JPS5994068A

JPS5994068A - 血中膵ラ氏島細胞膜抗体のロゼット形成法による検出法

Info

Publication number: JPS5994068A
Application number: JP20399982A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Sugiura; 丸山昭治; Michio Nakazawa; 杉浦正彦; Shoji Maruyama; 石戸利貞; Toshisada Ishido; 中沢道夫
Original assignee: SOGO SEIBUTSU IGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: SOGO SEIBUTSU IGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1982-11-20
Filing date: 1982-11-20
Publication date: 1984-05-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、インシュリン依存性の糖尿病の患者の血中に
しばしば検出される膵う代品細胞膜抗体のロゼツト形成
による検出法に関する。

膵う代品細胞膜抗体は種特異性が低く、臓器特異性が高
いため、ラットやマウスの膵う成鳥単離細胞が該抗体検
出用抗原として用いられて来た。

この膵う成鳥単離細胞を用いた従来の膵う代品細胞膜抗
体の検出方法としては、間接螢光抗体法〔エイフ　レン
マーク（Ａｋｅ　Ｌｅｒｎｙｎａｒｋ）等著、・Ｎ、　
　Ｅｎｇ、、　Ｊ、詐ｄ　、　”　２９９．３７５．　
（１９７８）　：］　　や＋２５　■−プロティンＡ法
〔エイフ　レンマーク（Ａｋｅ　ＬｅｒｎｗＩａｒｋ　）　　等著、’　Ｄｉ
ａｂｅｔｑ−Ｌｏｇｉａ’１９．４４５．　（１９８０
）　）が使用されて来た。これらはいずれも、第１図の
概念図に示すように、膵う成鳥単離細胞１の表面抗原２
に膵う代品細胞膜抗体３を結合させ、該抗体３に螢光色
素等を標識とする抗ヒト免疫グロブリーン抗体４を結合
させ、螢光顕微鏡下でこの細胞を観察し、全抗原細胞の
数に対する螢光発生抗原細胞数の比率を求める方法であ
るＯしかし、これらの従来方法によると、多数の膵う代品単
離細胞（約１０００個／１検体）を用いる必要があり、
糖尿病患者の血清中の抗体の検索には高いコストを要す
る上、螢光顕微鏡や放射性同位元素などが必須であシ、
特殊々機器や施設を必要とするだめ、汎用性に乏しいと
いう欠点があった。まだ螢光物質による螢光は、時間の
経過と共に消失していくだめ検査時間上の制約がある。

また極めて弱い螢光を顕微鏡下で観察するという作業の
性格上、判定結果が検査員の能力、主観によって左右さ
れ、正確なデータを得ることが困難である（すなわち定
量性に乏しい）という欠点があった。

本発明は上記従来方法の欠点に鑑み、少量の膵う代品細
胞を用いて、正確かつ簡便に膵う成鳥細胞膜抗体の検査
を行なうことを可能とする方法を提供することを目的と
する。

この目的を達成するため、本発明による膵う成鳥細胞膜
抗体の検出方法は、マイクロテストプレートのウェルの
底表面に分散付着させた膵う代品単離細胞を抗原細胞と
し、該抗原細胞に被検血清を添加して、該抗原細胞の表
面に該被検血清中に存在する抗原細胞の表面抗原に対す
る抗体である膵う成鳥細胞膜抗体を結合させ、ついで抗
ヒト免疫グロブリン抗体またはプロティンＡを結合させ
た動物赤血球またはプラスチック製ビーズ等でなる標識
微粒子を添加し、これによって抗原細胞を中心とする標
識細胞のロゼツトを形成させ、顕微鏡下でこのロゼツト
の数を計数し、全抗原細胞数に対するロゼツト形成細胞
数の比を求めてこれを抗体価の指標とすることを特徴と
する。

以下本発明を実施例により説明する。本発明の方法は、
マイクロテストプレートを用いる方法であり、マイクロ
テストプレートの各ウェルの底表面に、抗原細胞として
膵う代品単離細胞を均一に分散付着させたものを用いる
。実施例においては、ポリ−ルーリジンをリン酸緩衝液
（Ｎａｃｌ　８０００り、Ｋｃｌ　２００”７ｆ、ＫＨ
２ＰＯ４２００１Ｗｙ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０１４
３４，６＃あわせて水１１に溶かした緩衝液（Ｐｈ７．
４））に１πｇ／　ｍｅ　　溶かした溶液をウェルに１
μｅ入れ、３０分室温で放置した後、純水で洗浄するこ
とにより、第３図（ａ）のよう々ポリーＬ−リジン層５
をウェル６の底面に形成し、その後マウスの膵う成鳥単
離生細胞（抗原細胞）を上記リン酸緩衝液に浮遊させＩ
　Ｘ　１０’個／ｍｌ　に濃度調整したものを１μβ入
れ（すなわち１つのウェル当り約１０００個の抗原細胞
を入れ）、マイクロテストプレートを遠沈機で２００ｆ
で５分遠沈する。これにより、第３図（ｂ）に示すよう
に、ポリーＬ−リジン層５に膵う成鳥単離生細胞７を分
散付着させた状態とする。

次に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）をイーグルしたＭＥ
Ｍ培養液に１０係含有させたものを１０μｅウエル６中
に加え、３０分室温で放置した後、過剰の胎児牛血清は
、牛血清アルブミン４ｇ、イーグルＭＥＭ１．０３ｆ　
、　ＨＥＰＥＳｏ、４．８ｙ、Ｌ−グルタミン（ｇｌｕ
ｔａｍｉｎｅ）　２９ｍ！　、　ＮａＨＣＯ３４２ｍＷ
を水で１００ｍ１．とする４％ＢＳＡ−ＭＥＭ培養液で
反復洗浄し、これによって牛血清アルブミン層８を形成
する。

これにより、ポリーＬ−リジン層５の余分の部分を被覆
すると共に、表面の電荷調整を行ない、後述の未反応ヒ
ツジ赤血球の脱離が容易と寿るようにする。牛血清アル
ブミンの代わりに、単なる血清等信の処理材料を用いる
ことができる。

次に、５６°Ｃで３０分間加熱することによって補体を
失活（非動化）した被検血清５〜１０μ４をウェルに添
加し、前記単離生細胞と血清中の膵う成鳥細胞膜抗体を
３７°Ｃで３０分反応させ、その後、未反応の免疫グロ
ブリン（主としてＩｇＧ）を前記４％ＢＳＡ−ＭＥＭ培
養液によって反復洗浄除去する。このような処理により
、第４図に示すように、表面抗原２を有する単離生細胞
７に対して被検血清中の膵う成鳥細胞膜抗体（免疫グロ
ブリン）３が結合したことになる。

続いて三塩化クロム等でプロティンＡ（すなわち黄色ブ
ドウ球菌の菌体蛋白）、あるいはウサギ、ヤギ等の抗ヒ
ト免疫グロブリン抗体９を表面に結合させた、ひつじ赤
血球１０を上記４％ＢＳＡ−ＭＥＭ培養液に５　Ｘ　１
０８個／ｍｌ含んだものを５μ４（約２　Ｘ　１０６個
）ウェル内に加えて、３７°Ｃで３０分反応させる。こ
れによって第３図（ｄ）、第４図及び第５図に示すよう
に、膵う代品細胞膜抗体３が結合したものに対しては、
該抗体３にヒツジ赤血球１０がプロティンＡまだは抗ヒ
ト免疫グロブリン抗体９を介して結合する。反応後はマ
イクロテストプレートを反転し、約１時間放置し、未反
応ヒツジ赤血球を脱離させ、光学顕微鏡によって観察す
る。この観察によって認められる実際の像は、第５図に
示すようなものとなる。すなわち被検血清中に抗体３が
多い場合には、単離生細胞７に対してヒツジ赤血球１０
が多く結合するが、このヒツジ赤血球１０は、単離生細
胞７の約％程度の直径を有するものであるから、ヒツジ
赤血球１０が結合してロゼツトを形成しているか否かを
容易に判明することができる。ここで、例えばヒツジ赤
血球１０が数個以上結合している細胞をロゼツト形成細
胞として、例えば１００個の細胞７の中に何個ロゼツト
形成細胞が存在するかぐ比率）性であるか否かを判定す
る。そして、ロゼツト形成細胞（陽性細胞）の比率が例
えば１０％以下であるときにに陰性、例えば１０％〜１
５％で擬陽性、例えば１５％以上で陽性と判定する。

なお本発明においては、上記実施例に限らず、種々の変
更が可能である。例えば、抗原細胞としては前記生細胞
の代わりに、３．０〜５．０％のバラフォルムアルデヒ
ドまだは３０％〜５０％の水溶性カルボジイミド試薬で
固定処理してなる膵う代品単離細胞を用いることもでき
る。また、この固定液にグルコースと牛血清アルブミン
を添加して固定処理を行えば、よシ良好に固定ができる
。そしてこの方法により、膵う代品単離細胞を胎児牛血
清とジメチルスルホキシド共存下に凍結保存できる。

また、ホルマリンあるいは水溶性カルボジイミド試薬等
で固定処理してなるプロティンＡあるいは抗ヒト免疫グ
ロブリン抗体によって表面を被覆してなるヒツジ赤血球
またはその凍結乾燥したものを用いることもでき、この
方法によりヒツジ赤血球を保存することができる。

また、前記プロティンＡあるいは抗ヒト免疫グロブリン
抗体により表面を被覆してなるヒツジ赤血球の代わりに
、ポリアクリルアミド樹脂やスチレン樹脂等合成樹脂製
のビーズにプロティンＡあるいは抗ヒト免疫グロブリン
抗体によって表面を被覆したものを用いることができる
。

まだ、本発明においては、被検血清の代わりに免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ　、　ＩｇＡ　、　ＩｇＭのいずれかあ
るいはこれら全体）を分画したものを被検検体として用
いることができることは勿論であり、この・分画したも
のを用いる場合も本発明に含せれる。

また、各試薬や血球等の組成、反応や放置時の温度や時
間等々についても必要に応じて種々変更しうろこともま
た言うまでもない。

以上述べたように、本発明の方法によれば、従来方法に
比べて膵う代品単離細胞が約数分の１で済み、また螢光
顕微鏡等の特殊な機器、施設を用いる必要がないため、
検査に要する費用が大幅に減少し、経済性があり、かつ
、検査の汎用性を向上させることが可能となる。また、
本発明の方法において、顕微鏡にて得られる像はロゼツ
ト形成か否かが明確に認識でき、検査者の主観の差がな
くなる上、経時変化が生じないので、経過時間によって
データが変わることがなく、正確なデータが得られ、定
量性が確保される。また、ロゼツト　形成細胞は保存が
できるので、観察だけは別の施設、場所で行なえ、作業
上の制約を緩和することも可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来方法の概念図、第２図は従来方法による場
合の観察像の説明図、第３図（ａ）〜（ｄ）は本発明の
方法を実施しだ場合のマイクロプレート中のウェル内の
状態変化の説明図、第４図は本発明の方法の概念図、第
５図は本発明を実施しだ場合に得られる観察像の説明図
である。２・・・表面抗原、３・・・免疫グロブリン、５・・・
ポリーＬ−リジン、６・・・ウェル、７・・・単離生細
胞、８・・・牛血清アルブミン、９・・・プロティンＡ
ｔたは抗ヒト免疫グロブリン抗体、１ｏ・・・ヒツジ赤
血球特許出願人　　株式会社相互生物医学研究所代理人
　　　弁理士　若　１）勝　− 手続補正書（自発）昭和５７年１２月２２日特許庁長官殿１、事件の表示昭和５７年　特許願第２０３９９９号２、　発明の名称　血中膜う代品細胞膜抗体のロゼツト
形成法による検出法３、補正をする者事件との関係　特許出願人住　所　東京都中野区中央４丁目２５番１０号株式会社
　相互生物医学研究所氏名代表取締役近藤健次４、代理人ｉ６、補正の対象明細書中発明の詳細な説明の欄７、補正の内容　別紙の通り明細書中下記の補正を行う。（１）２頁１２行のｒ　Ｄｉａｂｅｔ９−Ｌｏｇｉａ　
Ｊをｒ　ＤｉａｂｅｔｏＩ！ｏｇｉａ　Ｊと訂正する。（２）４頁１７行の「ポリーＬ−リジン」を［ポリーＬ
−リジン］と訂正し、ｒＮａｃｌＪをｒＮａｃ６Ｊと訂
正する。（３）４頁１８行のｒＫｃｌＪをｒＫｃｎＪと訂正する
。（４）４頁１９行のｒ　Ｐｈ　ＪをｒＰＨＪと訂正する
。（５）５頁１６行ガいし１７行の「過剰の胎児牛血清は
、」を削除する。以上

Claims

【特許請求の範囲】

マイクロテストプレートのウェルの底表面に分散付着さ
せた膵う成鳥単離細胞を抗原細胞とし、該抗原細胞に被
検血清を添加して該抗原細胞の表面に該被検血清中に存
在する抗原細胞の表面抗原に対する抗体である膵う代品
細胞膜抗体を結合させ、ついで抗ヒト免疫グロフ゛リン
抗体またはプロティンＡを結合させた動物赤血球または
プラスナック製ビーズ等でなる標識微粒子を添カロし、
これによって抗原細胞を中心とする標識細胞のロゼツト
を形成させ、顕微鏡下でこのロゼツトの数を言十数し、
全抗′原細胞数に対するロゼツト形成細胞数の比を求め
てこれを抗体価の指標とすることを特徴とする血中膜う
代品細胞膜抗体のロゼツト形成法による検出法０　−