JPS5998019A - インタ−フエロンの相乗効果 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ものである。よシ詳細に述べると、本発明は、ヒトのガ
ンマー（γ）インターフェロン（ＩＦＮ−γ）（これは
ヒトの免疫性インターフェロンと呼ばれることもある）
を、ヒトのアルファ−（α）インターフェロン群（’Ｉ
ＦＮ−α）、そのハイブリッド（ＩＡ千重）およびヒト
のベータ−（Ｉ３）インターフェロン（ＩＦＮ−β）の
いづれかと組み合せると、単独で試験した時のそれぞれ
の活性に基づいて公正に予想し得る活性よシ遥かに高い
生物活性が得られるという知見Ｖ２Ｃ基づくものである
。この実験結果は、これまで組み換えＤＮＡ技術を用い
る以外は得ることのできなかった、あらゆ芯意味におい
て、それぞれのインターフェロンだけを含有している非
常に純粋な製剤を使用１７たので、インターフェロン蛋
白質自体の真の協力作用であることを示している。

本発明の背景、特に実例を示し、その実際について更に
詳細な情報を提供するために本明細書で引用した刊行物
は、本明細書の末尾に番号を付してまとめた。

ヒトのインターフェロンは、観察された生物学的活性寂
よび分子構造の違いに基づいて３つのグループに分類さ
れている。例えば、ヒトのα−インターフェロンは、そ
のアミノ酸配列のほぼ８０〜８５％が相同である一部の
蛋白質群である。このα一系列の蛋白質は、抗ウィルス
作用および細胞増殖阻止作用の両方を持っていることが
知られている（文献１〜１０）。同様に、ＩＦＮ−α群
に共通の相同性の約２５〜３０％しか持たない１ＦＮ−
βも生物学的活性を示す改献１１）。最近才で最もつか
みどころのなかったインターフェロンである■ＦＮ−ｒ
は、他の系列のインターフェロンと本質的（で相同する
さころはないが、それでも他の２系列のインターフェロ
ンが示す活性と、その性質を異にしない活性を示す（文
献１２）。

ＩＦＮ−αおよび■ＦＮ−βインターフェロンは、ウィ
ルスにさらした細胞により生産され、それから単離され
ている。ＩＦＮ−γインターフェロンは、特異な細胞分
熱刺激に応じてリンパ球内で誘発される。天然の資源か
ら得られたインターフェロン製剤は、生物学的活性を比
較する研究に使用されて来た（文献１３〜１６）。これ
らの研究は、哺乳動物（マウス）の蛋白質系に基づくも
のではあるが、その結果を、ヒトのインターフェロン製
剤を用いて実施することのできる対応する研、究に、そ
のまま示唆を与えるものではない。更に、これらの研究
は、やむなく比較的不純な製剤を用いて行なわれたので
、得られた結果がインターフェロンとしてのインターフ
ｌ丘よるのか、他の干渉性の不純物（蛋白性の不純物ま
たはその他のもの、例えは各種のリンホカイン）による
のか、あるいけその混合物の組合せの効果によるのか、
という解釈上の混乱が生じる。更に、これらの比較的不
純な製剤を得るのに使用した細胞は、細胞変性効果を持
っていることが知られており、このことも事態を更に複
雑にしている。　　　　□組み換！ＤＮＡ技術によって
ヒトのインターフェロンが生産されるまで（文献１．１
１．１２．１８）、天然のヒトのインターフェロンの生
物学的性質の確定的な決定１・ま、純粋な物質を得るの
が困難であるが故に混乱していた。インターフェロンは
強力な活性を有するが故に、その様な不純な製剤でも生
物学的な分析が可能であったが、その結果がどの程度、
全部があるいけ一部が、不純物の存在によるものかが不
明であった（文献１９．２０）。蛋白質の相互作用およ
び混合活性は、よく知られてはいないが、あり得る現象
である・従って、この様な比較的不純な製剤から（才、
明確な生物活性の結果を予測し得ない。事実、更に純度
の良い製剤を得ようと試みた結果、もつと不純な製剤に
ついて観察されたものとは異なるレベルの活性が得られ
たという報告がある（文献１９）。

比較的不純な物質を用いて行なわれたインターフェロン
製剤（マウスについては文Ｍ１４．１５、ヒトについて
は１７）を混合した時の増強効果を調べる為に行なわれ
た研究から、原因と結果について憶測を超えた結論を出
すことは、科学的に根拠のないことであろう。これらの
研究は、増強についての憶測の基礎を提供したけれども
、実際の増強効果があったという証拠（は明らかにされ
なかった（文献１４）。

本発明は、不純な物質を用いて行なわれる研究に付随す
る問題に対処するものであり、インターフェロンによる
インターフェロンの相乗効果を証明するために必要な証
拠を提供するものである。

組み換えＤＮＡ技術の出現によシ、遺伝子的に変換した
宿主培養物から、ヒトのインターフェロンを多量に、そ
して従来得られなかった純度で生産、半部することがで
きる様、・こなった（文献１．１１．１２．１８）。従
って、各種のヒトのインターフェロンか互いに及はし合
う真の効果についての仮説を試１験することかできるこ
ととなった。本発明は、この様な試験の結果、完成、さ
れたものである。

本発明の第１の目的は、ヒトのβ−インターフェロン（
ＩＦＮ−α）、その・・イブリッドおよびヒトのβ−イ
ンターフェロン（ＩＦＮ−β）カラなる群から選ばれる
インターフェロンと、ヒトのγ−イシターフエロシ（Ｉ
ＦＮ−γ）との、相乗効果的な、薬学的疋純粋々混合物
からガる組成物を提供することにある。第２の目的は、
ＴＦＮ−α、そのハイブリッドおよびＩＦＮ−βと組み
合わせるとＩＦＮ−γの生物学的活性が相加的にではな
く、相乗的に増大するという注目すべき発見に基づいて
、１）薬学的に純粋な、相乗効果を発揮する量の該イン
ターフェロン群を混合することにより相乗効累計生せし
める方法および、２）薬学的に純粋な、相乗効果を発揮
する該インターフェロンの組み合せ物を、その１捷で、
あるいは通常の薬学的に許容し得る賦形剤−トたは担体
と混合して使用することによりヒトヲ治療する方法、を
提供するものである。更に本発明の目的は、上記のイン
ターフェロン組み合せ物を含有する医薬組成物の製造法
および相乗的な生物学的効果を得る目的で該医薬組成物
をヒトに投与する方法を提供することにある。

本発明の思想は、薬学的に純粋なヒトのα−５β−およ
びγ−イシターフエロシ組み合せ物は、生物学的活性が
相乗的に増大するという点にあへ従って本発明は、本明
細書中に具体的にあるいは示唆的に記載された特定の態
様だけに関するものではない。

本発明における２種の試剤を組み合せた時の応答を効果
的に図式的に分析する為に、各試剤を別々に、そして組
み合せて使用した時の効果を示すテークを利用してイン
ボログラム（１ｓｏｂ○］、Ｏｇｒａｍ）を作成する（
文献２１〜２４）。この方法は例７＝トばＩ　ＦＮ−４
Ａ、　Ｉ　］’Ｎ−β１、およびＩＦＮ−７−の抗増殖
作用を分析するのに用いられて来た。ここに記載されて
いる１つの実験に使用されたヒトＩ　Ｆ　Ｎ　、　Ｉ　
Ｆ　Ｎ　−ａ　Ａ　（以前（ｒＪ　Ｌ６　Ｉ　Ｆ　−Ａ
または１１′Ｎ−σ２と呼ばれた）、ＩＦＮ−β１およ
びＩＦＮ−γけ、Ｅ、　ｃｏｌｉ　（大腸菌）中で合成
され（文献１．１１．１２．１８）、これら３つのイン
ターフェロンは、ＳＤＳボリアクリルアーミドゲル電気
泳動およびＩ−Ｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析知よれば、純度９５
％以上で用いられた初めてのものであった（文献７）。

この程度の純度のハイブリッドＩ　Ｆ　Ｎ　−（ｌ　Ｓ
　ｉだ入手可能である（文献３．２５）。ＩＦＮの比較
は、ＩＩ”Ｎ−αＡおよびＩＦＮ−γはＮＩＨヒト白血
球標準（ＧＯ２３−９０１−５２７）、ＩＦＮ−βＩｊ
Ｎ　Ｉ　Ｉ−Ｉ　ヒト線維芽細抱標準（ＧＯ２３−９０
２−５２７）に対して標準化し、水＠注口内炎ウィルス
をチャレンジした］１ＩｅＬ〜細胞で生物検定した抗ウ
イルス単位に基づいて行なった。対照標準は、Ａｎｔｉ
ｖｉｒａｌ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　Ｐｒｏｇｒａｒｎ　
ｏｆｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕ、ｔｅ　
ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｃｌ　Ｉｎ：！’ｅｃｔｉ
ｏｕｓ　ＤｉｓｅａｓｅｓＮａｔｊ、０ｎａｌ　Ｉｎ５
ｔｊ、ｔｕｔｅＳＯｆ　ｆ（ｅａｌｔｈ、　　ワシント
ンＤＣから自由に入手できる。ヒトの黒色腫セルライン
、Ｈｓ２９４　ＴはＣｅ１ＩＣｕｌｔｕｒｅ　］）ｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔ　。

Ｎａｖａｌ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　０ａｋｌａｎｄ　ＯＡで着手、クローンされ
、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｑａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉ
ｓＢｒａｎｃｈ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　から入手できる。このセルラインの
起源、特性および細胞遺伝学については既に報告されて
いる（文献２６．２７）。これらの細胞の増殖は部分的
に純化されたヒトの白血球ＩＦＨにより阻止されること
、およびこの阻止によって、細胞の生活能力は衰えない
ことがわがっている（文献２７）。

本明細書に於いて、「遺伝子的に変換した宿主細胞」と
は、それ自体（内性）の過程での固有の生産物ではない
ポリペプチド（外来性ポリペプチド）を生産せしめる様
に、人為的に挿入されたＤＮＡ配列を含有している微生
物、または哺乳動物の培養物（カルチャー）を包含する
、その他の細胞培養物を意味する。組み換えＤＮＡ技術
の最近の精密さにより、例えばＥ、　Ｃ○１１に哺乳動
物の蛋白質を生産せしめるべく、ＤＮＡ配列を操作する
ことが可能となつ＞”Ｃ６宿主細胞の遺伝子的変換例よ
ってもたらされるこの様な生産も、上記の用語を、その
効果の面で定義づけている。

また、組み換えＤ　Ｎ　Ａ技術により、外来性ポリペプ
チドを実質的に純粋な形で生産することができる。とい
うのは、宿主細胞によって同様の起源の他の蛋白質が生
産されることがなく、他の宿主細胞物質からの生成、物
の分；雛が容易だからである。

組み換えＤＮＡ技術（（より、最近、少なくとも約９５
係以上の純度の外来性蛋白質を生産することができる様
になった。この限度を、本明細書では「実質的に不純物
を含まない」と定義する１、この限度（・ス、天然から
得られる、リンホカインや細胞変性物質の様な他の干渉
物質を含んでいないインターフェロン製剤より太きい等
紙量の活性レベルに相当するものである。例えば、組み
換えヒト白血球インターフェロン（ＩＦＮ−α）および
線維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）の比活性−
゛、約Ｉ　Ｘ　１０８単位／総蛋白質（ｍり）と計算さ
れテオリ、ヒトのγ−インターフェロン（Ｉ　Ｆ　Ｎ　
−γ）のそれは、少なくとも１０６単位／ｍりのオーダ
ーである。

本発明で使用される組み換えＩＦＮを、例えば細菌から
純化することができる１つの方法を、■ＦＮ−γを例に
とって以下の一般的手順に示す。

１高圧でホモジナイザを通過させ、流出液を水浴で冷却
することによる、高電導率の溶菌緩衝液（約ｐＨ８）中
の細胞の抽出。

２攪拌下、例えば４°Ｃでのポリエチレン−イミン添加
によるＤＮＡの沈殿化。

３細菌性蛋白質のｐｎ沈殿、再びＩＦＮ−γを溶液中に
保持。

４４°Ｃで遠心分離して固形物を分離。

５限外沖過による、ｐＨ再調節の後の上澄液の濃縮。

６、低電導率緩衝液に対する濃縮物の透析。

７、遠心分離；Ｃよる固形物の分離と１ＦＮ−γの溶液
中への残留。

８カルボキシメチルセルロースでのイオン交換クロマト
グラフィー、イオン強度を２大させるグラジェント法で
溶出。

９燐酸カルシウムゲルでのクロマトグラフィー、イオン
強度を増大させるグラジェント法で溶出。

１０弱い変性条件下でのカルボキシメチルセルロ−ス 強度を増大させるグラジェント法で溶出。

１１ゲルい過クロマトグラフィーによる分１雑、以上の
方法で純度９５弁以上の物質カニ得られる。

本明細書に於いて「薬学的に純粋」なる用語（は、組み
換えＤＮＡ技術により・調製し得る、イ言頼のおける生
物学的試験粋よび例えばヒトの治療のために投与するの
に適した、上で定義したインターフェロンの製剤を意味
する１。

相乗効果的混合物は、それに従えば各薬物のＭＩＣ（最
小阻止濃度）の４分の１捷たはそれ以下の組み合せで、
所望の観察された効果カニ得られるという、標準的な、
認められた根本的原理で定義される（文献２４）。その
様にインターフェロンを各種の比率で試験し、インボロ
グラム（後述）を作成すると、相乗効果は、少なくとも
０．２５ＦＩＣ（フラクショナル阻止濃度）点に達する
＜　？Ｙんだ曲線によって示すことができる。従って、
この基卑を参照すると、試験した組み合せのへ１■Ｃを
知ることができ、相乗効果的混合を達成するのに必要な
各成分のΔ１■Ｃがわかる。

Ｈｓ．２　９　４　Ｔセルラインについてここ一己１１
した如く行なった生物検定に基づき、ＩＦＮ−ｒと１Ｆ
Ｎ−αの有効的な相乗効果量は、ＩＦＮ−γ力玉約０５
〜約７．　’？ｆｉ９　／ｍｌ，　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−　ａ
は約２５〜約０、３μｙ’／ｍｌＪの範囲とすることが
できる、と結論し得る。同様の計算から、ＩＦＮ−γの
量−ｉ＝約２〜約．４　５　μｙ／ｍｌであり、ＩＦＮ
−β７５玉約００７〜約ｏｙｏ　ｏ　ｓμｙ／ｒｎｌで
あるという結論・も得られる、、実際の使用量は、上の
計算に固有の市１］（長により、上ヒ較的広い範囲で変
えることができる。しカニし、本明細書の記載に基づき
、本発明の相乗効果を発揮させ得る活性成，分の量をも
つと正確（で決定する・ことは、当業者の通常の技術範
囲で行なうことｉ＝できる・ 添付の第１図は、細胞の増殖に及ぼすＩＦＮ−γおよび
ＩＦＮ−αＡの効果を示すものである。

ヒトの黒色腫細胞（ＩＩＴｓ　２９４　Ｔ）は、１０％
の牛胎児血清を加えたＪ）ｕｌｂｅｃｃｏ改良のＥａｇ
ｌｅ培地　（Ｏｊ、ｂｃｏ　）中、単層として増殖させ
た。（ａ）投力量一応答曲線、細ｊＩＩ植え付けてから
（１×１０５細胞／３５ｍｍの容器）２４時間後に、培
養液を、増加濃度の１ＦＮ−γ（ト→）またはＩ　Ｆ　
Ｎ　−ａ　Ａ（）一つ）を含有している新しい培地で義
き換えた。ＩＦＮ添加添加９問 照細胞（ＩＦＮ処置を受けないもの）の係で表わした。

（ｂ）（１）　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−　ｒおよびＩＦＮ−ａＡ
単独（（２５単位／−ｌ）と増加する＠　Ｉｇｔｙ）　
Ｉ　Ｆ　Ｎ　−　ａ　ノ〜との組み合せ（○）、の投与
量一応答曲線から得られる５０％細胞増殖阻止濃度から
描いたインボログラム。値はフラクショナル阻止ａ度（
ＦＩＣ）で表わしである。ＩＦＮ−γについては、１０
のＦＩＣ（は３５単位／ｆｎｌを表わし、Ｉ　Ｆ　Ｎ　
−　ａ　Ａについては１０のＦＩＣは５００単位／ｍｌ
を表わす。（）内の値は、明雑書１（記載した様な各組
み合せのＦＩＣインデックスを表わす。

第２図（・ま細胞増殖に及ぼすＩＦＮ−γおよびＩＦＮ
−βｌの効果を示している。この実験の筋書きは第１図
の説明に記載しである，　（ａ．）　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ（
・−・）および■ＦＮ−βｌ　（　０−（）　）の投与
量一応答曲線。（ｂ）（ｔ）　Ｉ　Ｆ　Ｎ−γ単独およ
びＩＦＮ−β１単独（・）；（ｉｉ）一定量のＩＦＮ−
γ（１０、２５丑たけ５０単位／１ｎｌ）と増加濃度の
ＩＦＮ−βｌとの組み合せ（○）：および（ｉｎ）一定
量のＩＦＮ−β１（５、１０または１５単位／−）と増
加濃度の１ＦＮ−γとの組み合せ、の投与量一応答曲線
から得た５０％細胞増殖阻止濃度に基づいて描いたイン
ボログラム。第１図（ｂ）と同様、値Ｂ　Ｆ　Ｉ　Ｃで
表わしてろる。ＩＦＮ−γについて（ｄ、１０のＦ　Ｉ
Ｃは２００単位／ー１ＩＦＮーβ１について１は、ｊＯ
（７）ＦＩＣ［１６単位／ｍｔＰ．，；表わす・第３図
は細胞増殖に及ぼすＩＦＮ−αＡおよびＩ　Ｆ　Ｎ−、
／ｌ，の効果のインボログラムである。この実，１倹の
筋升きは第１図の説明に記載しである。値はフラクンヨ
ナル阻正濃度に標準化し、代表的実験からの結果を表わ
している：実験１（・）：実験２（○）；実験３（ム）
。細胞増殖を５０係阻止したＩＩ”Ｎ−αＡ単独および
ＩＦＮ−β１単独の濃度はそれぞれ８００〜２０００単
位／―、および１０〜３２単位／づであった。これらの
値はＦＴ．Ｃ１．Ｑに標準化された（・）。

ＩＦＮ−γとＩＦＮ−αＡの相互作用の分析は第１図に
、ＩＦＮ−γとＩＦＮ−β１のそれ（ｄ第２図（で示し
た。実験の組み立ては両データとも同じである。Ｈｓ　
２　９　４　Ｔ細胞を増汀する濃度の１つのクラスのＩ
ＦＮ（ＩＦＮＩ）単独、もう１つのクラスのＩＦＮ（Ｉ
ＦＮ２）単独、または両ＩＦＮの組み合せ物と共ンてイ
ンキュベートした。組み合せ物は、一定の準阻止量のＩ
ＦＮ２と混合した増加濃度のＩＦＮｌ、および準阻止量
のＩＦＮｌと混合した増加と張度のＩＦＮ２からなって
いる。生存細胞の数（、１　Ｉ　Ｆ　Ｎの添加９６時間
後（（測定し、２−３ダブリングを通過した対照細胞（
　ＩＦＮ処置を受けなかったもの）の係で表わした。細
胞増殖を５０％阻止するのに必要なＩＦＮの濃度をそれ
ぞれのインボログラムに示す。細胞増殖を５０％阻止す
るのに必要な各ＩＦＮ単独の濃度は、実験ごとに変動し
た。このことは、ＩＦＮ分析（アッセイ）に於ける偏差
もあろうが、細胞過程（（おける、ＩＦＮｉ／Ｊよジひ
き起される細胞増殖阻止効果に対する細胞の感受性が変
化することを示している。従って、この種の実験におい
て本質的な二貫性を得るためには、１つのインボログラ
ムに使用する全ての点を同じ実験から得ることが必要で
あった。即ち、複製培養を同時にＩＦＮｌ、ＩＦＮ２お
よびＩＦＮｌおよびＩＦＮ２の組み合せ物で処理し、組
み合せ物で使用した各ＩＦＮの濃度を間違いなく全て準
阻止量とした。

第１図００投与量一応答曲線かられかる様に、５００単
位／づのＩＦＮ−αＡまたは３５単位／−のＩＦＮ−γ
により細胞増殖が５０係阻止される。ＩＦＮ−γおよび
ＩＦＮ−αＡ単独および組み合せ物の５０％阻止点から
描いたインボログラムを第１図Ｃｂ）に示す。横１坐標
および縦座標の点は、細胞増殖の５０％阻止に必要なそ
れぞれＩＦＮ−αノル単独およびＩＦＮ−γ単独の、１
０のフラクンヨナル阻止ｃ度（ＦＩ　Ｃ）値に標準化さ
れた量を表わしている。これらの点の間に引かれた線上
の、組み合せ処置により得られる点は、相加効果を表わ
すこ（！：になる。この線より左にくぼんだ曲線・七形
成する点は相加以上の応答、即ち相乗的応答を示し、一
方この線より右側のくぼんだ曲線を形ｉ戎する点は、阻
止あるいは拮抗作用を意味する準−相加応答（５ｕｂ−
ａｄｄｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　）を表わすこと
になる。第１図（ｂ）に示す様して、ＩＦＮ−αＡおよ
びＩＦＮ−γの混合物を使って得た５０％点は、相加直
線の左にくぼんだ曲線を形成し、相乗応答の基準に適う
ものでδった。

ＩＦＮ−γおよび１．　Ｆ　Ｎ−β１の効果を第２図に
示す。

細１泡と２０ｏ単位／−のＩＦＮ−γまだは１６単位Δ
４のＩＦＮ−βｌで処理すると、細胞の増殖は５０％阻
止される（第２図ａ）。ＩＦＮ−γ単独、■１′Ｎ−β
ｌ単独およびＩＦＮ−γとＩＦＮ−β１の組み合せの５
０％阻止点から描（ハたインボログラムを第２図（ｂ）
に示す。第１図と同様Ｉて、全ての点はフラクショナル
阻止濃度で表わされてお９、得られたくぼんだ曲線は超
相加的な、即ち相乗的な応答を表わしている。

この細胞系における、ＩＦＮ−αＡとＩ　Ｆ　Ｎ　−β
ｌを組み合せた時の相互作用も調べた。第１図および第
２図の様に、各種濃度のＩ　Ｆ　Ｎ　−ａ　ＡおよびＪ
ＦＮ−β１単独および組み合せ物で細胞を処理し７１ｏ
この様な実験で得られた結果は第３図に示す様に一貫性
のないものであり、ある組み合せでは相乗作用の定義（
で合致し、ある組み合せでは拮抗的であるらしいことが
わかった。これは、ＩＦＮ−γとＩＦＮ−σＡまたは１
ＦＮ−β１との組みで 合せ処理した場合、再現性よく、第１図および第△ ２図シコ示す様な相乗的応答が得られたことと著しい対
照をなすものであった。第３図に示したデータは、Ｉ　
Ｆ　Ｎ　−ａ　ＡとＩＦＮ−β１の相互作用ば、ＩＦＮ
−γとＩＦＮ−αＡあるいはＩＦＮ−βｌとのそれより
も複雑であることを示している、。

相加１土と相乗性を区別するのに、各組み合せで使用し
た個々の試剤のＦＩＣ値の総計Ｏて等しいフラクショナ
ル阻止濃度（Ｆ　Ｉ　（１）を利用することができる。

相乗的な応答は、ＦｉＣインデックスが０．５より小さ
いことで定義される：即ち、各試剤のＦＩＣの１／４ま
たはそれ以下の組み合せで５０係の阻止が達成される場
合である。ＦＩＣインデックスが１というのは相加的応
答である。第１図（ｂ）および第２図（ｂ）のインボロ
グラムの点の（）内に示したＦＩＣイシインクスは０．
５以下であり、相乗的応答の定義Ｃて合致するものであ
る。例えば、第１図（ｂ）に示す様に、細胞増殖の５０
％阻止は、５０単位／−のＩＦＮ−αＡと８単位〜のＩ
ＦＮ−γの組み合せ量で達成された（ＦＩＣインデック
スＩ″ｉ、０．３）。同様に、第２図１１ｂ）・に示す
様に、４単位／−のＩＦＮ−βｌと１０単位／祠のＩＦ
Ｎ−ｒとの組み合せ量で５０％の絹鳴増殖阻止がみられ
た（ＦＩＣインデックスＩ、ｉｏ、３）。この様にの して実験データを調べることにより、ＩＦＮ群間。

活性の程度を決定することができる。即ち、ＦＩＣイン
デックスが約０．３であるということは、■ＦＮ−γと
ＩＦＮ−αＡまたはＩＦＮ−β１との相乗性の程度がこ
の細胞系では同じであることを示している。

以上の結果から、ヒトの組み換えＩＦＮ−αＡ、ＩＦＮ
’−β１またはＩＦＮ−γの高度に純化された製剤は、
それぞれヒトの黒色腫細胞の複製を阻止することができ
、細胞増殖の５０％阻止は、ＩＦＮ−αＡ−４たはＩＦ
Ｎ−γより、低い濃度のＩＦＮ−βｌで達成されること
がわかる。

具体的な態様では、ＩＦＮ−γとＩＦＮ−αＡまたはＩ
ＦＮ−β１との組み合せの高純度の製剤でヒトの黒色腫
細胞を処理すると、各ＩＦＮ単独の場合に必要とされる
濃度より遥かに低い濃度で細胞増殖の５０％阻止が達成
されることがわかった。

抗増殖活性および抗ウィルス活性は両者とも、１個のＩ
ＦＮ分子の本質的な性質の例であるので、異なったタイ
プの純化ＩＦＮの組み合せで処置すると、その抗ウィル
ス活性に於いても同様の活性化か荀られることになる。

本発明に係る組み合せ物は、同様の活性を示す薬剤の投
Ｊｊ法として認められているいかなる方法によっても投
与することができる。例えば経口、非経口、局所投与な
どが挙げられ、全身投寿剤型であってもよいが、局所的
丑たは静脈内注射か好ましい。

投Ｊう方法に応じて、本発明の組成物は固状、半固状、
丑たは液状の投与形態、例えば錠剤、ピル剤、カプセル
剤、粉末、液剤、懸濁剤などとすることができる。正確
な投与量を１回投与する為の単位投与形態にするのか好
丑しい。このＩｆ’Ｊ１成物１・才物１の薬学的和体、
賦形剤を含んでいてもよく、更に他の医薬、薬学的試剤
、担体、補助剤などを含んでいてもよい。この様な賦形
剤として他の蛋白質、例えばヒトの血清アルジミンまた
は血漿製剤を含んでいてもよい。

投与される活性物質の量は、治療［〜ようとする患者、
疾患の重さ、投与方法および担当医の判断に応じて変わ
る。

固状ｍ才物の為の通常の非毒性固状担体としては、薬学
的等級のマンニット、ラクトース・スターチ、ステアリ
ン酸マグネシウムなどが挙げられる。薬学的Ｑて投与し
得る液状組成物は、例えば水、食塩水、水性デキストロ
ース、グリセロール、エタノールなどの担体に溶解また
は分散（７て、溶液または懸濁１夜の形で調製すること
ができる。所望により、投与しようとする医薬組成物（
は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、ｐ
ｌ＋緩衝剤など、具体的に（は酢酸すトリウムまたはソ
ルビクシモーノラウレートなどを含んでいてもよい。こ
の様な投与剤型を製造する実際の方法は光業者にはよく
知られているかあるいは、容易に推測できる（例えば＆
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａ’ｃｅｕｔｉｃａｌ
　５ｃｉｅｎｓ。

Δ’ｆａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ
、　Ｂａ５ｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、１５
版、１９７５参照）。投与する組成物あるいは製剤１ノ
寸、いづれも、治療しようとする患者に所望の治療効果
Ｇ与えるのに有効な量の活性成分を含んでいる。

以下に本明細轡で引用した文献を列挙する。

］、、Ｇｏｅｄｄ、ｅｌ玉ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２
８７，４１１（１９８０）。

２、　Ｙｅ］、ｖｅｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃｊ−ｄｓ　Ｉ（ｅｓｅａｒｃｈ　９．７
３１（１９８１）。

３、’％＋ｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、、　Ｎ、、１ｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　１（ｅｓｅａｒｃｈ　９．６１５３
（１９８１）。

４曹ｃｋ　ｅｉ虹、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　ＶｉｒＯｌ、
　５７，２３３（１９８１）。

５、　Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ（
ｅｓｅａｒｃｈ　４２．１３１２（１９８２）。

（３，Ｗｅｃｋｅｔ　心、　Ｉｒ；ｆｅｃｔ、ｉ［ｎ１
ｌｎ、　３５．６６０（１９８２）　。

７Ｎへ＆ｔｚｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ、　、　　Ｊ、　　
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ　３８
１（１９８１）。

３、Ｗｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
　ａｎｄ　Ｉｒｐ、ｍｕｎｉｔｙ、印刷中ｏ・９、８ｍ
ｏｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、　Ｏｐｈｔｈａ
ｌｍＯｌ、　１００．４８Ｈ１９８２）。

１０Δ’Ｉａｓｕｃｃｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２０９．１４３１（１９８０）。

１１、　Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、　、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ：１−ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ、ｒｃｈ　８．４
０５７４１．９８０　） １２、（３ｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　、　Ｎａｔｕｒｅ
　２９５．５Ｃ１３（１’９８２）。

１３．０ｒａｎｅ　ｅｔ　小、　Ｊ、　＆ｔ、　Ｃａｎ
ｃ、　Ｉｎｓ’ｔ、　６１，８７１（１９７８）。

１４、　Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　
Ｉｎｊｅｃｔ、　ａｎｄ、　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　２６．
２４８（１９７９）。

１５、　Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ、　Ｃｅ、ｎｃｅｒ　
Ｉ（ｅｓｅａｒｃｈ　４２，８６９（１９８２）　。

１６、　Ａｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）７７、２５２
８（１９８０）。

１７、　Ｆ１ｅｉｓｃｈｒｒ＋ａｎｎ、“Ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎ　ＰｏｔｅｎｔｉａｔｉＯｎ：　Ａｎｔｉｖｉ
ｒａｌＥｄｓ、ＭＬｌｔ＊　ａｎａ　Ｋｉｒｃｈｎｅｒ
、　ｓ、　Ｋａｒｇｅｒ、　Ｂａ５ｅｌ、　ｐ、５３以
下つ ２０、　Ｉ）ｅ’１ｅｙｅｔ　ａｌ、　、　、Ｆｏｒ、
　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　１０．８７７（１９８０）　。

２１．５ｔｅｅｌ、　Ｇ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｎ
ｔ、　Ｊ、　Ｒａｃｌｉａｔｉｏｎ　Ｃｆｆ１ｃｏ］−
ｏｇｙ１３ｉｏ１．　Ｐｈｙｓ、　５．８５（１９７９
）　。

２２、　ＲＩ３ｄｐａｔｈ、　Ｊ、Ｌ、　、Ｔ、ｎｔ、
Ｊ、　Ｉ（ａｄｉａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｌ、　、　３８．
３５５（１９８０）。

２３　Ｎ■１ｓｏａ　＋　Ｇ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｐ
ｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂａ、ｃｔｅｒｊ、ｏ］−
〇Ｊ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　　Ｉｒｎｒｒｎｍｉｔｙ（
Ｔｏｐｌｃｙ　　ａｎｄ−Ｗｉｌｓｏｎ、　　ｅｉ）　
ｖＯコ−１、Ｍｊｌｌｉａｍｓ　ａｒｉｄ　’Ａ’１ｌ
ｋｅｎｓ、　Ｂａ、１ｔｊ、ｍ○ｒｅ、　Ｍ５．、　、
　（１９７５）２４、ＯＯｏｄｍａｎ、　　Ａ、、　　
ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｔｂｅ　　ＰｎａｒＤｌａ、ｃｏ
ｌｏｇｉｃａ、Ｉ　　Ｊ３ａＳｉｓｏｆ　Ｔｈａｒａｐ
９ｕｔｉｃｓ　Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ工ｓｈｉ
ｎｇ　ｃｏ、、　Ｉｎｃ、　。

Ｎ、Ｙ、、　（１９８０）。

２５、　Ｆｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ　Ｐυ−’ｂ１．１ｃａｔ］、ｏｎ　Ｎｏ
、００５１８７３（１９庵ｙ１９８２）。

２６Ｃｒａａｓｅｙ、　Ａ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ
　Ｖｉｔｒｏ　１５，３４２（１９７９）。

２７．０ｒｅａｓｅｙ、　Ａ、Ａ、　ｅｔ　ａＬ、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　ＡＣａｄ、８ｃｉ＋（ＵＳＡ）７
７、１４７１（１９８０）。

２８、（Ｅｒｅｓｓｅｒ、　１．　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ＋（′ＴＪＦ３
Ａ）６６．１０５２（１９７０）　。

２９、　Ｓｔｅｗａｒｔ　ＩＩ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２６２．３００（１９７６）。

３０、Ｂｅｒｇ、　Ｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ・Ｇｅｎ、
ＶｉｒＯｌ、　５０，４４１（１９８０）。

３１、　Ｅｖｉｎｇｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａ
ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
。

霊、　３１９（１９８１）。

【図面の簡単な説明】

第１図は細胞増殖に及ぼすＩＦＮ−γおよび■ＦＮ−α
Ａの効果を示すグラフ、第２図は細胞増殖・足及ぼすＩ
ＦＮ−γおよびＩＦＮ−ａｌの効果を示すグラフ、第３
図は細胞増Ｈに及ぼすＩＦＮ−αＡおよびＩＦＮ−ａｌ
の効果のインボログラムでろ、る。 特許出願人　ジエネンテク、インコーポレイテッド代俳
人　　　弁理士　野山　葆　外１名図面の浄古（内容に
変更なし） 第１図（Ａ） 第１昌（Ｂ） インター７二ロン（Ｌｏｇｌｏ　＊イｉ／ｒＪ）第２図
（Ａ） ’；’、Ｌ　２　ｍ　（Ｂｌ 手続補正書輸発） １事件の表示 昭和５８年特許願第　　　１９９８８９　　号２発明の
名称 インターフェロンの相乗効果 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 １ｊミ所　アメリカ合衆国カリ７オルニア９４．０８０
、サウス・サン・７ランシスコ、ポイント・サン・ブル
ーフ・ブールバード４．　Ｇ　Ｏ査 名称２゛エネンテク、インコーポレイテンド４代理人 住所　大阪府大阪市東区本町２−１０　本町ビル内６補
正の対象二図面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ヒトのα−インターフェロン、そのハイブリッドおよ
   びヒトのβ−インターフェロンからなる群から選ばれる
   インターフェロンとヒトのγ−インターフェロンからな
   る混合物を含有する細胞増殖阻止剤組成、物。 ２、該混合物が相乗効果を発揮する薬学的に純粋な混合
   物である第１項に記載の組成物。 ３各インタ一フエロシ成分の純度が総蛋白質の９５重量
   係以上である第２項に記載の組成物。 ４各イシク一フエロシ成分が遺伝子的に変換された宿主
   細胞培養の生成物である第３項に記載の組成物。 ５、各インターフェロン成分が実質的て不純物を含まな
   いものである第２項に記載の組成物。 ６ヒトのγ−イシターフエロシが実質的に干渉物質を含
   まないものである第２項に記載の組成物。 ７ヒトのγ−インターフェロンとヒトのα−インターフ
   ェロンの混合物“２含有する第１項〜第６項のいづれか
   に記載の組成物。 ８、薬学的に純粋な、相乗効果を発揮する量のヒトのｒ
   −インターフェロンを、ヒトのα−インターフェロン、
   そのハイブリッドおよびヒトのβ−インターフェロンか
   らなる群から選ばれる薬学的に純粋な、相乗効果を発揮
   する量のインターフェロンと混合することからなる、相
   乗効果的生物活性を有する組成物の製造方法。