JPS6013145B2 - 不動化された生物学的活性巨大分子物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は不動化させた活性物質およびその使用に関する
。 更に詳しくは、本発明はゲルの形態および三次元絹状構
造の形態の微細孔性球形粒子（これら粒子はその絹状構
造のメッシュ内に補集された生物学的活性巨大分子物質
を含有する）より成る不動化せしめられた生物学的活性
巨大分子物質およびその物質を、生物学的に特異性のあ
る系の一成分の定量的測定、および細胞、細胞フラグメ
ント、ビールスまたは特異的レセプターを有する絹議緩
造体または特異的表面構造を有する物質の標識化または
分離のための試薬として使用することに関する。Ｂｊｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃね第１６競雀（１９６
８）第２９〜３９頁は「 ポリヌクレオタイドをも含有
するアクリルアミドおよびＮ，Ｎ′−メチレンビスアク
リルアミドの水性溶液を分散重合させることによる不動
化ポリヌクレオタィドの製造を開示している。 この重合は、５０〜２５妙ｍの直径を有しそしてそのメ
ッシュ内にポリヌクレオタィドを捕集せしめた三次元絹
状構造の構造形態を有するゲル状の微細孔性球形粒子を
生成せしめる。１５０〜２００必ｍの範囲の分画をカラ
ムクロマトグラフィー用に使用するが、溶出はその粒子
の孔中に侵入しうるような分子サイズを有する酵素を含
有する溶液を使用して行われる。 本発明によれば、ゲルの形の微細孔性球形粒子によって
生物学的に活性な物質を、これら物質が粒子の網状構造
中に非常に高度には侵入することのできない物質に対し
てもまたそれらの生物活性を示しうるような方法で不動
化させ、そしてそれによって不動化した生物学的活性物
質の非常に広範な使用を確保することが可能であること
が発見された。 これらの利点は、本発明によれば、これら粒子に１岬ｍ
以下のサイズおよび０．５〜４ムｍ好ましくは１仏ｍの
平均直径を与えることによって達成される。これまでに
既知の不動化物質に適用されることとは対照的に「本発
明の粒子は、生物学的活性物質の大部分が粒子の絹状構
造内に完全に入っておらず後者から一部分突き出ている
ことを保証するに充分なだけ小さいものである。 生物学的活性物質を粒子内に入れることないこその効率
のよい不動化を達成しうるということは特に驚くべきこ
とと考えられる。前記されたことに基づいて、本発明は
ゲルの形態のそして三次元重合体状絹状構造の形態の微
細孔性球形の粒子（これら粒子はその絹状構造のメッシ
ュ内に浦集された生物学的活性巨大分子物質を含有して
いる）より成る不動化された生物学的活性巨大分子物質
に関する。 本発明を特徴づけるものは、これらの粒子が１蛇ｍ以下
のサイズ〜そして０．５〜４山ｍ好ましくは１払ｍの平
均直径を有しておりそれによって生物学的活性巨大分子
物質がこれらの粒子の絹状構造中に侵入し得ない物質に
対してその生物活性を示しうるということである。第一
義的には「 これらの粒子は低分子アクリル化合物また
は１−ビニルー２ーピロリジノンと交叉結合剤として働
く低分子ジビニル化合物との共重合体より構成されてい
る。 「低分子」なる表現は〜 その化合物が適当には１の固
を越えない炭素原子を含有していることを意味している
。好ましくは〜 このアクリル化合物は４個を越えない
炭素原子を含有しておりｔ一方ジビニル化合物は好まし
くはＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドである。適
当な低分子ジビニル化合物は、原則的な観点からは２個
の末端エチレン性不飽和基を与える任意の既知の低分子
化合物である。 そのような低分子ジビニル化合物の例は、Ｎ，Ｎ′ーメ
チレンビスアクリルアミド、ジエチレングリコールジビ
ニルヱーテルヘエチレングリコールジメタアクリレ−ト
およびジビニルスルホンである。好ましい粒子は、式 〔式中Ｒ，は水素またはメチルを表わし「そしてＲ２は
ヒドロキシルまたは−ＮＨＲ３（式中Ｒ３は水素または
１〜６個の炭素原子を含有する未置換であるかまたはヒ
ドロキシルまたはオキソ基により置換された道鎖状また
は分枝状ァルキル基である）を表わす〕を有するアクリ
ル化合物とＮ，Ｎ′ーメチレンピスアクリルアミドとの
共重合体を包含する。 特に好ましいものはＬアクリル酸および／またはアクリ
ルアミドとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドとの
共重合体である。本発明により使用される低分子アクリ
ル化合物の例は、アクリルアミド、メタアクリルアミド
〜Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、２ーヒドロキ
シエチルメタアクリレート、アクリルニトリル「アクリ
ル酸、Ｎ，Ｎージメチルアミノェチルメタアクリレート
およびグリシジルメタアクリレートである。生物学的活
性巨大分子物質はト例えば蛋白質「多糖類、ポリアミノ
酸、核醗の個々かまたは相互の混合物のような巨大分子
より構成されている。 生物学的活性巨大分子物質は、未変性でありうるしち
または放射性ラベル物質、着色剤または低分子量分子で
複合化（コンジュゲート）したものでありうる。この活
性物質はまたそれ自体放射生成原子または原子団、酵素
または発色性基で標識を付されていてもよい。間接的標
識化もまた、ラベル物質を生物学的活性巨大分子物質と
共に粒子中に包含させることによって達成することがで
きる。低分子量分子は、化学反応または吸着によって、
粒子中に不動化させた巨大分子に結合させることによっ
て不動化することができる。 原則的には、これらの粒子は分散重合技術内で知られて
いる方法によって製造される。 詳しくは「この製造は次のようにして行うことができる
。重合させるべき単量体の水性溶液を不動化させるべき
生物学的活性巨大分子物質（巨大分子または巨大分子に
カップリングごせた低分子量化合物）の溶液と混合する
。 例えばトルェンおよびクロロホルム（３：１）の混合物
より成る有機相が適当な乳化剤と共に反応容器中におか
れる。窒素ガスによって有機相上の空気を排除する。冷
却して反応速度を低下させた単量体溶液に触媒を加え、
そしてこの溶液を迅速に有機相上に注ぎ、そしてこれを
効率の良いホモゲナィザーで激しく処理する。ｌＡｍ以
下のサイズを有する粒子をこのようにして製造できる。
この重合過程においては、その温度は十４０ｑｏを越え
させるべきではない。このことは生物学的分子が生物学
的に活性な状態に留まることを意味している。粒子の孔
度は、出発原料たる単量体の溶液の濃度を変化させるこ
とによって、そして単量体温合物中の交叉結合性ジビニ
ル化合物の濃度を変化させることによって変動させるこ
とができる。 表面荷電は、単量体の濃度および種類を適当に選択する
ことによって「無荷電状態から正または負荷電までに変
化させることができる。重合においてゲル重合体中に荷
電基を導入することによって、得られた荷電粒子を相互
に反駁せしめて、それらの凝集（アグレゲーション）を
防止することができる。このことは不動化した生物学的
活性巨大分子物質の使用の観点から重要である。この単
量体溶液はモノビニル単量体の蟹光性誘導体と共に加え
ることができるが、この単量体は重合に際してゲル骨格
中に包含されそしてそれらの粒子を後光性にする。有機
分子はまた重合の後で、粒子内の不動化された生物学的
活性巨大分子物質に化学反応によってカップリングさせ
ることができる。不動化された生物学的活性巨大分子物
質は、凍結乾燥またはエタノール乾燥し、そして室温で
何年も保存することができる。本発明の異つた態様は、
凝集、免疫滴定、免疫アッセーまたは細胞レセプターア
ツセー法の手段によって、生物学的活性巨大分子物質を
一成分として含有する生物学的特異性のある系中の一成
分を定量的に測定するための試薬として本発明の不動化
した生物学的活性巨大分子物質を使用することに関する
。 本発明はまた、三次元絹状構造の構造形態を有する微細
孔性球形の粒子に結合させた生物学的特異性のある系に
属する生物学的活性巨大分子物質より成る試薬を使用し
て生物学的特異性のある系の中の一成分を定量測定する
ための凝集、免疫測定、免疫アッセーおよび細胞レセプ
ターアッセー法に関する。 本発明は、不動化状態でそして三次元絹状構造のメッシ
ュ内に橘集された生物学的活性巨大分子物質を含有する
粒子（１岬ｍ以下のサイズそして０．５〜４仏ｍ好まし
くは１山ｍの平均直径を有する）を使用することを特徴
としている。前記の使用および方法においては、不動化
された生物学的活性巨大分子物質を、放射発光をしうる
原子または原子団、酵素または発色性基によりラベルす
ることができる。凝集反応の原理は、測定される物質が
その試薬粒子上にある分子との特異的相互作用（これは
隣接粒子が一緒に結合して可視的手段で観察することの
できるような絹状構造を生成する）によって検出される
ということである。 凝集技術においては、一連の試料の希釈物および測定す
べき物質の既知濃度のものが特別な使い捨て可能なプラ
スチック容器中につくられる。荷電したビニル化合物を
共重合させて荷電粒子を提供することによって、自発的
には凝集しない粒子が得られる。本発明の試薬粒子の標
準量をすべての希釈液およびブランクとしてバッファー
のみを有する容器に加える。試料が測定可能な成分を含
有している場合には、直接的凝集が成分分子によって粒
子が一緒に結合されてそれによってプラスチルク容器の
底面に均一な被覆を生成させる結果となる。他方、試料
が陰性の場合には、粒子は容器の底に沈殿しそれによっ
て小さなはっきり区別される帯城（ゾ−ン）を形成する
。間接的ないわゆる阻害技術は、実際の分子に対して生
物学的特異性である限定量の付加巨大分子に対する、粒
子中に不動化させた同一分子と試料中の分子との間の措
抗に基づくものである。 これらの方法では、定量はブランクの凝集の希釈度と試
料のそれとを比較することによる半定量的のものである
。粒子が非荷電性ならしめられている場合には、平面上
で凝集反応を認めることができる。免疫側定、免疫アッ
セーおよび細胞レセプタ−アッセー法は、生物学的特異
性のある分子とそれらのリガンドとの間の特定的相互作
用に基づくものである。 適当なラベルを有する生物学的特異性のある分子および
測定可能な物質を提供することによって、特定的相互作
用の程度を、往々にして分離段階の後で定量することが
できる。この方法は、相互作用する系の成分の一つのも
のの測定のために使用することができる。浩抗的蛋白結
合技術においては、本発明の不動化された生物学的活性
物質が次の様式で使用される。 最初に希釈したまたは無希釈の試料に好ましくはラベル
を加えるが前記ラベルは定量すべき物質の放射能ラベル
または酵素ラベルである。不動化した生物特異性のある
蛋白質を有する微細粒子を次いでラベルしたものよりわ
ずかに少ない量で加え、そして平衡に到達するまで培養
を行わせる。微細粒子は強い遠心分離によって溶液から
容易に分離させることができる。粒子をバッファーで洗
いそして更に短時間遠心する。試料の酵素活性または放
射能測定は、粒子中に不動化させた成分に結合していた
ラベルの割合がどの位大きいかという質問に対する答え
を与える。他の可能性は、最初の遠心法の後で上澄み中
のラベルを定量にすることである。この物質の量は、最
初に測定すべき物質の既知量を一定量のゲル粒子および
ラベルに加えることによって得られた標準曲線から定量
することができる。免疫測定技術において、抗体または
レセプター分子をラベルしそして過剰量で加え「その後
で平衡に達するまで培養を行わせるものである。 次いで本発明により不動化させた測定可能な物質を有す
る微細粒子を、反応しなかったラベル抗体または細胞レ
セプターを分離することができるように添加する。通常
の卓上型遠心機で遠心分離した後、上相の固定部分を論
べそして既知量の物質による標準曲線を確立した後にそ
の物質を定量することができる。洗った粒子に関しても
また定量を行なうことができる。定量測定のための桔抗
的結合技術に関して、本発明の不動化された生物学的活
性物質を使用することは以前に使用されていた試薬に比
して次の利点を与える。 高い機械的安定性および１叫ｍ以下の良好に定義された
サイズを有する化学的に不活性の粒子を、安価にそして
簡単に〜重合過程においてさえも不動化された生物学的
特異性の分子またはリガントを使用して製造することが
できる。 凍結乾燥（リオフィリゼーション）またはエタノールで
乾燥した後こうした粒子は室温で数年の間、不蚤化した
分子に関して生物学的に無変化のまま保存することがで
きる。 表面荷電を変化させることによって、使い捨てタイプの
プラスチックプレートの中央に向ってスロ−プのある凹
み中で凝集反応を行わせることによって、その凝集反応
を単純化することが可能である。 生物学的特異性のある蛋白質またはリガンドは重合体ブ
ロックの機械的破壊におけるような大なる損失ないこ、
重合過程において不動化させることができる。 重合において適当な重合体を不動化させる際には、簡単
な既知の複合（コンジュゲーション）法によって巨大分
子に低分子量物質をカップリングさせることによってこ
れらの方法を低分子量物質に適用することができる。 ポリアクリルアミドのガラス表面に付着する能力を「遠
心モーメントを除外するために使用することができる。 この粒子は完全に球形であり且つ均一サイズのものであ
る。このことは大なる重合体ブロックの破壊後に得られ
る粒子とは対照的に「それらが使用するに実用的であり
且つ投与容易であることを意味している。生物学的特位
性のある分子の共有結合はこの不動化には使用されてい
ない。その理由はそのようなカップリングは生物学的活
性の損失を生じうるからである。本発明のその他の態様
は「細胞、細胞フラグメソト、ビールス、およびレセプ
ターの一つが生物学的活性物質に特異的に関係している
特異的レセブタ−を有する組織構造体、またはその表面
構造の一つが前記生物学的活性物質と特異的に反応する
ような特異的表面構造を有する物質をラベルするために
、本発明に従って不動化した、放射発生性の原子または
原子団、酸素または発色性基をラベルした生物学的活性
物質を使用することに関する。 これに関して、本発明はまた、団体担体に結合させた放
射発光性の原子または原子団、酸素または発色団により
ＩＪラベルされている生物学的活性物質より成る試薬と
の生物学的特異性のある相互作用によって、細胞、細胞
フラグメント、ビールス、またはそのレセプターの一つ
が前記物質に特異的に関係しているような特異的レセプ
ターを有する組織構造体またはその表面積造の一つが前
記生物学的活性物質と特異的な反応を行なうような特異
的表面構造有する物質を標識化するための方法にも関す
る。 この方法は、１叫ｍ以下のサイズそして０．５〜４山ｍ
好ましくは１〆ｍの平均直径を与えるそしてその三次元
絹状構造のメッシュ内に不動化された状態で生物学的活
性物質を楠集せしめた三次元絹状構造の構造形態の微細
孔性球形粒子を団体担体として使用することに特徴を有
する。このラベリング（標識化）は異ったタイプの研究
例えば細胞に関する表面構造の研究に使用することがで
きる。 不動化された生物学的活性物質に対しては実施さるべき
研究のタイプおよび利用しうる装置に応じて多数の異っ
たラベルを使用することができる。放射性アイソトープ
で粒子をラベルすれば、その検出および定量は液体中で
またはガンマシンチレーションカウンター中で行うこと
ができる。粒子のラベリングはまたフルオレツセィンま
たはローダミン型の蟹光物質を使用して行うこともでき
、そしてこれは蟹光顕微鏡下で観察することができる。
電子顕微鏡的研究のためには、フェリチン型の高い電子
密度を有する蛋白質をその製造において粒子内に不動化
させることができ、そしてこれは電子顕微鏡下で検出す
ることができる。非常に小さい粒子サイズを有する粒子
がその場合には使用される。組織学においては、酵素例
えばホースラィディッシュ（西洋わさび）のパーオキシ
ダーゼを粒子中に不動化させ、そして顕微鏡下に観察し
うる特異的な鯵素呈色反応によって検出することができ
る。不動化したりガンドおよびラベルを有する重合体粒
子を細胞懸濁液中に加えそして培養する。過剰の粒子を
除去しそして適当な基質例えばベンチジンを加え、そし
て後者の酸化を検出する。この方法は、ある表面構造を
有する一群中の細胞量の測定を可能ならしめる。本発明
の更に別の観点によれば、本発明は、不動化された生物
学的に活性物質を細胞、細胞フラグメント、ビールスま
たは特異的レセプターを有する組織構造体または特異的
表面構造を有する物質の混合物からそのような細胞、細
胞フラグメント、ビールス、組織構造体または物質を分
離するために使用することに関し、その場合前記細胞そ
の他に特異的にこの生物学的に活性な物質を作用させて
複合体（コンジュゲート）を形成させ、そしてこの複合
体を次いで密度の差およびガラス壁に対するこれら粒子
の吸着性に基づく方法によって物質混合物の残余の成分
から分離することによる。 その結果として、本発明はまた細胞、細胞フラグメント
、ビールスまたは特異的レセプターを有する組織構造体
または特異的表面構造を有する物質をそのような細胞、
細胞フラグメント、ビールス、組織構造体または物質を
含有する混合物から分離する方法に関し、その場合固体
担体に結合させた生物学的に活性な物質より成る試薬（
レセプターの一つがそれに特異的に関係するかまたは表
面構造の一つがそれと特異的に反応する）と特異的に作
用させて複合体（コンジュゲート）を生成させ、そして
この複合体を密度の差およびガラス壁に対する担体の吸
着に基づく方法によって物質混合物中の残余の成分から
分離するものである。 本発明は、ゲルの形態の、そして三次元絹状構造の形態
を有する微細孔性球形粒子（これら粒子は１吻ｍ以下の
サイズおよび０．５〜４Ａｍ好ましくは１仏ｍの平均直
径を有しそしてその三次元網状構造のメッシュ内に不動
化された条件下に浦集された生物学的活性物質を含有し
ている）を固体担体として使用することに特徴を有する
。前記の使用および方法においては、生物学的に活性な
物質を放射を発生しうる原子または原子団、酵素または
発色性基でラベルすることができる。 細胞群中のある表面構造を有する生物学的細胞の分離の
ためには「適当な密度をもち且つ微細粒子中に不動化さ
れたタイプの細胞と特異的に作用する分子（リガンド）
を有する微細粒子を使用することができる。 細胞懸濁液に対して〜粒子中においてそれらのリガンド
を不動化せしめた微細粒子を加え「そしてその系中に平
衡が到達するまで培養（インキュベーション）を行なわ
しめる。試料をプラスチックの遠心管中の適当な濃度勾
配中で勾配の上部に保存する。特異的表面構造を有する
細胞とりガンド微細粒子との相互作用によってし これ
ら細胞コンプレックスは遊離細胞のものとは異つた密度
を取得する。分離が実現する適当な回転数で冷却遠０機
中でこの試料チューブを遠心分離した場合にし分離が起
る。２鐘の異つた層がチューブ中に得られる。 より蚤質の分画は底に一番近い所にある。微細粒子の密
度は〜低分子量アクリル単量体の濃度を５〜５０％の間
で変化させることによって変動させることができる。 その際適当な密度を有する微細粒子を選ぶことによって
「そして密度勾配を選択することによって、襲った表面
構造を有する異つた種類の細胞を分離することが可能で
ある。異つた細胞タイプ間の分離は、異つた粒子を着色
物質でラベルすることによって可視的に観察することが
できる。遠心分離の時間および密度勾配のような条件は
、このようにして決定することができる。不動化デキス
トランまたはコラーゲン上に粒子にリガンドを不動化さ
せることによって細胞をそれぞれデキストラナーゼまた
はコラゲナーゼで酵素的に処理することによる簡単な方
法で粒子から分離することができる。細胞の分離に対す
るリガンド粒子のその他の可能性ある用法は「 ポリア
クリルアミドがガラス表面に吸着される能力を使用する
ことである。 リガンドたるポリァクリルアミド粒子は培養容器中のガ
ラス表面上に均一に分布する。細胞懸濁液を次いでこの
容器に加えて、それによって特異的表面構造を有する細
胞をリガンド粒子に結合せしめる。必要な培養過程後に
「残存する過剰の細胞を洗い去ることによって「非常に
均質な細胞懸濁液を得ることが可能である。栄養塔地添
加後、この懸濁液を培養することができ「そしてこのよ
うにして得られた細胞が不均質である場合にはこの過程
をくりかえすことができる。本発明により不動化された
生物学的活性物質はト襲ったマトリックスに共有結合的
に結合された生物学的特異性ある吸着煤に関してすでに
使用されているのと同一の方法に従ってし混合物のある
麓の化合物の生物学的単機に使用することができる。 クロマトグラフィーおよびバフチ的方法を使用すること
ができる。細胞生物学研究の分野において新らしい研究
の期待が出現する場合にはその進歩性はすべての当業者
にとって明白である。 生物学的活性物質を不動化させてある微細粒子は生物学
的細胞に対してはも何等の非特異的または有議な作用も
与えないＱ粒子の密度および色を変化させることによっ
て「少くとも２種の異つたタイプの細胞を遠Ｄ‘こより
分離することができ、そしてこれらの粒子が着色されて
いる場合には「分離のための適当な条件は試験によって
容易に決定することができる。 リガンド客ま粒子に対して不動化させることができｔそ
して粒子から蛋白分解的にかまたはリガンドが共有結合
的にカップリングされているその不動化された重合体を
、細胞の表面構造を破損しなし・酵素による他の酵素的
消化によって放出させることができる。多くの場合「特
に特異的分子がその混合物から純粋な形で製造されなく
てはならない場合には「粒子との相互作用は媒体の性質
例えば温度、ｐＨ、塩濃度その他を変化させることによ
って容易に阻害することができる。これらの場合ｔ微細
粒子は洗浄後再使用することができる。培養容器のガラ
ス表面に吸着したりガンド粒子はへ細胞を除去しそして
それらを汚染の危険にさらすことないこ「同一容器中で
分離しそして培養することができる。細胞の表面様造の
研究に関しては「不動化リガンドを有する微細粒子を異
った細胞レセプターの研究に使用することができる。多
くの異った有機分子をこれらの粒子中に不動化させるこ
とができる。同一細胞または細胞群中に存在する２種の
襲ったタイプの細胞構造は「 ２種の異つた標識例えば
蟹光およびローダミンの同時検出によって調べることが
できる。 粒子を製造する方法は、粒子内に補集される巨大分子の
性質が不動化法に関連する化学的変性によって変化され
ていないことを保証する。 本発明をここに更に多数の実施例により説明するが、し
かしこれらは本発明を限定しようとするものではない。 例１ビーカーの中で、２００泌のトルエンおよびクロロ
ホルムの混合物（１５０：５０）を０。 ３９のポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレ
ン）ーポリ（オキシェチレン）重合体〔プルロニクス（
登録商標）Ｆ粥〕と混合する。 アクリルアミド（６％）およびＮ，Ｎ′ーメチレンビス
（アクリルアミド）（２％）および３００〆そのＮ，Ｎ
，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンを含有す
る溶液〔窒素ガスでよく置換しそして冷却（十４℃）し
た〕３０の‘を注意して加える。次いで１５０のｐのア
ルブミンを加え、そしてこの溶液を迅速にアンモニウム
パーオキソジサルフェートの水中１０％溶液１地と混合
し、そしてそのビーカー中に流し込む。この混合物をシ
ルバーソンス社（英国）により製造された効率のよい乳
化装置によって直ちに均質化させる。この混合物を強い
ランプによって照射してそれによってポリアクリルアミ
ドへの重合を行わしめる。遠Ｄおよび洗浄後に、不動化
したアルブミンを有する１必ｍの平均直径（セロスコー
プ中で測定）を有する微細粒子が得られる。例２ 例１と同様にするがただしアクリルアミド（３％）およ
びビスアクリルアミド（１％）のより低い濃度を使用し
て不動化したアルブミンを有する微細粒子を製造する。 得られた粒子のサイズ分布は例１のものと同一であった
。実験は、このアルブミソのもつ例えばサリチル酸およ
びワルフアリンのような別の薬物を結合する能力が変化
していないことを示した。例３ 不動化アルブミンを有する微細粒子を、例１と同様にす
るがただし単量体溶液中でかなり一層高濃度（２００の
９／泌）のアルブミンを使用して製造する。 重合過程は例１におけるように行われた。最終粒子中の
アルブミンの含量は高く、そしてこれは粒子重量の約２
５％に相当した。例４ 例１と同機にするがただし７％のアクリルアミドおよび
３％のビスアクリルアミドを単量体溶液中に使用しそし
てアルブミンをコンカナバリンＡ（２雌／泌）に変えて
、微細粒子を製造した。 得られた粒子は、そのサイズが約１〜５仏ｍの間で変動
しており、そして生理学的塩溶液中では赤血球に強く結
合しうるようであった。雛光性ィソチオシアネートもま
たこの得られた粒子に非常に容易に結合することができ
た。例５ コンカナバリンＡと共に蟹光性ィソチオシアネートを使
用して変性した人血清ァルブミン４・量を使用して例４
に従って粒子を製造した。 得られた粒子は蟹光下に顕微鏡で容易に観察することが
できた。例６ 例１と同様にして、スタフィロコッカス・アウレウスか
ら蛋白Ａを使用して粒子を製造した。 水性溶液中の濃度は４の９／の

【であった。得られた粒
子は、人由来の正常免疫グロブリン（主として１ｇＧＩ
）を共有結合してより結合させたセフアロ−ズカラム中
で捕捉されうろことが証明された。例７約４００００の
平均分子量を有するデキストランをシアノーゲンブロミ
ドで処理した。 ビオゲルＰ−６より成るカラムに通すことによってグリ
シンをデキストランにカップリングさせた。このように
して変性されたデキストランを、例１と同様にして微細
粒子中に不動化させた。遊離アミノ基を与える異つた化
合物を共有結合によって、普通の合成法によって、グリ
シンから導かれたカルボキシル基にカップリングさせる
ことができた（例えばインシュリン）。「インシュリン
微細粒子」を次いで異つた細胞のインシュリンレセプタ
ーの研究に使用することができる。例８ 例７に与えられている原則に従って、放射能ラベルイン
シュリン（１２５１インシュリン）もまたこの微細粒子
中に結合させることができた。 細胞に対する結合は、放射能によってより容易に定量す
ることができた。例９ プロモスルホフタレィンはアルカリ性ｐＨにおし、ては
強い青紫色染料である。 これをプロモ層換によって、異つたタイプの多糖類例え
ば交叉結合アガロースにカップリングさせることができ
る。例１と同様にして「結合プロモスルホフタレィンを
含有する微細粒子が製造された。この粒子はその溶液か
ら、アルブミンおよび豚肝臓からのりガンジン様蛋白質
を吸収しうろことが証明された。同様の方法で、プロモ
スルホフタレィンをポリエチレングリコールにカップリ
ングさせることができた。次いでこれを微細粒子中に橘
集ごせた。例 １０例１と同様にして、ポリー１−リジ
ンをアルブミンの代りに微細粒子中に橘集させることが
できた。 例１１ アクリルアミドの代り‘こアクリル酸を使用する以外は
例１と同様にして、微細粒子を製造した。 例１と同一の方法で得られた微細粒子は、そのサイズが
約５仏ｍまで変動していた。これらはカルボキシル基を
含有していて、これがそれらを中性ｐＨ値において負に
荷電させていた。この荷電は、負に荷電した他の物質か
らそれらを反溌させる。本例は、アクリルアミド対アク
リル酸の比を１：０〜０：１まで変化させうろことを証
明する。例 １２Ｂ−およびＴ−リンパ細胞の混合物中
で、この混合物を微細粒子（平均０．５〆ｍ直径）と共
に３０分間０℃でバッファー中で培養することによって
、Ｔ−リンパ細胞を特異的にラベルした。 前記粒子は、Ｔ−リンパ細胞に特異的に結合しうるしク
チンであるヘリツクスポマチア・アグルチンおよび蟹光
ラベルアルブミンを含有していた。この細胞混合物を次
いでバッファー中の懸濁液をつくりそして前記懸濁液を
遠心することによって洗浄して過剰の粒子を除去した。
その表面に結合粒子を有する細胞混合物の細胞は、蟹光
顕微鏡下で検出することができ、そして次いでそのＴ−
リンパ細胞の含量を計算することができた。例 １３ 例１２と同様の方法で実験を行なった。 １随一変性ァルブミンの代りに、ここでは粒子は蟹光で
ラベルしたアルブミンを含有していた。 粒子と細胞とのコンプレックスはオートラジオグラフイ
ーにより検出された。例１４ 例１３と同様の方法で実験を行なった。 蟹光でラベルしたアルブミンの代りに、粒子はここでは
フヱリチンを含有していた。この粒子のコンプレックス
は電子顕微鏡を使用して検出された。例１５ Ｂ−およびＴ−リンパ細胞より成る細胞混合物から、こ
の混合物を３■ふ間例】２１こ従ってへりックスポマチ
ア・アグルチニン含有微細粒子と培養することによって
、Ｔ−リンパ細胞を分離した。 次いでこの細胞混合物を藤糖またはメトリゾェートの勾
配の上に層として置き、そして４５分間３０００比ｐｍ
で遠心した後には、その粒子と反応しなかった細胞は勾
配の最下位帯城として再び見出された。勾配の上部には
、細胞と反応しなかった粒子が再び見出された。これら
二つの城の間の分野には、種々の程度にこの粒子と反応
した細胞が見出された。例 １６例１５と同様の方で実
験が行われたがただしその粒子は粒子中に重合させたヨ
ード変性ポリチロシンの故に細胞よりもより高い密度を
与えていた。 帯域（ゾーン）の順序は例１５と比べた場合逆であつた
。例 １７ 例１５と同様の方法で実験を行なったが、ただしへりッ
クスポマチア・アグルチニンはこの粒子中に重合させた
コラーゲンに共有結合によってカップリングされていた
。 Ｔ−リンパ細胞を粒子との相互作用によって分離した後
、この細胞をコラゲナーゼを使用した酵素的消化によっ
て再び粒子から遊離させた。例 １８（モルフィンの放
射免疫アッセー）市場的に入手可能な兎抗モルフィン血
清をポリアクリルアミド粒子の粒子中に重合させた（Ｔ
−Ｃ＝７．５−５）。 この粒子の平均直径は１〜２舷ｍであった。使用前に、
この微４・粒子を、０．１９ＭＮａＣ１、０．１％（ｖ
／ｖ）ツイン２０および０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンを
含有するｐＨ７．５の０．０８Ｍホスフェートバッフア
‐中で注意して洗った。 ２０のとの充填微細粒子に対しては１の‘の抗血清が充
分であった。 この微細粒子を段階的に２倍希釈し、そして各希釈液の
０．５の‘をェルマンチューブ中に入れた。次いで３５
００のｐｍのトリチウムラベルしたモルフィンを各希釈
液に加えた。添加されたモルフィンの５０％を結合させ
た粒子の希釈液を次の分析操作に使用した。標準曲線は
、既知量のラベルしてないモルフインを３５００Ｍｐｍ
モルフイン（体積０．５の‘）に加えることによってつ
くられた。０．５私の粒子懸濁液を添加した後、この懸
濁液を鷹拝することないこ室温に４時間放置した。 次いでこのチューブを、５分間４７００ＲＰＭで通常の
卓上型遠心機中での遠心分離にかけた。この上澄液０．
５肌をピペットで除去し、そしてこの量までのシンチレ
ーション液体を加えた後、この混合物をシンチレーショ
ンカウンター中で計数した。標準曲線はロジットーログ
プロットによってつくられた。これは５〜１呼夕の低い
モルフィン量の測定を可能ならしめる。血清試料中のモ
ルフィン含量は血清１の【当り５〜１仇夕まで測定され
た。 例１９ 例１８と同様にするがただし兎抗ジゴキシン抗体を粒子
中に重合させて血清中のジゴキシンを測定する実験を実
施した。 ジゴキシンはアイソトープ１１２５でラベルされており
、そしてジゴキシン０．軸夕までの量が測定された。例
２０ 例１８と同様にするがただしモルモット抗インシュリン
血清を粒子中に重合させて血清中のポリベプチドホルモ
ンインシュリンの測定実験を行なった。 インシュリンは１１５でラベルされており、そして血清
１叫当り６．５＆Ｕの低いインシュリン量がこの方法に
よって測定された。しかしこの分析は固体相の使用に基
づく通常の技術よりはわずかに一層多量の抗血清を消費
した。例 ２１ 免疫グロブリンＧに結合する能力を有する細菌のスタフ
イロコツカス・アウレウスからの蛋白を含有する粒子を
過剰の兎抗牛血清アルブミン（既Ａ）に加えた。 過剰の抗体を、０．１８ＹＮａＣ１および０．１％（ｖ
／ｖ）ツイン２０を含有する０．０８Ｍホスフェートバ
ツフア‐（ｐＨ＝７．４）で洗い去った。粒子をそのバ
ッファー中で５％（ｖ／ｖ）濃度に希釈した。即ｇ／の
上まで強く希釈したＢＳＡ溶液５呼夕をシリコーン処理
したガラス状表面に置いた。粒子懸濁液５岬夕を各小滴
に加えそして反応せしめた。約３■ご後、ＢＳＡの溶液
中に粒子の明らかな凝集が観察された。この凝集はバッ
ファーのみを有するブランク中には認めることができな
かった。１０〜１則ｇ／のヱの低い聡Ａ量が検出された
。 例 ２２ 例２１と同様の方法で実験を行なったがただし球形粒子
中にはジニトロフェニル変性牛兎疫グロブリンＧ（蛋白
１モル当り７モルのＤＮＰ）を重合させてあった。 このジニトロフェニル基に指向する抗血清を強い希釈度
で加えた（１００００〜５０００００倍）。粒子懸濁液
（５％ｖ／ｖ）にその抗血清を加えると例２１による凝
集が得られた。この凝集は抗血清が溶液中にかｇノ似ま
での量で存在している場合には阻害された。例 ２３ 本例の実験に対しては、粒子乾燥重量の１５％に相当す
る人血清アルブミンを含有するポリアクリルアミドより
成る微細粒子が使用された。 この粒子２５の９をそれぞれ１のとの０．００９Ｍ燐酸
ナトリウムバツフアー、０．１ＭＮａＣ１（ＦＨ７．４
）およびサリチル酸を０．１〜２．０に変動するサリチ
ル酸：アルブミンモル比で含有する一連の試験管中に懸
濁させた。 １び分間培養後、この試験管を遠心しそして上燈液中の
サリチル酸含量を測定した。 各サリチル酸添加量に対する粒子中のアルブミンに結合
しなかったサリチル酸量の測定値が得られた。この値は
、いわゆるスキャチャード・プロットに描かれた。これ
から、アルブミンに対するサリチル酸の会合定数（＝０
．３×１びＭ‐１）を読みとることができた。例 ２４ サリチル酸の代りにワルフアリンを用いる以外は本実験
は例２３と同様にして行われた。 会合定数は０．２×１ぴＭ−１であった。例 ２５ 本例はサリチル酸の代りにチロキシンを使用しそして人
血清アルブミンの代りに人血液プラズマから得られたチ
ロキシンに結合しうるグロブリン（ＴＢＧ）を用いる以
外は例２３と同様にして行われた。 以下に本発明により開示された新規な技術的事項を要約
して示す。 １ 粒子サイズが１岬ｍ以下でしかも粒子の平均直径が
０．５〜４仏ｍの範囲好ましくは１仏ｍでありそれによ
って生物学的活性物質が粒子の網状構造中に入り得ない
ような物質に対してその生物学的活性を示しることを特
徴とする〜ゲルの形でそして三次元重合体状絹状構造の
形態にありそしてその絹状構造のメッシュ内に燕集され
た生物学的活性物質を含有する微細孔性球形粒子より成
る不動化された生物学的活性物質。 ２ 粒子が低分子アクリル化合物または１ービニル−２
−ピロリジノンと低分子ジビニル化合物との共重合体よ
り構成されていることを特徴とする、前記第１項記載の
不動化された生物学的活性物質。 ３ 粒子が、式 〔式中Ｒ，は水素またはメチルを表わし、そしてＲ２は
ＯＨまたは一ＮＨＲ３（式中Ｒ３は水素または１〜６個
の炭素原子を含有する道鎖状または分枝状ァルキル基で
あり〜そしてこのアルキル基は未置換であるかまたはヒ
ドロキシルまたはオキソ基により置換されている）を表
わす〕を有するアクリルアミドとＮＹＮ′−メチレンビ
スアクリルアミドとの共重合体より構成されていること
を特徴とする、前記第１または第２項記載の不動化され
た生物学的活性物質。 ４ ゲル形態のそして三次元重合体絹状構造の形態でそ
してその絹状構造のメッシュ中に瓶集された生物学的活
性物質を含有し、そして１岬ｍ以下のサイズおよび０．
５〜４仏ｍの範囲好ましくは１ぷｍの平均直径を有する
微細孔性球形粒子を包含する不動化させた生物学的活性
物質の、凝集、免疫測定、免疫アッセーまたは細胞レセ
プ夕−アッセ一法における前記生物学的活性物質がその
成分の一つとして包含されている生物学的特異性のある
系の成分の定量的測定用試薬としての使用。 ５ 不動化された生物学的活性物質が放射を発光しる原
子または基で、または酸素または発色性の基でラベルさ
れたものであることを特徴とする、前記第４項記載の使
用。 ６ ゲル形態のそして三次元重合体網状構造の形態であ
りそしてその網状構造のメッシュ中に橘集された放射発
光性原子または基または酵素または発色団でラベルされ
た生物学的活性物質を含有しそして１妙ｍ以下のサイズ
および０．５〜４＆ｍの範囲好ましくは１＆ｍの平均直
径を有する微細孔性球形粒子を包含する不動化された生
物学的活性物質の、細胞「細胞フラグメントｔビールス
「 またはその一つが生物学的活性物質に対して特異的
に指向されるような特異的レセプタ−を有する組織構造
体またはその一つが生物学的活性物質と特異的に反応す
るような特異的表面構造を有する物質をラベルするため
の使用。 ７ 細胞「細胞フラグメント「 ビールスまたは特異的
レセプ夕−を有する組織構造体または特異的表面構造を
有する物質を「前記細胞その他に特異的にこの生物学的
に活性な物質を作用させて複合体を形成させそしてこれ
を次いで密度差またはガラス壁への前記粒子の吸着に基
づく方法によって物質混合物の他の成分から分離するこ
とによる、そのような細胞、細胞フラグメント「ビール
ス「組織構造体または物質含有の物質混合物からの分離
をすることに対する「ゲル形態でそして三次元重合体状
絹状構造の形態でありそしてその絹状構造のメッシュ中
に桶集された生物学的活性物質を含有しそして１０処ｍ
以下のサイズおよび０．５〜４舷ｍの範囲好ましくは１
舷ｍの平均直径を有する微細孔性球形粒子を包含する不
動化された生物学的活性物質の使用。 ８ 生物学的活性物質を放射を生成しうる原子または基
または酵素または発色性基でラベルすることを特徴とす
る「前記第７項記載の使用。 ９ 生物学的驚異性のある系における一成分の定量的測
定のための凝集、免疫測定、免疫アッセーおよび細胞レ
セプターアッセー法における「前記生物学的特異性の系
中に包含されそして三次元網状構造の構造形態を有する
微細孔性球形粒子に結合されている生物学的活性物質を
包含する試薬を使用しそしてその場合使用される粒子が
１０舷ｍ以下のサイズおよび０．５〜４仏ｍの範囲好ま
しくはｌＡｍの平均直径を有しそして粒子中にはその三
次元絹状構造のメッシュ中に補集されていることによっ
て生物学的活性物質が不動化された状態で存在している
ことを特徴とする改善。 １０ 生物学的活性物質を放射発生性原子または基、ま
たは酵素または発色基でラベルすることを特徴とする、
前記第９項記載の改善。 １１ 固体損体に結合させた放射発生性の原子または原
子団、酵素または発色団によりラベルされている生物学
的活性物質を包含する試薬との生物学的特異性のある相
互作用によって、細胞、細胞フラグメント、ビールス、
またはそのレセプターの一つが前記物質に特異的に指向
されるような特異的レセプタ−を有する組織構造体また
はその表面構造の一つがそれと特異的に反応を行うよう
な表面積造を有する物質をラベルするにあたり、ゲルの
形態でそして三次元絹状構造の構造形態を有しそして１
０叫ｍ以下のサイズおよび０．５〜４Ｍｍの範囲好まし
くは１仏ｍの平均直径を有しそして生物学的活性物質が
前記三次元網状構造のメッシュ内に不動化された状態で
橘集されて存在しているような微細孔性球形粒子を固体
損体として使用することを特徴とする方法。 １２ 固体坦体に結合させた生物学的活性物質を包含す
る試薬との生物学的特異性ある相互反応を行わせて複合
体（コンジュゲート）を生成させこれを密度差またはガ
ラス肇に対する担体の吸着に基づいた方法によって物質
混合物の他成分から分離することによって細胞、細胞フ
ラグメント、ビールス、またはそのレセプターの一つが
前記物質に特異的に指向されるような特異的レセプター
を有する組織構造またはその表面構造の一つがそれと特
異的に反応するような表面構造を有する物質を前記細胞
、細胞フラグメント、ビールス、組織構造体または物質
の物質混合物から分離するにあたり、三次元絹状構造の
構造形態を有しそしてｌｏｗｍ以下のサイズおよび０．
５〜４仏ｍの範緯好ましくは１一ｍの平均直径を有しそ
して生物学的活性物質が前記三次元絹状構造のメッシュ
内に橘集されて不動化された状態で存在しているような
微細孔性球形の粒子を固体迄体として使用することを特
徴とする方法。 １３ 生物学的活性物質を放射発光性原子または基でま
たは酵素または発色団でラベルすることを特徴とする、
前記第ＩＺ頃記載の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 粒子サイズが１０μｍ以下でしかも粒子の平均直径
   が０．５〜４μｍの範囲でありそれによって生物学的活
   性巨大分子物質が粒子の網状構造中に入り得ないような
   物質に対してその生物学的活性を示しうることを特徴と
   する、ゲルの形でそして三次元重合体状網状構造の形態
   にありそしてその網状構造のメツシユ内に捕集された生
   物学的活性巨大分子物質を含有する微細孔性球形粒子よ
   り成る不動化された生物学的活性巨大分子物質。