JPS5962529A - 安定な発色剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は安定な発色剤組成物に関し、さらに詳しくは過
酸化物質、発色剤、過酸化酵素を用いた酸化発色による
測定系に用いる発色剤の安定化法に関する。

過ｌ′Ｎ化物質、特に過酸化水素の測定は最近、臨床検
査の分野において重要性を増しつつある。体液成分、例
えばブドウ糖、尿酸、コレステロール、モノアミンはグ
ルコースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオ
キシダーゼ、モノアミンオキシダーゼとの酵素反応によ
って過酸化水素が生成する。生成した過酸化水素は発色
剤及び過酸化酵素を用いて定量することによって、各々
の体液成分の含爪を知ることができる。

又１過藪化自イ・紫の活性測定はペルオキシダーゼを標
識物質とした酵素免疫測定法において重要性を増しつつ
ある。一般に酵素免疫測定法においてはＳ標識抗体又は
標識抗原のペルオキシダーゼ活性を測定することにより
、生体生理活性物質あるカルチノ・エンブリオニック・
アンチゲン・免疫グロブリンｇ（工ｆｘ）　、フェリチ
ン、β、−マイクログロブリン等の極微量の血清タンパ
ク質の測定を行なうことができる。

七ころで１過敞化物質、特に過酸化水素の定量法として
は発色剤として、０−ジアニシジンを用いる方法又は４
−アミノアンヂピリンと７エノールを用いる方法等が知
られている（検査と技術’ｌ１ｒＯ１，９、／ｉ　ｌ　
１　、　Ｐ−８６７−８７１（１９８１））。しかしな
がら、前者は還元性物質、例えば、アルデヒド類と反応
する性質があるため、その反応が過酸化水素に特異的で
ない欠点を持っている。又、後者は、感度が十分でない
ため、血清等の貴重な試料が多ノｌシ必要となる。又、
それがために、測定時に、共存物質の影響を受けやすい
欠点を有していた。

一方、過酸化酵素の活性測定方法としては１過酸化物質
を基質とし、０−ジアニシジン或はピロｉｆ　ｏ　−ル
オヨびフェニレンジアミン誘導体を発色剤として用いる
方法が知られている。しかしながらＳＯ−ジアニシジン
をもちいる方法は前述のごとく１反応が非特異的である
。又、ピロガロールを使用する測定方法は酵素反応後の
呈色生成物質の生成のしやすいエチル・エーテルを使用
し、抽出操作をくりかえすために、精度が要求される等
の不便さを有する。また、それがために１実用性ニトホ
しい。フェニレンジアミン誘導体・例えば１０−フェニ
レンジアミンを使用する測定法は一般に良く使用され）
感度の点では申し分がない。しかし、０−フェニレンジ
アミンは光酸化を受けやすく、不安定で非特異的反応に
よる発色がみられるために取扱いには細心の注意が必要
である。それゆえに、光酸化等の非特異的反応をおさえ
るために、暗所で取扱ったりする必要がある等の不便従
来から発色剤の安定化法としては、遮光する方法、］１
ｉＤＴＡを添加する方法等が用いられるけれども、必ず
しも、効果的で有利な方法とは言えない。さらに、酸化
発色系に還元性物質を添加すると発色反応を妨害するこ
とは公知の事実である（検査と技南ＶｏＬ９．Ａｌｌ、
Ｐ−８６７〜８７１（’８１））。

本発明者らは水溶液中での酸化反応の検討を進めていく
過程で、酸化度１ノロの豹殊性（例えば酸素ラジカルの
反応性、酸素イオンの反応性、さらには、溶存した分子
状酸素の反応性等）を鋭意検討することにより、ｏ−フ
ェニレンジアミンのｉｆｆ化発色系において、ｆｌ＠：
１１悶化合物、硫哉ヒドロキシルアミン等の有機系還元
剤が過「我化醇累、例えば、ペルオ・Ｖ−シダーゼによ
る酢化反応を阻害しないばかりか、安定な呈色を達成で
きることがわかり本発明を児成した。

すなわち、本発明はフェニレンジアミンまたはその誘Ｉ
Ｊ体および有機還元剤を含むことを特徴とする安定な発
色剤組成物である。

有白糸３１元剤のうち、蓚酸化合物としては酪酸、ｔ３
よびぞのナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ
金氏塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金
属塩、さらにはそれらのアンモニ導体とは、例えば、０
−フェニレンシアミニ・、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ
−フェニレンジアミンおよびそれらの硫酸塩、塩酸塩又
は（ｉ＆　Ｉｔ’ｄ塩１さらに、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−
ジメチルアニリン、４−アミノ−Ｎ　、　Ｎ−ジエチル
アニリン、４−アミノ−ＮＮ−ジプロピルアニリン、４
−アミノトリイジン、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−ジエチル−
ｍ−）ルイジン、４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒ
ドロキシエチル−ｍ−）ルイジン等を挙げることができ
る。

過酸化酵素としては例えば、ペルオキシダーゼ、ラクト
ペルオキシダーゼ、チトクロームペルオキシダーゼ等が
ある。

本発明の発色剤組成物において）有機還元剤は通常０．
１　ｍ　Ｍ　〜５　Ｍ　１好ましくはｌ　ｍ　Ｍ　〜ｌ
　Ｍでアリ、フェニレンジアミンまたはその誘導体は１
ｍＭ〜１００ｍＭである。田は４〜９の範囲であること
が好ましい。

本発明の発色剤組成物には、過酸化物質または過酸化酵
素、水又は緩衝液が含まれていてもよい。

さらに必要により他の安定剤、防腐剤等が含まれていて
もよい。

本発明の発色剤組成物および過酸化酵素を使用した測定
例としては、例えば、次のようなものがあげられる。過
酸化水素又はペルオキシダーゼの活性を測定するに際し
ては有機還元剤を通常、０．１ｍλ哩〜５　Ｍｚ　好ｔ
、　シ＜　ｕ　１１ＴＩ　Ｍ〜ＩＭとフェニレンジアミ
ン誘導体を１ｍＭ〜ｌ　ＯＯｍ　Ｍ　％　＠む緩衝液及
びペルオキシダーゼを任意の順序に又は１同時に、試料
に添加する。ｐＨは４〜９の範囲の任意のｐｌｌである
。２〜６０’Ｃ，好ましくは２〜４０゛Ｃの反応温度で
暗所又は明所で酵素反応を行なわせると、生成した過酸
化水素量或は存在しているペルオキシダーゼ量に応じて
呈色物質が生成する。

生成した呈色物質の吸収極大値の波長における吸光度を
測定する。一方、濃度既知の過酸化水素又はペルオキシ
ダーゼの活性値を同様に反応させて検量線を作成し、こ
の検量線と対比して試料中の過酸化水嵩又はペルオキシ
ダーゼ活性を＋１１！Ｉ定する。

酵素標識抗体又は酵素標識抗原を用いる方法においては
、濃度既知の抗原域又は抗体量を用いて作成した検Ｆ？
ｔ　（’ｆｌと対比して試料中の抗原又は抗体を算出す
ることができる。

本発明では呈色反応は暗所においても、さらには明所に
おいても取扱うことができ、非特異的反応を１１（小眼
におさえて、感度よく測定することが誘導体および還元
剤のほかに必要により過酸化酵素が含まれるが１さらに
、緩衝液、標準液等、通常使用される試薬を註むことが
できるＯ本発明の発色剤組成物は有機還元剤を含むこと
により、光に対する安定性が改良され、非特異的反応を
おさえることが可能となる。

さらに本発明の発色剤組成物を用いて、過酸化酵素およ
び過酸化水素を測定するに当り、有機還元剤は＃ト素反
応を阻害しない特徴を有する。

また本発明の発色剤組成物は呈色後の経時変化において
も優れる。

次に、本発明を実施例によりさらに、具体的に説明する
が、本発明はこれらにより限定されるものではない。

実施例１　非特異的反応の検討 Ｏ−フェニレンジアミン・２塩ｌり塩を０．０２％の過
酸化水素を含むりん酸−クエン＃Ｊ更緩衝液（ｐｊ！、
７）に、０．３％になるように溶解した。さらに、各種
添加剤を加え、児全溶解後、試験管（１２ｍｙ＋φ×後
、４９２ｎｍでの吸光度を測定し、非特異的反に＋を評
価した。

その結果を表−１に示す。

表−１より、明らかなように１無添加に比欲しテｆｉＦ
付化合物、アスコルビン酸、ヒドロキシル・アミン・硫
酸塩、グルコース等の還元性物質が非特異内反Ｊ心をお
さえることがわかった。

実細例２　各桶、１青元性物質添加系におけるペルオキ
シダーゼによる酵素反応の検討 ０−フェニレンジアミン・２塩酔塩を０．０２％の過酸
化水素を含むリン酸−クエン酸緩衝液（ｐ１４５゜７）
に００３％になるように溶解した。さらに、各柚濃度の
３−λ元性物質を加え完全溶解後、試ＦＡ管（１２ｎφ
×７゜ｓ　ｃＭ）に０゜５−ずつ分注し、発色液を作成
した。次に、ペルオキシダーゼを。。１５ｍＵ／ガｌに
なるように０゜１％Ｂ％ＳＡ水溶液で溶解し、酵素溶液
とした。この酵素溶液を上記にて準１ｉ＃　’Ｌ、、た
発色液に５０μｌｆｔ加え、室温にて３０分聞、明所で
反応した。反応終了後、Ｘ−Ｎ・硫酸を２−添加し１反
応停止後、４９２ｎｍでの吸光度を測定し、各４ｉ（＞
’４元性物質共存下における酵素反応の阻害作用を検討
した。

その結果を表−２に示す。

表−２より明らかなように、蓚酸化合物は酵素反応糸に
添加してい′Ｃも、全＜　＃素反応を阻害しないことが
オフかった。アスコルビン酸等は濃度に大きく依存する
けれども、低濃度の添加域では若干の発色がみられるも
のの、酵素反応を著しく阻害した。

Δ１１Ｉ定例１　インスリン分析試験 実晦例−１、−２、の結果を利用して、サンドイッチ法
刊工Ａによりインスリンを分析した。

■　インスリン測定用不浴化試桑の製造抗ブタインスリ
ン抗血清（モルモット）より４５％飽和硫安にて分画後
、ＤＩＣＡＥ−セファロースカラムにて精製し、抗体画
分を得た。この抗体画分を０．０１　Ｍリン酸緩衝液（
ｐ＋（ニア、２　：　０，１５Ｍ　ＮａＯ！含有）を用
い、濃度が１−当り１■となるように希釈した溶Ｋｆ、
５０　ｍｔに、十分洗浄した粗面化ポリスチレンボール
４００個を浸漬し、室温で８時間ＩＩＩ’　ＪＥＴ　し
た。その後、ポリスチレンボールを浸漬液より分離し、
牛血清アルブミンを１％含有する０、ＯＬ　Ｍリン酸４
１　ｅｅｌ液（１４：　７．２　ｉ　０．１５Ｍ　Ｎａ
ｐ／含有）を用いて３回洗浄した後、同一緩衝、夜中に
保存した。

■　ペルオキシダーゼ標識抗体の調製 酵素としてｌｏｑのペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来
）を使用し、過よう素酸架橋法によって５１の抗ブタイ
ンスリン抗体にペルオキシダーゼを結合させ、セファデ
ックスＧ−２００によるゲルｐ過によって精製後、コロ
ジオンバッグで濃縮し、ペルオキシダーゼ標識抗体とし
た。抗体へのペルオキシダーゼの結合方法はＰ１ナヵネ
等：ザ・ジャーナル・オフ・ヒストケミストリー。アン
ド・サイトケミストリー、第２２巻、第１２号１Ｐ−１
０８４〜１０９１　　（１９７４年）に記載されている
。得られたペルオキシダーゼ標識抗体は使用直前に１％
牛血清アルブミンを含有する０、０１　Ｍリン目■１液
（ｐ＋Ｉ　：　７．２　ｉ　０．１５　Ｍ　ＮａＣＪ！
含有）で２０００倍附近まで希釈し使用した。

■　インスリンの測定方法 試験背（１２ＰＩｌφ×７．５α）に緩衝液−■（０゜
５％牛血清アルプミ＼ン含有０．０１　Ｍ　！Ｊン酢緩
筒液く田：　７，２　；　０．１５　Ｍ　ＮａＯ！含有
＞　）　ｏ、ａ−およびＷＨＯのナンバー６６／３０４
を基準にして作成した標準インスリン溶液（５〜３２０
μｕ／ｍ／）ｏ。１　ｖｌを添加し１よく混合してから
測定例−１の■の項で作成した不溶化試薬１個を入れ、
３７’ｃで１時間、加温した。加温終了後、試験管内の
反応液を吸引除去し、緩衝液−工の１−を加えて洗浄し
た。この操作を３回繰りかえした後、測定例−１の■の
項で得たペルオキシダーゼ標識抗体２５０μノを加え、
３７°Ｃで２時間、加温した。加温終了後、前記と同様
に反応液を吸引除去し、３回洗浄後、実晧例１で示した
発色液にボールのみを移し、各の色素を４９２ｍｍで測
定した。

■　酵素反応条件を変えた時の検量線の液化の検討 ■の測定方法に従って、インスリン標準品を測定し、検
量線を作成した。なお、発色液には３０ｍＭの蓚酸ナト
リウムを添加した場合と添加しない場合について酵素反
応を行なった。又、酵素反応は室温、明所、１時間およ
び４°Ｃ，１夜放置で行ない、前者の結果は第１図に、
後者の結果は第２図に示している。これらの図より明ら
かなように、インスリン低濃度側において、感度が大幅
に改良されると共に、非特異的反応がおさえられている
ことがわかる。

■　呈色後の経時変化についての検討 ■の測定方法に従って、インスリン標準品を測定した。

なお、呈色安定性は各槙還元性物質の添加の有無によっ
て、呈色安定性はどのように変化するか検討し、その結
果を表−３に示した。又、反応停止直後の吸光度（４９
ｚｎｍ）を１００とした時の経時変化によって示してい
る。

表−３呈色後の経時変化の検討 表−３より明らかなように、還元性物質、特に蓚酸化合
物がｅ１γ−素反応糸に添加していても、呈色安定性は
そこなわれないことがわかった。

測定例−２１９に分析試験 実旌例−１、−２、の結果を利用して、サンドイッチ法
Ｅ工Ａにより工ｆＥを分析した。

■　１ＦＫ測定用不溶化試薬の製造 抗ヒトエＩＨ抗血清（うさぎ）より、４５％飽和硫安に
て分画後、ＤＩＧＡＥ−セファロースカラムにて精製し
、抗体画分を得た。以下、工ｆ］ＩＧ測定用不溶化試蘂
のＭ造は測定例−１のインスリン測定用不溶化試某の製
造と同一の方法で実肺した。

■　ペルオキシダーゼ標識抗体の９４製測定ｆ１１のペ
ルオキシダーゼ標識抗体の調製法に準じて合成した。又
、使用法に関しても同一方法に従った。

■　工ｌ’Ｈの測定方法 試験管（１２門φ×７゜５σ）に緩衝液−工（０゜５％
牛血清アルブミン含有０．０１　Ｍリン酸緩衝液〈排Ｉ
７゜２　ｊ　Ｏ，１５Ｍ　Ｎａ０ｌ含有＞）０．５−お
よびＷＨＯのナンバー：’７５７５０２を基準にして作
成した標準工ｆＥ溶液（１２，５〜１６００Ｕ／ｆｆ１
Ｊ　　２０μｌと添加し、よく混合してから測定例−２
の０項で作成した不溶化試薬１個を入れ、３７　’Ｃで
１時間、加温する。加温終了後、試験管内の反応液を吸
引除去し、緩衝液−・工の１ｓｔを加えて洗浄する。こ
の操作を３回繰りかえした後、測定例−２の■の項で得
′たペルオキシダーゼ標識抗体２５０　Ｉｔ　ｌを加え
、３７°Ｃで２時間、加温する。以下、測定例−１の■
）項、インスリンの測定方法に準じて行ない１赤かつ色
の色素を４９２　ｎ　ｍで測定した。

■　酵素反応条件？変えた時の検量線の変化の細別 ■の１ＸＩｌｌ定方法に従って、工ｆＥ標準品を測定し
、検量線を作成した。なお、発色液には１．　ＯＯＩｌ
ｌ　Ｍの７ｍ　ｒｑｔアンモニウムを添加した場合と添
加しない場合について酵素反応を行なった。又、酵素反
応は室温、明所、１時間、および４°Ｃ１夜放置で行な
い、＋ｉｉＪ者の結果は第３図に、後者の結果は第４図
に示している。これらの図より明らかなように、工Ｉ／
Ｂ低濃度側において感度が大幅に改良されると共に、非
特異的反応がおさえられることがわかる。

測定例−３過酸化水素の定量 ０．３％０−フェニレンジアミン・２塩散塩及び６０　
ｍ　Ｍのｔｈ＋ンナトリウムを含むリン０ツ緩衝液（ｐ
ｌ（５゜０）５００μｌに、２０Ｕ／ｌ＋ｌのペルオキ
シダーゼ水溶液を５０μ！加え、さらに過酸化水素溶液
（濃度二〇、１０．２０　ｍＶ　／　ｗ＝ｌ　）　２５
１ｔ　１を加え、３７°Ｃ１３０分間酵素反応終了後、
ＩＮ硫１ｉ２−１／で反応停止後、４９２ｍｍでの吸光
度を測定し、検量線を作成した。なお、蓚酸す）　ＩＪ
ウムを含まない上記緩舗液を対照として測定した。

その結果は第５図に示している。この図より明らかなよ
うに、非特異的反応がおさえられ、感度においても改良
されていることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１　図１ｄ　Ｏ−３％の０−フェニレンジアミン、２
塩酸塩を含む発色液に３０譚Ｍの蓚１投ナトリウムを添
加し、室温、明所、１時間の酵素反応をすることによっ
て、得られたインスリンの検量線であ第２図は第１図と
発色液を同一にして、酵素反応条件を４℃、１夜行なっ
たものである。 第３図１ｄ　０．３％０−フェニレンジアミン。２塩酸
塩を含む発色液に１１００ＩＩの蓚酸アンモニウムを添
加し、室温、明所、１時間の酵素反応をすることによっ
て得られた工ＩＫの検量線である。 第４図は第３図と発色液を同一にして、酵素反１＋に、
条件を４°ｃ、１夜行なったものである。さらに為第５
図は発色剤として、６０ｆｆ１Ｍのイテ酸ナトリウムを
含イ１する０−フェニレンジアミン・２塩酸塩を使用し
、酵素としてペルオキシダーゼを用いた両眼化水素定量
用の検量線である。なお、発色剤にイ６１良ナトリウム
を含まないものを対照として測定した。 第１〜５図において、■印は蓚酸ナトリウムを添加した
発色液を使用した場合、Ｏ印は、無添加発色液を使用し
た場合を示す。 特許出願人　　　東洋紡績株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　フェニレンジアミンまたはその誘導体および
   有機還元剤を営むことを特徴とする安定な発色ンモニウ
   ムＪμであることを特徴とする特許請求の１１ｉα囲第
   １項記載の安定な発色剤組成物。