨＰ−２０などの
吸着樹脂などによる吸着クロマトグラフィー、シラン化
シリカゲル、オクタデシルシラン化シリカゲルなどを用
いる逆相分配クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ
−２０、トヨパール（商品名、東ソー社製）などを用い
る分子ふるいにもとずくゲル濾過クロマトグラフィーな
どが挙げられる。
【００２５】マクロスフェライド類は、これらのクロマ
トグラフィーや電気泳動、向流分配、限外濾過などの手
段を、単独あるいは任意の順序にて組み合わせまたは反
復して用いることにより、分離精製することができる。
例えば上記の粗製物を少量のクロロホルムに溶かし、シ
リカゲルに吸着させ、クロロホルム−アセトン系混合溶
液を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、その活性
画分を減圧濃縮後、少量のメタノールに溶かし、これを
メタノールで分子ふるいにもとずくゲル濾過クロマトグ
ラフィーを行うことによりマクロスフェライドを分離精
製することができる。
トグラフィーや電気泳動、向流分配、限外濾過などの手
段を、単独あるいは任意の順序にて組み合わせまたは反
復して用いることにより、分離精製することができる。
例えば上記の粗製物を少量のクロロホルムに溶かし、シ
リカゲルに吸着させ、クロロホルム−アセトン系混合溶
液を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、その活性
画分を減圧濃縮後、少量のメタノールに溶かし、これを
メタノールで分子ふるいにもとずくゲル濾過クロマトグ
ラフィーを行うことによりマクロスフェライドを分離精
製することができる。
【００２６】次に、本発明マクロスフェライド類の理化
学的性質について以下に述べる。 〔１〕細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ （１）性状：無色針状結晶 （２）元素組成：Ｃ16Ｈ22Ｏ8 （高分解能マススペクト
ルによる） （３）融点：１４１〜１４２℃（クロロホルム） （４）比旋光度：〔α〕D 23＋８４．１゜（ｃ＝０．５
９，ＭｅＯＨ） （５）分子量：３４２（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マスス
ペクトルによる）
学的性質について以下に述べる。 〔１〕細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ （１）性状：無色針状結晶 （２）元素組成：Ｃ16Ｈ22Ｏ8 （高分解能マススペクト
ルによる） （３）融点：１４１〜１４２℃（クロロホルム） （４）比旋光度：〔α〕D 23＋８４．１゜（ｃ＝０．５
９，ＭｅＯＨ） （５）分子量：３４２（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マスス
ペクトルによる）
【００２７】（６）紫外線吸収スペクトル：メタノール
中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおり
であり、２０７（ｌｏｇ ε＝４．２１）ｎｍ付近に特
徴的な吸収極大を示す （７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外
線吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、１７１
３，３４２８ｃｍ-1に吸収帯を有する （８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢酸エチル、エ
チルエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、ク
ロロホルムに可溶、水に難溶
中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおり
であり、２０７（ｌｏｇ ε＝４．２１）ｎｍ付近に特
徴的な吸収極大を示す （７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外
線吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、１７１
３，３４２８ｃｍ-1に吸収帯を有する （８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢酸エチル、エ
チルエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、ク
ロロホルムに可溶、水に難溶
【００２８】（９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン
酸、ヨウ素、Ｐ−アニスアルデヒドに陽性 （１０）核磁気共鳴スペクトル：日本電子ＥＸ−２７０
ＮＭＲスペクトロメータを用いて測定した 1Ｈ−ＮＭＲ
スペクトル（重クロロホルム溶液中、２７０ＭＨｚ）お
よび13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム溶液中、
６７．８ＭＨｚ）はそれぞれ図３及び図４に示すとおり
である。また、水素および炭素の化学シフトは下記表２
に示す通りである。
酸、ヨウ素、Ｐ−アニスアルデヒドに陽性 （１０）核磁気共鳴スペクトル：日本電子ＥＸ−２７０
ＮＭＲスペクトロメータを用いて測定した 1Ｈ−ＮＭＲ
スペクトル（重クロロホルム溶液中、２７０ＭＨｚ）お
よび13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム溶液中、
６７．８ＭＨｚ）はそれぞれ図３及び図４に示すとおり
である。また、水素および炭素の化学シフトは下記表２
に示す通りである。
【００２９】
【表２】
【００３０】〔２〕細胞接着阻害剤マクロスフェライド
Ｂ （１）性状：無色板状結晶 （２）元素組成：Ｃ16Ｈ20Ｏ8 （高分解能マススペクト
ルによる） （３）融点：１４８〜１５０゜（クロロホルム） （４）比旋光度：〔α〕D 23＋４．１゜（ｃ＝０．９８
５，ＭｅＯＨ） （５）分子量：３４０（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マスス
ペクトルによる）
Ｂ （１）性状：無色板状結晶 （２）元素組成：Ｃ16Ｈ20Ｏ8 （高分解能マススペクト
ルによる） （３）融点：１４８〜１５０゜（クロロホルム） （４）比旋光度：〔α〕D 23＋４．１゜（ｃ＝０．９８
５，ＭｅＯＨ） （５）分子量：３４０（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マスス
ペクトルによる）
【００３１】（６）紫外線吸収スペクトル：メタノール
中で測定した紫外部吸収スペクトルは図５に示すとおり
であり、２１０（ｌｏｇ ε＝４．１５）ｎｍ付近に特
徴的な吸収極大を示す （７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外
線吸収スペクトルは図６に示すとおりであり、３４５
８，１７４３，１７２６，１７０５ｃｍ-1に吸収帯を有
する
中で測定した紫外部吸収スペクトルは図５に示すとおり
であり、２１０（ｌｏｇ ε＝４．１５）ｎｍ付近に特
徴的な吸収極大を示す （７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外
線吸収スペクトルは図６に示すとおりであり、３４５
８，１７４３，１７２６，１７０５ｃｍ-1に吸収帯を有
する
【００３２】（８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢
酸エチル、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、エ
タノール、クロロホルムに可溶、水に難溶 （９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、Ｐ
−アニスアルデヒドに陽性
酸エチル、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、エ
タノール、クロロホルムに可溶、水に難溶 （９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、Ｐ
−アニスアルデヒドに陽性
【００３３】（１０）核磁気共鳴スペクトル：日本電子
ＥＸ−２７０ＮＭＲスペクトロメータを用いて測定した
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム溶液中、２７
０ＭＨｚ）および13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホ
ルム溶液中、６７．８ＭＨｚ）はそれぞれ図７及び図８
に示すとおりである。また、水素および炭素の化学シフ
トは下記表３に示す通りである。
ＥＸ−２７０ＮＭＲスペクトロメータを用いて測定した
1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム溶液中、２７
０ＭＨｚ）および13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホ
ルム溶液中、６７．８ＭＨｚ）はそれぞれ図７及び図８
に示すとおりである。また、水素および炭素の化学シフ
トは下記表３に示す通りである。
【００３４】
【表３】
【００３５】ヒト血管内皮細胞を用いた細胞接着阻害能
の評価 ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するヒト
骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０）の結合能を指標として
細胞接着阻害活性を試験した。１０％ウシ胎児血清（Ｆ
ＢＳ）、ヘパリン１００Ｕ／ｍl 、ＥＣＧＦ５０μｇ／
ｍl を含むＭＣＤＢ１０７培地に懸濁したＨＵＶＥＣを
２×１０4 個を９６穴のマイクロプレートの各穴に播
き、ＣＯ2 インキュベータ内で３７℃で２４時間培養す
る。
の評価 ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するヒト
骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０）の結合能を指標として
細胞接着阻害活性を試験した。１０％ウシ胎児血清（Ｆ
ＢＳ）、ヘパリン１００Ｕ／ｍl 、ＥＣＧＦ５０μｇ／
ｍl を含むＭＣＤＢ１０７培地に懸濁したＨＵＶＥＣを
２×１０4 個を９６穴のマイクロプレートの各穴に播
き、ＣＯ2 インキュベータ内で３７℃で２４時間培養す
る。
【００３６】次いで１０ｎｇの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
を添加してＨＵＶＥＣを刺激した。５時間後に検体なら
びに蛍光標識ＨＬ−６０を加え、３０分間インキュベー
トした。非接着細胞を除去した後、各穴の蛍光強度を測
定することにより細胞接着率を算出した、その結果は表
４に示した通りである。
を添加してＨＵＶＥＣを刺激した。５時間後に検体なら
びに蛍光標識ＨＬ−６０を加え、３０分間インキュベー
トした。非接着細胞を除去した後、各穴の蛍光強度を測
定することにより細胞接着率を算出した、その結果は表
４に示した通りである。
【００３７】
【表４】
【００３８】
【発明の効果】以上のとおり、本発明によるマクロスフ
ェライドＡ及びＢは、細胞接着が深く関与すると考えら
れる疾患、例えば癌転移、あるいは関節炎などの慢性炎
症や喘息、アレルギー疾患等に対しての効果が期待され
る。
ェライドＡ及びＢは、細胞接着が深く関与すると考えら
れる疾患、例えば癌転移、あるいは関節炎などの慢性炎
症や喘息、アレルギー疾患等に対しての効果が期待され
る。
【００３９】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれのみに限定されるものではない。試
験管（φ２×２０ｃｍ）にグルコース２．０％、酵母エ
キス０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５
％、ポリペプトン０．５％、リン酸二水素カリウム０．
１％、寒天０．１％（ｐＨ５．６〜５．８）、１０ｍl
を滅菌し、これに酵母エキス０．４％、可溶性デンプン
１．５％、リン酸−水素カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム・７水和物０．０５％、寒天２．０％（ｐＨ６．
０）を含む寒天斜面培地上に２７℃、６日間培養したミ
クロスフェロプシス エスピーＦＯ−５０５０（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４７７６）の斜面培養から一白金耳を接種
し、２７℃で７２時間振とう培養して種母を得た。
るが、本発明はこれのみに限定されるものではない。試
験管（φ２×２０ｃｍ）にグルコース２．０％、酵母エ
キス０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５
％、ポリペプトン０．５％、リン酸二水素カリウム０．
１％、寒天０．１％（ｐＨ５．６〜５．８）、１０ｍl
を滅菌し、これに酵母エキス０．４％、可溶性デンプン
１．５％、リン酸−水素カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム・７水和物０．０５％、寒天２．０％（ｐＨ６．
０）を含む寒天斜面培地上に２７℃、６日間培養したミ
クロスフェロプシス エスピーＦＯ−５０５０（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４７７６）の斜面培養から一白金耳を接種
し、２７℃で７２時間振とう培養して種母を得た。
【００４０】次に、５００ｍl 容三角フラスコに可溶性
デンプン３．０％、グリセロール１．０％、キナコ２．
０％、乾燥酵母０．３％、塩化カリウム０．３％、炭酸
カルシウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．
０５％、リン酸二水素カリウム０．０５％を含む液体生
産培地（ｐＨ６．５）１００ｍl （２０本）を仕込み滅
菌した後、上記の方法で得られた種母１．０ｍl を上記
三角フラスコに無菌的に移植し、毎分２２０回転するロ
ーターリシェーカーにより２７℃で１２０時間振とう培
養を行った。
デンプン３．０％、グリセロール１．０％、キナコ２．
０％、乾燥酵母０．３％、塩化カリウム０．３％、炭酸
カルシウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．
０５％、リン酸二水素カリウム０．０５％を含む液体生
産培地（ｐＨ６．５）１００ｍl （２０本）を仕込み滅
菌した後、上記の方法で得られた種母１．０ｍl を上記
三角フラスコに無菌的に移植し、毎分２２０回転するロ
ーターリシェーカーにより２７℃で１２０時間振とう培
養を行った。
【００４１】得られた培養液を液体画分と菌体画分とに
分け、液体画分については、酢酸エチルを加えて充分攪
拌した後、分液操作により酢酸エチル抽出画分を得た。
菌体画分については、これにメタノールを加え、充分攪
拌した後、得られたメタノール画分を減圧濃縮してメタ
ノールを留去後、酢酸エチルにより抽出した。液体およ
び菌体の両画分より得た酢酸エチル画分を合わせ、減圧
濃縮操作により酢酸エチル抽出画分３７９．４ｍｇを得
た。
分け、液体画分については、酢酸エチルを加えて充分攪
拌した後、分液操作により酢酸エチル抽出画分を得た。
菌体画分については、これにメタノールを加え、充分攪
拌した後、得られたメタノール画分を減圧濃縮してメタ
ノールを留去後、酢酸エチルにより抽出した。液体およ
び菌体の両画分より得た酢酸エチル画分を合わせ、減圧
濃縮操作により酢酸エチル抽出画分３７９．４ｍｇを得
た。
【００４２】この酢酸エチル抽出画分を薄層シリカゲル
（２０×２０ｃｍ、厚さ０．５ｍｍ、メルク社製）二枚
に吸着せしめ、クロロホルム−メタノール混合溶媒
（９：１）で展開した。Ｒｆ値が０．５付近で、紫外線
ランプ（２５４，３６６ｎｍ）照射下で橙黄色の蛍光を
示すバンドを分画し、クロロホルム−メタノール混合溶
媒（１：１）で溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮
してマクロスフェライド類を含む１８．３ｍｇの粗物質
Ｉを得た。
（２０×２０ｃｍ、厚さ０．５ｍｍ、メルク社製）二枚
に吸着せしめ、クロロホルム−メタノール混合溶媒
（９：１）で展開した。Ｒｆ値が０．５付近で、紫外線
ランプ（２５４，３６６ｎｍ）照射下で橙黄色の蛍光を
示すバンドを分画し、クロロホルム−メタノール混合溶
媒（１：１）で溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮
してマクロスフェライド類を含む１８．３ｍｇの粗物質
Ｉを得た。
【００４３】この粗物質Ｉを少量のメタノールに溶解
し、高速液体クロマトグラフィー（センシューパック・
ペガシル、φ２０×２５０ｍｍ）にかけ、４０％アセト
ニトリル溶液を移動相として活性画分を分取することに
よりマクロスフェライドＡの純品１０．２ｍｇ及びマク
ロスフェライドＢの純品５．２ｍｇをそれぞれ得た。
し、高速液体クロマトグラフィー（センシューパック・
ペガシル、φ２０×２５０ｍｍ）にかけ、４０％アセト
ニトリル溶液を移動相として活性画分を分取することに
よりマクロスフェライドＡの純品１０．２ｍｇ及びマク
ロスフェライドＢの純品５．２ｍｇをそれぞれ得た。
【図１】マクロスフェライドＡの紫外線吸収スペクトル
である。
である。
【図２】マクロスフェライドＡの赤外線吸収スペクトル
である。
である。
【図３】マクロスフェライドＡの 1Ｈ−核磁気共鳴スペ
クトルである。
クトルである。
【図４】マクロスフェライドＡの13Ｃ−核磁気共鳴スペ
クトルである。
クトルである。
【図５】マクロスフェライドＢの紫外線吸収スペクトル
である。
である。
【図６】マクロスフェライドＢの赤外線吸収スペクトル
である。
である。
【図７】マクロスフェライドＢの 1Ｈ−核磁気共鳴スペ
クトルである。
クトルである。
【図８】マクロスフェライドＢの13Ｃ−核磁気共鳴スペ
クトルである。
クトルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/70 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 35/70 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 高松 智 東京都港区白金５丁目９番１号 社団法人 北里研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 次の理化学的性質を有する細胞接着阻害
剤マクロスフェライドＡ及びＢ。 〔１〕細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ （１）性状：無色針状結晶 （２）元素組成：Ｃ16Ｈ22Ｏ8 （高分解能マススペクト
ルによる） （３）融点：１４１〜１４０℃（クロロホルム） （４）比旋光度〔α〕D 23＋８４．１゜（ｃ＝０．５
９，ＭｅＯＨ） （５）分子量：３４２（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マスス
ペクトルによる） （６）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した
紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおりであり、２０
７（ｌｏｇ ε＝４．２１）ｎｍ付近に特徴的な吸収極
大を示す （７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外
線吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、１７１
３，３４２８ｃｍ-1に吸収帯を有する （８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢酸エチル、エ
チルエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、ク
ロロホルムに可溶、水に難溶 （９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、Ｐ
−アニスアルデヒドに陽性 （１０） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）：図３に示すとおり （１１）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）：図４に示すとおり 〔２〕細胞接着阻害剤マクロスフェライドＢ （１）性状：無色板状結晶 （２）元素組成：Ｃ16Ｈ20Ｏ8 （高分解能マススペクト
ルによる） （３）融点：１４８〜１５０℃（クロロホルム） （４）比旋光度：〔α〕D 23＋４．１゜（ｃ＝０．９８
５，ＭｅＯＨ） （５）分子量：３４０（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マスス
ペクトルによる） （６）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した
紫外部吸収スペクトルは図５に示すとおりであり、２１
０（ｌｏｇ ε＝４．１５）ｎｍ付近に特徴的な吸収極
大を示す （７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外
線吸収スペクトルは図６に示すとおりであり、３４５
８，１７４３，１７２６，１７０５ｃｍ-1に吸収帯を有
する （８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢酸エチル、エ
チルエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、ク
ロロホルムに可溶、水に難溶 （９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、Ｐ
−アニスアルデヒドに陽性 （１０） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）：図７に示すとおり （１１）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）：図８に示すとおり - 【請求項２】 ミクロスフェロプシス属に属するマクロ
スフェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微生物を
培地に培養して培養物中にマクロスフェライドＡ及びＢ
を蓄積せしめ、該培養物からマクロスフェライドＡ及び
Ｂを採取することを特徴とする新規な細胞接着阻害剤マ
クロスフェライドＡ及びＢの製造法。 - 【請求項３】 ミクロスフェロプシス属に属し、マクロ
スフェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微生物が
ミクロスフェロプシス エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａ
ｅｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．）ＦＯ−５０５０である請求項
２記載の製造法。 - 【請求項４】 ミクロスフェロプシス属に属し、マクロ
スフェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微生物。 - 【請求項５】 微生物がミクロスフェロプシス エスピ
ー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．）ＦＯ
−５０５０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４７７６）である請求項
４記載の微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13136295A JP3641013B2 (ja) | 1995-05-30 | 1995-05-30 | 新規な細胞接着阻害剤マクロスフェライドａ及びｂ並びにそれらの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13136295A JP3641013B2 (ja) | 1995-05-30 | 1995-05-30 | 新規な細胞接着阻害剤マクロスフェライドａ及びｂ並びにそれらの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08325285A true JPH08325285A (ja) | 1996-12-10 |
| JP3641013B2 JP3641013B2 (ja) | 2005-04-20 |
Family
ID=15056160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13136295A Expired - Fee Related JP3641013B2 (ja) | 1995-05-30 | 1995-05-30 | 新規な細胞接着阻害剤マクロスフェライドａ及びｂ並びにそれらの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3641013B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001047516A1 (en) * | 1999-12-28 | 2001-07-05 | Gakkou Houjin Kitasato Gakuen | Immunosuppressants |
-
1995
- 1995-05-30 JP JP13136295A patent/JP3641013B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001047516A1 (en) * | 1999-12-28 | 2001-07-05 | Gakkou Houjin Kitasato Gakuen | Immunosuppressants |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3641013B2 (ja) | 2005-04-20 |
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