JPS6010025B2

JPS6010025B2 - 水溶性ジアミノジフエニルメタン誘導体とその応用

Info

Publication number: JPS6010025B2
Application number: JP15575382A
Authority: JP
Inventors: 匡宣志賀; 兼勇喜納
Original assignee: DOJINDO LAB
Current assignee: DOJINDO LAB
Priority date: 1982-09-06
Filing date: 1982-09-06
Publication date: 1985-03-14
Also published as: JPS5944352A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は特許請求の範囲に記載の一般式（１）で示され
る水溶性ジアミノジフヱニルメタン誘導体とその塩類（
以下「本発明化合物」と略す）及び本発明化合物を色素
形成物質として有することより成る過酸化物質定量用組
成物に関するものである。

上記の本発明化合物は、いずれも文献未戦の新規かつ有
用な物質であって、なかんづくベルオキシダーゼまたは
それと同様な触媒作用を持つ物質と共存させ過酸化水素
を定量する際の色素形成物質として有用である。

酵素試薬を用いる臨床検査法は酵素の基質特異性のため
にきわめて選択的な分析法であり、複雑な生体マトリッ
クスの影響を受けることなく各種の生体内成分を容易に
定量できるため、近年急速に普及しつつある。

たとえば、体液中のグルコース、尿酸、コレステロール
などはグルコースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼなどの酵素により分解され、相当す
る量の過酸化水素を生成する。したがって、この過酸化
水素を定量することにより、各種生体内成分を測定する
ことができる。従来このような機構で生成する過酸化水
素を定量する方法としては酸化縮合発色による場合が多
く、たとえば次のような色素形成物質が報告されている
。ｍアニリン議導体（Ｎ，Ｎージメチルアニリン；ト
ルイジン；Ｎ？Ｎ−ジエチル−ｍートルイジンなど）【
２｝フェニレンジアミン誘導体およびペンジジンやジ
アニシジンのようなジアミン類‘３’フェノール誘導体
およびナフトール誘導体‘４｝０イコトリフェニルメ
タン類（ｏイコマラカイトグリーンやロイコフエノール
フタレインなど）（５）２，６−ジクロロフエノール
インドフヱノールのロイコ体以上の諸物質のうちロイコ
トリフェニルメタン類や２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェ／−ルなどは単独に使用されるが、アニリン誘
導体、フェニレンジアミン誘導体、フェノール誘導体で
は４ーアミノアンチピリン、３ーメチル−２−ペンゾチ
アゾリノンヒドラゾン（以下「ＭＢＴＨ」と略す）のよ
うな縮合発色剤と共に用いられる。

酵素を作用させる最適軸条件は、測定の目的物を酸化分
解する酵素の種類によって異なっている。たとえば、グ
ルコースオキシダーゼの最適条件はｐＨ５．０ウリカ
ーゼでは州８．５、コレステロ−ルオキシダーゼではｐ
Ｈ６．５〜８．０であり、おおむねｐＨ５〜９の範囲に
分布している。ところが上記の色素形成物質、とくにモ
ノアミン類、ジアミン類はｐＨ５〜９の条件では水に対
する溶解性が悪い。したがって界面活性剤を加えて可溶
化分散させたり、有機溶剤を添加して溶解させるなどの
手段がとられている。しかし、界面活性剤や有機溶剤の
共存は酵素を失活させる懸念がある。また、これら公知
の色素形成物質の水溶液は溶液安定性が悪く、経時的に
濃度変化をきたす問題をかかえている。本発明者らは、
４ーアミノアンチピリンやＭＢＴＨと酸化縮合する色素
形成物質で、とくに水に対する溶解性のよい化合物を見
いだすべく鋭意研究を重ねた結果「前記一般式（１）で
示される本発明化合物を見いだした。

たとえば本発明化合物とＭＢＴＨとを、ベルオキシダー
ゼと過酸化水素による酸化縮合を行なうと、下記の（０
）式で示される青色色素を定量的に形成し、すぐれた呈
色安定性を保持することを見いだし本発明を完成した。
ところで、従来より使用されているフェノールやＮ，Ｎ
ージヱチルアニリンでは、４−アミノアンチピリンとの
縮合生成物のもつ極大吸収波長が５００なし、し５２仇
ｍ付近にあるが、いっぽう体液中に含まれるビリルビン
や溶血によって生じる吸収が紫外領域から５０仇ｍ付近
と広範囲にあるため、測定値に正の誤差を生じるおそれ
がある。

しかるに一般式（１）で示される本発明化合物は、Ｍ旧
ＴＨとの縮合生成物のもつ極大吸収波長が大部分５６仇
ｍ以上にあるためピリルビンや溶血による影響を避ける
ことができるという大きな利点がある。また本発明化合
物とＭ旧ＴＨをｐＨ７の緩衝液に混合溶解し、ベルオキ
シダーゼと過酸化水素を添加すると極大吸収波長でモル
吸光係数くそ，ｍｏｌ‐１，抑‐１）が５．０×１びな
いし６．０×１ぴの色素を生じる。

これに対しフェノールと４ーアミノアンチピリンを用い
て同条件で測定した場合、・極大吸収波長でのモル吸光
係数は約５．０×１ぴ程度にすぎない。したがって本発
明化合物を用いる過酸化水素の定量法は、非常に高感度
な方法であると言える。更に本発明化合物の各ｐＨの緩
衝液に対する溶解性は良好で界面活性剤や有機溶媒を加
える必要がなく試薬調整が簡便であるという利点もある
。

さて一般式（１）で示される化合物は、次の一般式（ｍ
）及び（Ｗ）（式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ
６は前出一般式（１）と同じ意味を有する）で示される
化合物にホルマリンを作用させ合成することができる。

このようにして合成された一般式（１）で示される本発
明化合物の具体例を表１に、又その化合物の融点、元素
分析値およびｐＨ７．１１におけるＭ旧ＴＨとの酸化縮
合色素の極大吸収波長＾ｍａｘ（ｎｍ）を表２に示す。
表２（つづき）さて本発明による定量を実施するに際しては、本発明の
色素形成物質に、｛ィ’過酸化作用のある物質および‘
ロー発色剤を配伍したものを使用する。

前者すなわち【ィーの例としてはベルオキシダーゼのほ
か、遷移金属たとえば鉄イオンのようなものがあり、後
者すなわち‘ｏ）の例としてはＭＢＴＨのほか、４−ア
ミノアンチピリンなどがあげられる。ただしこれらは単
なる例示であって本発明がこれによって限定されるもの
ではない。次に実施例をあげて、更に具体的に本発明化
合物の製造法（実施例１〜６）およびそれを用いた定
量方法（実施例７）を説明するが、本発明はその要旨を
越えない限り以下の実施例に制約されるものではない。

実施例１化合物■の製造Ｎ−エチル一Ｎ一（２−スルホエチル）アニリンナトリ
ウム塩１０．３夕を水２０私に溶かし、３７％ホルマリ
ン１．７８凧【、９０％ギ酸０．２０の‘を加え３５０
０に保ちながらＮーメチルアニリンを加え反応を行なう
。

得られた結晶を炉取し、メタノールで再結晶して白色の
ジ｛４−〔ＮーェチルーＮ−（２ースルホエチル）アミ
ノ〕フエニル｝メタン２ナトリウム塩８．２５夕を得る
。収率７７．８％ＴＬＣ（シリカゲル、０．がアンモニ
ア水飽和ｎ−ブタノール）Ｒｆ＝０．２５１日‐ＮＭＲ
（ｄ６‐ＤＭＳＯ）６跡（ＴＭＳ）１．１２（ｔ，Ｊ＝
７．８ＨＺ、餌）２．４４〜２．７９（ｍ，細）２
．８３〜３．４１（ｍ，４Ｈ）３．６４（Ｓ，が）６
．３２（ｄ，Ｊ＝８．２ＨＺ，４Ｈ）６．７４（ｄ，
Ｊ＝８．２ＨＺ，』Ｈ）Ｒ（仇‐１）１６０８１２６３
１２。

０実施例２化合物脚の製造４．８９夕のＮ−（３−スルホプロピル）アニリンナト
リウム塩を水１０の‘に溶かし、３５ｑ０に保ち３７％
ホルマリン０．８９の‘、９０％ギ酸０．１０叫を加え
反応を行なう。

得られた白色結晶を炉取し、アセトンー水温合溶媒で再
結晶して、ジ｛４一〔Ｎ−（３−スルホプロピル）アミ
／〕フエニル｝メタン２ナトリウム塩４．２３夕を得る
。収率８４．４％ＴＬＣ（シリカゲル，０．がアンモニ
ア水飽和ｎ−ブタノール）Ｒｆ＝０．２５１Ｈ−ＮＭＲ
（ｄ６一ＤＭＳＯ）６柳（ＴＭＳ）１．６０〜２．１６
（ｍ，４Ｈ）２．斑〜２．７６（ｍ，４Ｈ）３．０２（
ｔ，Ｊ＝６，２ＨＺ，岬）３．５８（Ｓ，が）６．４
７（ｄ，Ｊ＝８．２ＨＺ，４Ｈ）６．９０（ｄ，Ｊ＝
８．２Ｈｚ，４Ｈ）ＩＲ（肌‐１）３３２０１６１０１
２８３１１６９１０５０実施例３化合物Ｄの製造Ｎ−エチル−Ｎ一（３−スルホプロピル）アニリンナト
リゥム塩５．４７夕を水１０の上に溶かし、３７％ホル
マリン０．８９の‘、９０％ギ酸０．１０叫を加え３５
ｏｏに保ちながらＮ−メチルアニリンを加え反応を行な
う。

得られた白色結晶を炉取し、ＴＨＦーメタノール混合溶
媒で再結晶して「ジ｛４−〔Ｎーェチル−Ｎ−（３−ス
ルホプロピル）アミノ〕フエニル｝メタン２ナトリウム
塩４．９５夕を得る。収率概．３％ＴＬＣ（シリカゲル
、０．州アンモニア水飽和ｎ−ブタノール）Ｒｆ＝０．
３０１日−ＮＭＲ（ｄ６一ＤＭＳＯ）６脚（ＴＭＳ）１
，１０（ｔ，Ｊ＝７．７ＨＺ，細）１．６８〜２．１
８（ｍ，４Ｈ）２．４０〜２‐７５（ｍ，母Ｈ）２
‐８１〜３‐３０（ｍ，４Ｈ）３，５２（Ｓ，班）
６．４３（ｄ，Ｊ＝８．２日２，虹）６．機（ｄ，Ｊ
＝８．２日２，虹Ｈ）ＩＲ（肌‐１）３４８０１６０２
１２６１１１７８１０４１実施例４化合物（Ｇ）の製
造３−ヒドロキシ−Ｎ−エチル一Ｎ一（３ースルホプロピ
ル）アニリンナトリウム塩１１．５９夕を水２０の‘に
溶かしｔ３７％ホルマリン１．８０の‘、９０％ギ酸０
．２０の‘を加え３すのこ保ちながらＮ−メチルアニリ
ンを加え反応させる。

生じた沈殿物をアセトンで数回デカンテーションしなが
ら粉砕結晶化させ生じた青白色結晶を炉取し、メタノー
ルで再結晶して、白色のジ｛２ーヒドロキシー４一〔Ｎ
−ェチル−Ｎ−（３−スルホブロピル）アミ／〕フエニ
ル｝メタン２ナトリウム塩６．２７夕を得る。収率５
３．０％ＴＬＣ（シリカゲル、０．州アンモニア水飽和
ｎ−ブタノール）Ｒｆ＝０．２０１日‐ＮＭＲ（ｄ６‐
ＤＭＳＯ）６脚（ＴＭＳ）１．１８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈ
Ｚ，細）１．７２〜２．２９（ｍ，岬）２．３６（
ｍ，細）３．０８（ｔ，Ｊ：６．３ＨＺ，岬）６，
２５〜６．９８（ｍ，４Ｈ）７．３８（Ｓ，汎）ｍ（
弧‐１）３５００１６０５１２磯１１７５１１０３実施
例５化合物の）の製造Ｎーエチル−Ｎ一（３ースルホプロピル）アニリンナト
リゥム塩５．４６夕を水１０柵に溶かし、３７％ホルマ
リン１．８０の‘、９０ギ酸０．２０の‘を加え３５℃
に保ちながらＮ一（３ースルホプロピル）アニリンナト
リゥム塩４．８９夕を水１助けこ溶かして滴下し反応を
行なう。

生じた青白色結晶を炉取し、メタノールで再結晶して、
白色の４′ー｛Ｎ′ーェチルーＮ−（３ースルホプロピ
ル）アミノ｝フエニルー４一｛Ｎ−（３ースルホプロピ
ル）アミノ｝フヱニルメタン２ナトリウム塩６．２５夕
を得た。収率５９．０％ＴＬＣ（シリカゲル、０．州ア
ンモニア水飽和ｎ−ブタノール）Ｒｆ＝０．３０１日‐
ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）６脚（ＴＭＳ）１，１２（ｔ
，Ｊ＝７，６ＨＺ，汎）１，５９〜２．１６（ｍ，４Ｈ
）２．３６〜２．７７（ｍ，細）２．８０〜３．２
５（ｍ，岬）３，４９（Ｓ，汎）６．２８〜６，５
６（ｍ，４Ｈ）６．６０〜７．０２（ｍ，斑）ＩＲ（肌
‐１）３３８０１６００１２９５１２０１１０２５実施
例６化合物の）の製造３ーメトキシ−Ｎーエチル−Ｎ−（３ースルホプロピル
）アニリンナトリウム塩６．０８夕を水１０叫に溶かし
、３７％ホルマリン１．８０の【、９０％ギ酸０．２０
の‘を加え３５ｑｏに保ちながら、Ｎ−エチル−Ｎ−（
３−スルホプロピル）アニリンナトリウム塩５．４７夕
を水１０肌に溶かして加え、更にＮーメチルアニリンを
加え反応を行なう。

析出してきた白色結晶を炉取し、メタノールから再結晶
して、２−メトキシ−４−｛ＮーエチルーＮ−（３ース
ルホプロピル）アミノ｝フエニル−４一｛Ｎ′−エチル
一Ｎ′−（３ースルホプロピル）アミノ｝フエニルメタ
ン２ナトリウム塩７．２５夕を得た。収率６１．５％Ｔ
ＬＣ（シリカゲル、０．がアンモニア水飽和ｎ−ブタノ
ール）Ｒｆ＝０．２８１日‐ＮＭＲ（ｄ６‐ＤＭＳＯ）
６跡（ＴＭＳ）１，１０（ｔ，Ｊ：７．７ＨＺ，細）
１．６６〜２．１５（ｍ，岬）２．３９〜２．７８（
ｍ，母Ｈ）２．８３〜３，３３（ｍ，岬）３．５５
（Ｓ，が）４．１１（Ｓ，班）６．２５〜７．０６
（ｍ，７Ｈ）ｍ（伽‐１）１６０８１２４４１２。

６１１００以上で本発明化合物の製造法を説明した。

次にそれらの過酸化物質定量への応用について説明する
。なお定量方法の実施例を述べる前に、過酸化水素−パ
ーオキシダーゼによる発色試薬の呈色反応性に関しｉ）
発色に及ぼす斑の影響、五）発色の経時安定性及び前
）過酸化水素標準液による検量線の各項目‘こついて説
明する。ｉ発色に及ぼすｐＨの影響毎ＭＩ」激職液（ＰＨ５〜９）１００の肘ｆ−オキシダ
ーゼ２０山単位、ＭＢＴＨ４０．８のｏ及びジ｛４一
〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３ースルホプロピル）アミノ）フ
ェニル｝メタン２ナトリウム塩（化合物Ｄ）弦．２の９
を溶かし発色試薬とする。

３０％過酸化水素水を約５．仇ｈＭ濃度に希釈し、それ
を過マンガン酸滴定して濃度を正確に決定したものを過
酸化水素標準液とする。

以下、この標準液を適宜希釈し実験に用いる。試験管ａ
〜ｉに以下に示す様に試薬をとる。

各試験管を３７０の陣温槽に１０分間浸けたあと、０．
１Ｎ塩酸水溶液２．０叫を加え、試薬盲検を対照に５脇
肌での吸光度を測定する。得られた値から、ｐＨと吸光
度の関係を図１に示す。図Ｉより、中性領域で良好な呈
色が得られる。また、他の化合物Ａ〜Ｃ及びＥ〜Ｑも同
様にｐＨ７．０±０．５の領域で呈色感度は最大になる
ことがわかった。これを表３に示す。ｉｉ発色の経時
安定性肌ｏの亨Ｍ■」減緩衝胸肌こパーオキシダーゼ２００単位、ＭＢＴＨ４０．＆夕及びジ｛４一〔
Ｎ−エチル−Ｎ一（３−スルホプロピル）アミノ〕フェ
ニル｝メタン２ナトリウム塩（化合物Ｄ）５４．２の９
を溶かし発色試薬とする。

試験管に２．８ｈＭ過酸化水素標準液２０〆そ、発色試
薬１．０泌をとり、３７００の恒温槽に１０分間浸けた
あと、０．１Ｎ塩酸水溶液２．０の‘を加え、試薬盲検
を対照に５９紬ｍでの吸光度の経時変化を測定する。図
２にその結果を示す。また、同条件で行なった他の化合
物Ｂ，１，Ｍについての結果も併せ同図に示す。図２か
ら、生じた色素は１時間以上安定であることがわかる。
なお他の化合物すなわち化合物Ａ，Ｃ，Ｅ〜日，Ｊ〜Ｌ
及びＮ〜Ｑについても同様な結果が得られた。ｉｉｉ
過酸化水素標準液による検量線の作成試験管ａ〜ｆにｉ
ｉ）で調整した発色試薬、及び過酸化水素標準液を以下
の様にとる。

各試験管を３７ｏｏの恒温槽に１０分間浸けたあと、０
．１Ｎ塩酸水溶液２．０地を加え、試薬盲検を対照に５
９８ｎｍでの吸光度を測定する。

得られた値から作成した検量線を図３に示す。図３から
、約３〜２叫Ｍの濃度範囲で検量線が直線性を示すこと
がわかる。以上の結果から本発明の化合物のすべてが過
酸化物質定量用試薬としての効果を奏することは明らか
である。

そのうちの代表的化合物４種について、以下に定量の具
体例を示す。むろんこれらは単なる例示であって、本発
明がこれによって限定されるものではない。実施例７化合物Ｄによる血清中のグルコースの定量亨肌激職液（
ＰＨ７の１０肌のレコースオキシダーゼ２０■単位、パーオキシダーゼ２００単位
、Ｍ旧ＴＨ４０．８の夕、ジ｛４一〔ＮーェチルーＮ−
（３−スルホプロピル）アミノ〕フエニル｝メタン２ナ
トリウム塩（化合物Ｄ）５４．２の９を溶かし発色試薬
とする。

ｉグルコース標準液を用いた検量線の作成グルコース
２００のｏを１００Ｍの水に溶かしたものをグルコース
標準液とし、適宜希釈して実験に用いる。

試験管ａ〜ｄに以下に示す様に試薬をとる。

各試験管を３７０の恒温槽に１０分間浸けたあと、０．
１Ｎ塩酸水溶液２．０地を加え試験盲検を対照に５鎌ｍ
ｍで吸光度を測定する。得られた値から作成した検量線
を図４に示す。ｉｉ血清中のグルコースの定量試験管に除タンパクした血清２０仏そをとり「上記発色
試薬１．０の【を加えて、３７℃の恒温槽に１び分間浸
けたあと、０．１Ｎ塩酸水溶液２．０の‘を加え試薬盲
検を対照に５９紬ｍでの吸光度を測定し、検量線と対比
して血清中のグルコース濃度を求める。

吸光度０．４１１グルコース濃度９１の９／ｄ‘ 実施例８化合物１による血清中のグルコースの定量ジ｛４−〔Ｎ
ーエチルーＮ−（３−スルホー２ーヒドロキシプロピル
）アミノ〕フエニル｝メタン２ナトリウム塩（化合物１
）を用いて、実施例７と同様の操作により血清中のグル
コース濃度を測定する。

グルコース標準液を用いて測定波長６０１ｍｍで吸光度
を測定し同様に検量線を作成する。得られた検量線（図
５）から血清中のグルコース濃度を求める。吸光度０
．３０２グルコース濃度９２のタノの実施例９化合物Ｌ‘こよる血清中のグルコースの定量ジ｛４−〔
Ｎ−エチル一Ｎ−（３−スルホプロピル）アミノ〕一３
−メチルフエニル｝メタン２ナトリウム塩（化合物Ｌ）
を用いて、実施例７と同機の操作により血清中のグルコ
ース濃度を測定する。

グルコース標準液を用いて測定波長５３４ｎｍで吸光度
を測定し同様に検量線を作成する。得られた検量線（図
６）から血清中のグルコース濃度を求める。吸光度０
．４５９グルコース濃度９０の９／ｄ‘ 実施例１０化合物Ｐによる血清中のグルコ−スの定量ジ｛４−〔Ｎ
ーエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミノ〕−２ー
メチルフエニル｝｛４′一〔Ｎ−エチル一Ｎ−（３−ス
ルホプロピル）アミノ〕フェニルメタン２ナトリウム
塩（化合物Ｐ）を用いて、実施例７と同様の操作により
血清中のグルコース濃度を測定する。

グルコース標準液を用いて測定波長斑仇ｍで吸光度を測
定し同様に検量線を作成する。得られた検量線（図７）
から血清中のグルコース濃度を求める。吸光度０．４
４０グルコース濃度９２ｍｐ／の

【図面の簡単な説明】図１……化合物の発色に及ぼすｐＨの影響、図２…・・
・発色の経時安定性：ただし▲，０，△，●はそれぞれ
化合物Ｂ，Ｄ，１，Ｍを表わす、図３……過酸化水素に
よる検量線、図４・・…・化合物によるグルコースの検
量線、図５…・・・化合物１によるグルコースの検量線
、図６・…・イヒ合物Ｌによるグルコースの検量線、図
７・・・・イヒ合物Ｐによるグルコースの検量線をそれ
ぞれ表わす。函ュ図２図３図４函Ｓ函ら図７

Claims

【特許請求の範囲】１一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＾１，Ｒ＾３は水素原子、低級アルキル基お
よび炭素数２ないし３のスルホアルキル基またはヒドロ
キシスルホアルキル基よりなる群から選択された置換基
を示し、Ｒ＾２，Ｒ＾４は炭素数２ないし３のスルホア
ルキル基またはヒドロキシスルホアルキル基を表わしＲ
＾５，Ｒ＾６は水素原子、メトキシ基、水酸基および低
級アルキル基よりなる群から選択された置換基を表わす
）で示される水溶性ジアミノジフエニルメタン誘導体及
びその塩類。２一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＾１，Ｒ＾３は水素原子、低級アルキル基お
よび炭素数２ないし３のスルホアルキル基またはヒドロ
キシスルホアルキル基よりなる群から選択された置換基
を示し、Ｒ＾２，Ｒ＾４は炭素数２ないし３のスルホア
ルキル基またはヒドロキシスルホアルキル基を表わしＲ
＾５，Ｒ＾６は水素原子、メトキシ基、水酸基および低
級アルキル基よりなる群から選択された置換基を表わす
）で示される水溶性ジアミノジフエニルメタン誘導体及
びその塩類を色素形成物質として有することよりなる過
酸化物質定量用組成物。