JPS60135401A - デキストラン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特に抗凝血性と抗補体性とを有するデキストラ
ン誘導体並びにその製法及び生物学的使用に係る。

周知の如く、へバリンは抗凝血性が高いため抗血栓症薬
剤として広く使用されている。

Ｋ関するヘパリンの作用も立証された。

しかしながらヘパリン鎖は特に構成及び枝さが不均一で
あるためへバリンの特性の原因となる構造の究明は容易
ではない。

ヘパリンの特性の少な（とも一部を有し且つ明確に規定
された構造をもつため問題のメカニズムを究明するため
のそデルとして使用し得るような物質を生成すべく、こ
れまで多（の実験が行なわれてきた。

そこで本発明の共同発明者のある者は抗凝血特性有する
生成物に注目し既に引用された私印特許第２４’６１７
２４号及び欧州特許第８０４０１０５３．６に記載した
。上記生成物バー５ｏ３Ｒ１，−Ｒ，Ｓｏ、Ｒ，。

−５Ｏ，Ｒ１，−Ｒ，−３ｏ、−Ｒ１及び−ＣＨ，−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ−（但し、式中、Ｒ８は水
素原子９．．１生理学的に許容し５る金属であり、Ｒ２
はアミン基で一５ｏ、−と結合するアミノ酸残基であり
、Ｒ，）ｉ−ＣＨ−Ｃｏ−ＮＨ−ｔＲ４基（Ｒ，はアル
キル、アリールもしくはアリールアルキル又は置換もし
くは未置換の一部　Ｈ＊　（◇である）であり、Ｒはア
ミノ酸の倒錯である）の基を有するポリマーからなる。

この分野における種々の実験の結果１本発明者等は既に
公知の多糖即ちデキストランの研究を行なうことになっ
た。

デキストランは分子量が約５ｏｏｏから数百万ダルトン
のポリグリコシドであり、１−６型詰合を主体とするモ
チーフ（単位）Ａの連鎖からなる。

このモチーフＡは次式で示される。

治療上には一般に分子量が約１０００００より少ないデ
キストランを使用する。

この物質は主に血漿の代換物として、又は少な（ともそ
の増量剤として使用される。但しこれらの用途に用いる
と場合によっては免疫ショックを誘発することもある。

ヘパリンの特性の少なくとも一部に類似した生物学的性
質を有し且つ免疫ショックを誘起し難いポリマーを生成
すべく様々な研究を行なった末に。

本発明者等はデキストラン鎖の種々の置換体を研究する
ことになった。

諸実験の結果、成る種の置換基が所定の比率に従って同
時に存在すると、デキストラン鎖に極めて有利な生物学
的性質と大きな許容度（ｔｏ１６ｒａｎｃｅ　）とが授
与されることが判明した。

以上の理由から本発明では許容度が茜いために生物学的
材料として使用し得且つへバリンの生物学的特性の少な
（とも一部を有するようなデキストラン誘導体を提供す
る。

本発明は使用が容易なこの種の誘導体の製法にも係る。

本発明は更にこれら誘導体をベースとし且つ合成によっ
て得られるという利点を有する可溶性生物材料及び高効
力薬剤の供給をも目的とする。

本発明のデキストラン誘導体は約８０００ドルトンを上
回る分子量を有し、且つ統計的に一構造一部−（ＣＨ，
）。−Ｒ−Ｃｏｏ−［式中Ｒは単結合又はＣｏ−ＮＨ−
（ＣＨ，）。−基を表わし、ｎは１〜１０の数　ｎｌは
１〜７の数を表わす〕で示されるカルボキシル官能基を
もつ基により置換されたモチーフ日を少な（とも約３５
係特には４０彊含むと共に。

一＠＠−０−（ＣＨ・２・−Ｃｏ−ＮＨ−Ｒ・喉□又は
有機塩のアニオン、より特定的には５Ｏ８−基を表わし
、ｎは前述の意味を表わす〕で示される基をもつ鎖によ
り置換されたモチーフＤを少なくとも約３４含むことを
特徴とする。

前述の置換鎖を用いてデキストランの支持体を官能化（
ｆｏｎｃｔ　１ｏｎｎａ目５ａｔｌｏｎ）すると該支持
体に抗凝血活性が有利に与えらえる。この活性はへバリ
ンのそれよりは弱いが前述のＦｊ堺体を生物学的に使用
する場合には極めて有利に作用する。

これらの物質は更に抗補体活性もヘパリンと同程度に有
していると考えられる、 これらの利点が得られるのは （１１モチーフＢにおけるカルボキシル基と（２）モチ
ーフＤにおける置換鎖とが双方同時に存在するためであ
る。前記置換鎖は無機塩又は有機塩のアニオンによって
置換されたアリール基、より特定的にはアリールスルホ
ナート基を含み、骸晶はアミド基を含む枝によってデキ
ストラン鎖に結合される。

本発明の有利な実施例ではこれらデキストラン誘導体は
更に構造−〇−（ＣＨ２）。−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１→　〔
式中Ｒ１及びｎ％！前述の意味を表わす〕をもつ基で置
換されたモチーフＣをも含む＠デキストランの未置換モ
チーフＡと前述のモチーフＣとは全体でモチーフ総数の
最高６０係を占める。

本発明の好ましいデキストラン誘導体グループは鎖−０
−ＣＨ，−Ｃｏｏ−で置換されたモチーフＢを含む。

本発明の別のデキストラン誘導体グループではモチーフ
Ｂがカルボキシエチル基、カルボキシプＣ００−（式中
ｎは夫々２．３又は４に等しい〕で置換される。

別の好ましい誘導体グループではモチーフＢが基−０−
（ＣＨ，）。−Ｃｏ−Ｎｌ−１−（Ｃ１ｌ□）。、−ｃ
ｏｏ−で置換される。

ｎ′が４．５又は７に等しい誘導体は夫々吉草酸基、ア
ミノカプロン酸基及びアミノカプリル酸基に該当する基
−ＮＨ−（ＣＨ＊）。、−ｃｏｏ−を含む。

本発明の別の好ましいデキストラン誘導体グループは前
記グループ中の１グループのモチーフＢの鎖で置換され
たモチーフＤをも含む。

更に別の好ましいグループではデキストラン鎖が前記モ
チーフＢ以外に構造−ｏ−（ＣＨ２）　ｎ−ｃｏ−ＮＨ
−ｃ＋２（Ｊ　をもつ鎖で置換されたモチーフ２ Ｄを含む。

また別の好１．・グループではモチーフＤが構わし好ま
しくは１に等しい。

一般的には、モチーフＢ、Ｃ及びＤの置換基は本質的に
基本グリコジルモチーフの２位を占める。

但しこれら置換基が他の部位を占め、場合によっては２
位も占めるような誘導体も本発明の範囲内に含まれる。

本発明はまたグリコジルの一部Ｈ基の、一部が一０Ｒ３
の形態で存在する誘導体にも係る。

これら一連の誘導体を製造する過程で本発明者等はモチ
ーフＢの割合が約３５憾より少ないと抗凝血活性が極め
て弱（なることを発見した。モチーフＤが全く存在しな
い場合にも同様の結果が生じる。

一般的には、モチーフＢの割合が４０〜５０４のオーダ
ーであるとモチーフＤの数のＪ曽加と共に抗凝血活性が
増大し、抗補体活性がへバリンｋ・１し５分子量がより
少な（て１００００のオーダーでは、ａ　ｏ　０〜４０
０　ｖＴ／ｍｙオー１−−ｆ）値ヲ有スることができる
。この生成物は１〜ｉ　ｏ　ａｐ７ｘｏ’ＥＡＣ４ｂ３
ｂＢｂＰオーダーの抗補体活性を示す。

これらの値は実施例中に記載の方法で測定した。

モチーフＤの割合がより少なくて約４係、モチーフ８の
割合が４０〜５０憾の時には、抗トロンビン活性はより
低（て１〜５１．ｌＴ／■のオーダーであり、抗補体活
性はより高く１〜ｌ０ＺＩＡ’／１０７ＥＡＣ４ｂ３ｂ
ＢｂＰのオーダーである。

本発明の特に好ましい誘導体グループは下記のモチーフ
Ａ、Ｂ、Ｃ及びρ を前記の比率で含むデキストラン誘導体からなる。

本発明はまた前述の如きデキストラン誘導体の製法にも
係る。

この製法では、未置換モチーフＡで形成されたデキスト
ラン鎖を使用してモチーフＢ、Ｃ及びＤを順次形成する
。これらのモチーフはいずれも指定の順序に従い前に形
成したモチーフから祠る。

デキストラン鎖におけるこれら種々のモチーフの形成法
は下記のステップからなると有利である。

−デキストランを次式 ％式％ 〔式中Ｘはグリコジルモチーフの一部Ｈ基とのグリコジ
ル化結合を実現せしめろ反応基を表わす〕で示される誘
導体と反応させてそチー７Ｂを形成する。

一モチーフＡ及び８を含む該デキストランを次式 ％式％ 〔式中Ｒ１は前述の意味を表わす〕で示される誘導体と
反応させてモチーフＢの置換鋼に由来する基に置換アリ
ール基をアミド架橋（ｐｏｎｔ　ａｍｉｄｅ）により固
定させ、それによってモチーフＣをデキストラン鎖中に
導入する。

一モチーフＣを塩化し℃モチーフＯを得る。

−デキスト２ン誘導体を分別し分子量８０００未満の誘
導体を除去する。

好ましくは先ずデキストランを分離し、次いで上記ステ
ップの操作を行なうことができる。

上記各ステップはデキストラン鎖において所望のモチー
フ比率が得られるまで任意に繰返してよ℃＼。

モチーフＢを形成する場合はハロゲン化物の如き反応性
誘導体をデキストランと反応させると有利である。この
ハロゲン化物としては入手し易いという理由から塩化物
を用いるとよい。

グリコジル化反応は加水分解し易いデキストラン鎖の損
傷を回避せしめるような条件の下に塩基性媒質中で生起
させる。

そのためには、デキストランを含む塩基性反応混合物の
温度を約０−キダシ、特に−４゛〜＋５°Ｃの範囲の値
にする。

反応性誘導体を添加した後該混合物の温度を室温より高
く最高的７０“Ｃまでの値に上昇させる。

好ましくは適当な温度勾配に従い室温から約５５℃まで
温度を漸増させて前記操作を行なう。

七の結果効率は１ステップ当り５０優になり、２ステツ
プでほぼｘｏｏｌに達し得る。

抗補体性の高い物質を得たい場合にはモグ・−フＢの割
合を小さくすることが好ましいが、誘導体の抗凝固活性
を高めるためにはこのモチーフの割合を太き（しなけれ
はならないため、このようなモジュレーションは有利テ
アル。

反応性誘導体対デキストランの濃度比は１．５〜３．５
が望ましい。

沈殿によって生成物を回収するためにを工ｐＨ％中性ｐ
Ｈまで下げる。

その場合は溶媒、特にメタノールの如きアルコール性溶
媒を用いて生成物を沈殿させる。

モチーフＢ中の鎖Ｒが−Ｃｏ−ＮＨ−（Ｃ，Ｈ２）。Ｉ
基を表わす場合は、対応アミノ酸との反応により鎖−〇
−（ＣＨ，）。−ｃｏｏ−で置換されたモチーフＢから
生成物を得ると有利である。

モチーフＣの形成ステップは式ＮＨ，−Ｒ，（→の誘導
体をモチーフＢの置換鎖と結合させることからなる。有
利には結合剤を室温下酸性媒質中で使用する。

この結合剤としてはＲｅａｃｔｌｆｓ　ＩＢＦ、Ｐｒａ
ｃｔｌｃａ１ｇｕｉｄｅ　ずｏｒ　ｕ８ｅ　Ｉｎ　ａｆ
ｆｌｎｌｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ″１７７
５、第３４〜第３７頁に記載のもの、特にＮ−エトキシ
カルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロコリン（
ＥＥＤＱ）又はカルボジイミドがある。

より高い、即ち約１０係の置換効率をもって反応を生起
させるべく別の方法として、アルキル（特にエチル又は
イソブチルアルキル）クロロフォルメートと、その反応
で形成されるＭＣＩと塩酸塩を形成できる誘導体、Ｎ−
メチルモルフォリン又はその類似物とを反応させること
によりデキストランの混合無水物を製造することもでき
る。この活性化ステップは０℃未満１例えは一１０℃、
特に−１６℃の温度で実施するのが好ましい。この反応
は数分間で極めて迅速に生起する。その後低温で前記結
合を実施せしめる。

結合すべき誘導体対置換デキストランの濃度比は約２が
有利であり、前記クロロホルメート対デキストランの濃
度比は約１にすると有利である。

モチーフＢのアリール核に基Ｒ８を導入する場合は、Ｒ
３を有する反応性誘導体を用いる。

Ｓｏ、−基による置換はデキストラン鎖の損傷を回避す
べ（希釈した状態でクロロスルホン酸を用いて行なうと
有利である。このステップを不均質相で実施し、生成物
を回収し、洗浄及び乾燥処理する。

このステップではモチーフＣの芳香族環の約半分までの
置換が可能である。

必要であれは所望θ」置換率が得られるまで前記操作を
繰返す。

このよう圧して得られた置換デキストランは生物学的用
途に使用すべく洗浄した後凍結乾燥して保存する。

この製法を用いれは可溶性であるという利点をもつ一連
のデキストラン誘導体を合成により置換モチーフの比率
を所望の性質に応じて極めて多様に変化させながら製造
することができる。

前述の如きデキス誘導体紡導体の生物学的活性をＮ！に
のレベル、特に凝血に係る成る種のタンパク、主にトロ
ンビンと補体系とに関して調べた。

得られた結果によれは、トロンビンに対するこれら誘導
体の活性はモチーフＢ及びＤの割合に左右される。

この活性はモチーフ日の割合が３５憾を越えると、より
偶定的には４０嗟を越えると出現し、モチーフＤの比率
と共に増大する。従ってこの活性は置換＠Ｂ及び０間の
協働効果によって生じるものと。考えられる。

本発明の誘導体の幾つかの同一分子画分（ｆｒａｃｔｌ
ｏｎｓ　ｌｓｏｍｏｆ６ｃｕｌａｌｒｅｓ　）を調べた
結果、トロンビン阻害活性は分子量と共に確実に増大す
ることが判明した。

対する大きな阻害力が確認された。

従ってこれら物質は血液の存在下では溶血を減少せしめ
且つ生体の炎症反応を低減せしめる作用をヘパリンと同
程度に示すことができる。

これら誘導体は許容度が高いため更に一層有用である。

ＮａＣ１等張溶質中に本発明の改質デキストランを４０
■／ｄ溶解した溶液を約２ＯＮのマウス１匹につき０．
５ｄの割合で静脈注射して毒性テストを行なった。これ
らテストの結果本発明の生成物は全く無害であることが
判明した。即ち、注射の間も、注射に続（１４日の期間
の間も反応は全（見られなかった。

これら誘導体は前述の如き性質を有しているため血漿の
代換物又はより特定的には増量剤として使用するのに極
めて適しており、場合によって生じ得る過敏性の危険性
が少ないという点でデキストランより有利である。

従って本発明は塩含有媒地中に約５４〜１５４゜特に約
１０４で溶解した前述のデキストラン誘導体をペースと
し、血漿の代換物及び増量剤として使用し得る生物学的
材料をも提供する。

この種の増量剤は例えは約１．５〜２ｇ／日、特に約２
６７日の割合で使用される。

前述の誘導体は治療作用をもつ種々の物質を固定するｔ
こめの貴重な支持体をも構成する。

医薬品のベクトル（ｖｅｃｔｅｕｒｓ　）に応じて活性
物質の賦形剤として許容し５る支持体を形成して合成の
中間生成物を構成する。

（以り余白） 以下、デキストラン誘導体の製造およびその生物学的活
性の検討に関する実施例を挙げて本発明の詳細な説明す
る。

ＮＨＮＨ １ ０１Ｎａ Ａ　Ｂ　ＣＤ 低圧下の液体クロマトグラフィーによって分離した分子
量が８０００よシ大きいデキストランサンプルを次の５
段階処理にかける。

１）モノクロロ酢酸によるカルＩキシメチル化。

２）この誘導体の結合によるベンジルアミンの固定。

３）ベンジルアミンの芳香核のスルホン化。

４）洗浄および乾燥。

この段階は、Ｆ、ＡＮＴＯＮＩＮＩらの方法（Ｇｌｏｒ
ｎ。

Ｂｌｏｃｂｉ、、１４　、　８８　、１ｉ１６５　）に
依る。

攪拌システムを備えかつ浴〔氷＋塩（−４℃）〕中に３
／２　だけ浸漬したＩＡ’のフラスコ中で、デキストラ
ン４　ｇ、　６　ｆｌ　（０，３０モル）をソーダ６４
００ｍ（２，４モル）に溶解する。

−４℃で２０分間攪拌する。

ＣＪＣ）ｆｓｃＯＯＨ１００Ｊｉ’　（１，０５モル）
を少しずつ（１０分間かけて）フラスコ中に入れる。

温度を７０℃に上げ、攪拌下この温度に２０分間保つ。

フラスコを水浴中に２／３漬けて冷却する。

はぼ１１の値を示すｐｇを酢酸添加により７に調整する
。

メタノールＢｉｔで生成物を沈澱させ、次いでメタノー
ルで洗浄後はぼ４０℃の乾燥器中真空下で乾燥する。

この方法によ）、デキストラン環の約３０％か巨大分子
鎖の外層を伴なうことなく置換される。

この操作を複数回（ｎ回）繰シ返すと置換度が上昇する
。この様子を次の表！に示す。

表！ １　３０−３２ ２　４５−５０ ３　６０−６５ ４　７５−８０ ５　９０−９８ 第２段階　ベンジルアミンの固定 この段階は、Ｐ、Ｖ、８ＵＮＤＡＲＡＭの方法（Ｂｌｏ
ｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ｒｅｉ、　Ｃｏｍｍ、、
　６１　、７１７　。

１９７４）に従う。

２１フラスコ中、攪拌上周囲温度で、（第１段階で調製
した）カルブキシメチル化デキストラン単位を９０％有
するカル〆キシメチルデキストラン４０．９を水２９０
−に溶解する。

１Ｎ塩酸を用いてｐＨを約３，５に調整する。

無水エタノール７１０−中に溶解した次式：％式％ （０，３６０モル）を入れる。

３０分間攪拌する。

ベンジルアミン４ｏ−（ｏ、ａｇモル）全加工、−晩攪
拌する。

混合物を蒸発によシはとんど乾燥し、メタノール２１を
用いてデキストランを沈澱させ、メタノΦ ジルで洗浄後、４０℃乾燥器中真窒下で乾燥する。

第３段階　ベンジルアミンの芳香核のスルホン色 第２段階で得られたベンジルアミン１ミリモル／ｙを含
有すふ生成物１２ｐを攪拌下でメチレンクロライド２４
０ｄ中に分散させる。

クロロスルホン酸２．４＋ｄ　（ｏ、ｏ　ａ　６モル）
ヲユっくりと加え、反応混合物を攪拌下で一晩放置し、
濾過し、エタノールで洗浄後、４０℃の真空乾燥器中で
乾燥する。

この方法によって、ベンジルアミンの芳香環の約半分ま
でが置換される。

所望のスルホン化度をイ（）るには、この操作を繰り返
すとよい。

第４段階　洗浄および乾燥 第３段階で得られた生成物をソーダ水溶液に溶解し、ｐ
Ｈを２時間８に保つ。

次いで、Ｍｌｃｈａｅｌｌｍ　緩衝液でｐＨを７．３５
１Ｃ平衡化した水で洗浄し、更に水で洗浄する。これら
の全操作は、限外濾過（適切な排除限界を有する半透膜
λ法を使用して行なう。

最後に生成物を凍結乾燥する。

トロンビン時間（ＴＴ）及びレプチラーゼ時間（ＴＲ）
を測定する。

トロンビン時間は、血漿試料あるいはフィブリノーゲン
溶液中にトロンビンを加えた後、血塊が形成される時間
に対応する。

フィブリンにおけるフィブリノーゲンの転位能力がデキ
ストラン銹導体の存在によシ改変されないように、レプ
チラーゼ時間によシ制御できる。

本測定は、凝固測定器Ｄａｄｓ　ＫＣ１を使用して、と
３７℃でインキュベートした。

インキュベートは５分間行った。

０．１−のトロンビン溶液（ミバエリスバッファー中）
あるいはレプチラーゼｆｇ液（蒸溜水中）を加え、血塊
出現時間（ＴＴあるいはＴＲ）を測定した。デキストラ
ン銹導体を除いたＶｔの・々ツファーを使用して対照の
時間を測定した。

ポリマーのａ鹿によるものである、血漿に対するＴＴの
変化は第１図に示したようにヘノＲす／のそれと平行な
ようである。

この図によれば、ＴＴの変化は、（１）単位りを使用し
たヘノ９リンは、１７３ｕｉ／ダのＵＳＰ活性ト１０７
００ダルトンの分子麓を有している。

第１表Ｋｐｐ＠−＝ｂ血漿及びフィブリノーゲンに対す
るトロンビン時間・ｋレゾチラーゼ時間と同様に各種デ
キストラン誘導体くこれ等誘導体のＢ、　Ｃ及びＤ単位
の官有率は第２表に示した）か引得弾３０°Ｉ：ｉ３ｉ
、°”　（ｍＴや、。

ポリマーの存在によりレプチラーゼ時間は延長されず、
フィブリノーゲンは変化しないことが確認された。この
レプチラーゼ時間の不変性は、血漿におけるトロンビン
時間の延長の抗凝血効果にそり代り、その濃度が高くな
るとその時間のわいろ。

抗凝血活性 一漕駄ぼ 抗　、種々の濃度のポリマーの存在 下でのＰＰＰのトロンビン時間から測定する。

活性ａは生成物のダ当りによって不活性化されたト四ン
ピンユニット数として定義する。

この不活性化トロンビンの飢は検１ＩｉＩよシ測定する
。

同条件において、市販のヘパリンの活性ａ係数は４００
０ｕＴｈ／ｊｌ＆である。

（以下余白） 単位Ｂ、Ｄの割合による抗凝血活性ａの変化を備えた単
位Ｂあるいはスルホネー１Ｈ基を持つ単位りの割合に対
する関数としてｚＩＬ図及び２ｂ図に示した。

２ａ図は、溝１酢出ヨヒまジに一１５±１（曲線・）、
わされるＭＰ１０５００からのデキストラン誘導体の活
性りの変化に対応している。

２ｂ図は、単位りの割合の関数として表わされ単位Ｂの
割合が４７．５±２．５優の使用デキストラン誘導体の
活性見の変化に対応している。

これ等の結果を考察すると、単位Ｂを少くとも３５％合
有する生成物につき抗トロンビン活性があることがわか
る。

抗トロンビン活性の発現以上に、五組についても同様の
ことが首える（ｇａｇ）。

この先については、スルホ槃４基を持ったデキストラン
構成単位の割合が高くなるに従って強くなることが示さ
れている（ｚｂ図）。

分子量の影響 分子量と抗凝血活性の相関を調べるために非常に多拡散
した（ＭＷ＝１５６００　、Ｍｎ＝７４００　。

ＭＷ＝２．ｔ）、中程度に活性を持った（　ａ　＝　ｓ
　ｕＴ７４’　）デキストラン誘導体を以下のように分
画化した。

カラムの充填：予め洗浄し、２回蒸溜した蒸溜水中にお
いて２０℃で１０時間膨潤させたゲルを、長さ工ｆｎｓ
　内径２．５ｍのガラスカラム（ＬＫＢ）に入れた。

溶出液：　０．２ＭＮａＣｌ水溶液を使用し、Ｖａｒｌ
。

Ｐｅｒｐｅｘ”　（ＬＫＢ）ポンプによｆｉ２５ｍ／ｈ
の流速で溶出した。

チャージ：溶出液５ｄ中１００〜の形に竹収集容量：８
−０ 溶出液濃度の測定：ＵＶ（２８０ｎｍ）吸光度による。

このカラムの通過後、生成物は分子量に従って５つの分
画に分画化された（化学的定量により１分子量に従って
完全に分離されたかどうかを確認し加。

”　Ｍｅｒｃｋ　Ｌｉｅｈｒｏｓｐｈｅｒ”　１．００
　ｄｌｏｌカラムを使用した０、　２　Ｍ　ＮａＣｊｌ
水溶液中での高圧下（９０ｂａｒｓ）の液体排除クロマ
トグラフィー及びカラムの産量検査により各分画の分子
量を測定した。

各分画の抗凝血活性見は下記第３表にまとめた。

第３表 １　２７０００　２０ ２　１９０００　１４ ３　１５０００　８ ４　８０００　６ ５　６３００　３ 同定操作は４００００オーダーの分子量を有するデキス
トランを２０−中５００岬としてセファデックス５３０
０スーツ（−ファインＲダルの５　ｃｍ／　４０　ｃｒ
ｎのカラムにかけ、５つのフラクションを得て行ない、
その５つのフラクションは次の表４ｂのよう建同定した
。

表４ｂ １、　８５０００　３００ ２　５２５００　２８５ ３　３９５００　２７０ ４　２７５００　１５４ ５　１４５００　１１ 考慮した分子量の範囲では、抗凝血活性は分子量に比例
することがわかった。

接触相におけるタン／Ｑりは、内皮以外の表面に接触し
て活性になり、かつ少なくとも部分的に他の血液凝固因
子の活性化に関与するタンパクである。

接触相の活性化によって生起する酵素、カリクレインは
この系の活性化を増幅する。

（以下余白） −Ｌ／−（４９番るΦ禰１グ活桐掻会１１１１４ア以下
に、これら接触相のタンパクに対する作用という観点か
ら本発明のデキストラン誘導体を用いて得られた結果を
記載する。

方法 接触相の活性化の測定テストでは、カリクレインの酵素
活性を定薯゛する。この活性は、この酵素に対して特異
的な発色基質（５ｉｂｉｔｒａｔ　８２３０２　。

Ｋａｂ１社製）のアミド分解（ａｍｌｄｏｌｙｓｅ　）
によって確認される。加水分解産物の１つ、ノソラニト
四アニリン（ｐＮＡ）の放出速度を４０５　ｎｍの分光
光度針によって測定する。

４０５　ｎｍでの光学＆［の単位時間当たりの増加がカ
リクレインの酵素活性に比例する。

このテストでは、接触相の活性化の異なる段階で別々に
分析することができないので、このテストの応答は概括
的なものである。

デキストラン誘導体による活性化を、その濃度の関数と
して、また一方では置換基の性質および組成の関数とし
て解析した。

得られた結果によると、接触系の活性化量はデキストラ
ンの活性誘導体の濃度と共に増加すると思われる。

ポリマーの接触相に対する活性化能は、その抗参 一謡性と同様に置換基の性質および組成の関数として変
化すると思われる。すなわち、活性の増加分は、糖単位
Ｂの一定量以上であるし、糖単位りの割合が増大すれば
するほど顕著になるようである。

種々の化学組成物中のデキストラン誘導体のＣ３コンペ
ルターゼに対する作用を績討した。Ｃ３コンペルターゼ
とはＣ３蛋白質ｉ分町しうる酵素複合体であ９％Ｃ３蛋
白質は補体系の第２経路の蛋白質である。

特異抗体の存否によシ、補体系は感染物質（Ｌ／ａｇａ
ｎｔ　Ｉｎｆｅｃｔｏｕｒ　）又は外来細胞に対するホ
ストによる認識又は防御機構に関与する。

方法： Ｃ３ｂフラグメント（Ｃ３の分解により生じた小さなフ
ラグメント）を有する、より正確にはＥＡ　Ｃ４ｂ　３
ｂ　と呼ばれる赤血球は、Ｍ−Ｄ−Ｋａｚａｔｅｈｋｉ
ｎｅ　らによりＪ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅａｔ、６７．２
２３゜１９８１に記載の方法で感作；、７た羊赤血球（
ＥＡ）から分離した。

次に、ＥＡ　Ｃ４ｂ　３ｂ　Ｂｂ　Ｐと呼ばれる細胞か
ら″Ｃ３コンペルターゼ増強”部位（ｕｑ　＠１ｔｓ”
Ｃ３ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｒｌ
ｃｅ″′）を得るに充分量の安定化剤（ａｔａｂｌＨｇ
ａｕｔ　）　Ｂ　＋　Ｄ　＋　Ｐ　と蛋白質の存在Ｆに
この赤血球を置いた。この部位は、Ｃ３−Ｃ６−Ｃ７−
Ｃ８−Ｃ９血漿蛋白質からなる補体の活性化経路（ｌａ
　ｖｏｔｅ　ｅｆｆｅｃｔｒｉｅｅ　）を粘性化し、ヘ
モグロビンを放出する赤血球の溶血を増強する。

この懸濁液０．１−のフラクションを先に取シ、０１−
のＤＧＶＢ＋＋ノｑツファ（０，１５ｍＭのＣａ−１＋
、！：　０．５　ｍＭのＭ　ｇ＋＋　を含有するペロナ
ールノ々ツファ十０．１係ゼラチンを５饅デキストロー
スでｌＡＫ希釈し、０．１５　ｍＭのＣａ＋と０．５　
ｍＭのＭｇ＋１”を含有する）のみ又は本発明によるａ
［されたデキストランを適当量含有するＤＧｖＢ　）・
ツ７アーを〃口えた。

混合物を３０℃にて３０分間攪拌した。

ＧＶＢ−ＥＤＴＡパフ７７（０，０４ＭのＥＤＴＡを含
有する、ペロナルバッファ＋０１チゼラチン）で１／２
０　に希釈したラット血漿０．３−を加えた。

３７℃で６０分間攪拌し、形成されたＣ３コンペルター
ゼが現われた。

１．６Ｗｔの０．１５　Ｍ　１Ｎ・ａ’Ｃ７１を加えて
反応を中止させた。

試験管を遠心し、上置を４１２ｎｍで分光分析し溶解の
強さを測定した。

細胞当りの溶血性部位の数を１舞４した。

阻害活性 試験すべき生成物の阻害活性は、本発明によるｚａ　、
ｖデキストランが存在せずにコンペルターゼが形成され
たコントロールの試験管を対照としたコンペルターゼ形
成阻害率で示す。

この活性はコンペルターゼの形成を５０％阻害するのに
必要とされる（一定ｆ）の生成物の重量で表わす。

この活性はモチーフの関数で変化する。

ｍＩ記第１表、第２表に示された誘導体で得られた結果
を第３表に示し、生成物の化学組成と抗凝固活性見を示
している。

以下余白 この結果の検討からデキストラン誘導体の抗補体活性は
ヘパリンのものと同程度からある誘導体ではそれ以上で
あることが示される。

ｆＭ３図では、モチーフ旦を１０から９０係に変化させ
た率、モチーフｐを下記のように有する化学組成の関数
として、デキストラン誘導体の抗補体活性のｆ把を示し
た： ９−１２％　二　曲線− ４−５饅　：　曲線マ ２−　３憾　：　曲線Ｖ ０悌　：　・ ４ｏ−ｓｏｓのモチーフ、！！の塞では、阻書活性はモ
チーフ！２の率の増加と共に増加し、それ以上モチーフ
Ｂの率を増加させても抜書を引き起こさないことが判る
。モチーフ旦及びｐの関数としての抗補体活性の上昇は
抗凝固活性見の上昇と非常に近似していることにも注目
すべきである。

モチーフｐを少ししか含有しない誘導体は、その抗凝固
活性が非常に弱いとしても重要な抗補体活性を示すこと
に気付くだろう。

一方、モチーフｑのみが存在すると、どんな抗凝固効果
をも生じさせない時でさえ軽度の抗補体活性を埠〈こと
も認めたろう。

第４図には、誘導体の抗補体活性と抗凝固活性との間の
関係の研究によシ得た曲線が示され、モチーフＤを９〜
１２チ、４〜５俤、０チ及び２〜３係含有するデキスト
ランを各々■、マ、・及びで示す。

この図は強い抗補体活性と物い抗凝固活性とを有する生
成物が得られる可能性の証拠となる。

（以１余白）

【図面の簡単な説明】

ｍ１図は、モチーフセを１４％とモチーフ旦を４５％含
有する誘導体（曲線・）及びヘパリン（曲線◆）の関数
としてトロンビン時間の変化を示している。 第２８図は、モチーフＢの割合とモチーフＤの割合の関
数として、Ｍｐ　１０５００からのデキストラン誘導体
の抗凝血活性！の変化を示している。モチーフＤの割合
が１５±１のものは曲線・、１１±１では曲線ム、６±
１では曲線Δ及び２±１では曲線とする。 第２ｂ図は、モチーフＤの割合の関数として、モチーフ
Ｂの割合が４７．５±２．５％の使用デキストラン誘導
体の抗凝血活性二の変化を示す。 第３図は、モチーフＢの割合が１０〜９０％に変化し、
モチーフＤの割合が９〜１２チ（曲線−）、４〜５％（
曲線マ）、２〜３％（曲線Ｖ）及び０％（・）の化学組
成の関数としてデキストラン誘導体の抗補体活性の変化
を示す。 第４図は、モチーフＤを９〜１２％、４〜５％。 ０％及び２〜３％有するデキストラン誘導体の抗補体活
性と抗凝血活性との関係を示している。９〜１２％のも
のは−、４〜５％はマ、ｏチは・及び２〜３チはＶで示
す。 −手続ン市正内 １．事イ′１の表示　昭和５９年特Ｙ［願第２５３９６
４号２、発明の名称　デキストラン誘導体 ３、ン１１１Ｆをづる者　え 事件との関係　特許出願人 名　称　ショアイ・Ｊ−ス・アー ８、補正の内容 （３）委任状及び同訳文を別紙の通り補充する。 尚、同日イリにＣ本願に関づる優先権主張証明囚差出内
を提出致しましｌこ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１分子量が５０００ダルトンより大きいデキストラ
   ン誘導体であり、統計的に、 一構造　−〇−（ＣＨりｎ−Ｒ−ＣＯＯ−〔式中、Ｒは
   単結合または−Ｃ０−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎＩ−基（ｎ′
   は１〜７の数）を表わし、ｎは１〜１０の数である〕 に対応するカルボキシ官能性を有する残基で置換されて
   いる配糖体単位から構成された単位Ｂを少なくとも約３
   ５％以上特に４０％、−構造： 〔式中、Ｒ１は単結合、　ＣＨ２−基または−ＣＨ−Ｃ
   ）ｌｘ−基を表わし、Ｒ２は生理学上００− 許容し得る鉱物または有機塩のアニオン特に５Ｏｓ−基
   を表わし、ｎは上記定義のとおシである〕 の基を含む鎖によって置換されているＡ型の配糖体単位
   から構成されている単位、すなわち単位りを少なくとも
   約３％含有するデキストラン誘導体。 （式中、Ｒ１およびｎＩ′ｉ上記のとおシである）の残
   基で置換されている単位Ｃを含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載のデキストラン誘導体。 （３）　置換されていない単位Ａと単位Ｃの合計が全単
   位数の多くとも６０％であることを特徴とする特許請求
   の範囲第２項に記載のデキスト２ノ誘導体。 （４ン　鎖−０ＣＨ２−ＣＯＯ−１またはカルボキシエ
   チル、カルボキシゾロビルもしくはカルボキシブチル、
   すなわち−〇−（ＣＨｈ）ｎ−ＣＯＯ−基（ｎは夫々２
   ，３もしくは４に等しい）、または−０−（ＣＨｔ）１
   −ＣＯ−ＮＨ（Ｃｕｔ）ｎ／Ｃｏｏ−基（ｎ′は有利に
   ＃′ｉ４．５もしくけ７に等しい）によって置換されて
   いる単位Ｂを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項〜第３項のいずれかに記載のデキストラン誘導体。 （５）　構造： 〔式中、＆は上記定義のものであシ、有利に、＃′ｉ−
   ５０３−基を表わし、ｎは１〜４の数であシ、好ましく
   はｌに等しい〕 の鎖で置換されている単位りを含むことを特徴とする特
   許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のデキス
   トラン誘導体。 （６）次式の単位Ａ、Ｂ、Ｃお！びＤ：０３Ｎｍ Ａ　Ｂ　ＣＤ を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の誘導体。 （７）特許請求の範囲第１項に記載のデキストラン誘導
   体の製法であって、 一デキスト２ンを式： ％式％ （式中、Ｘけグルコシル単位の一〇Ｈ基とグルコキシル
   結合を形成し得、ｂ反応基を表わす）の誘導体と反応さ
   せて、単位Ｂを生成し、一単位ＡおよびＢを含有するデ
   キストランを（式中、Ｒ１は上記定義のとおりである）
   の誘導体と反応させて、単位Ｂの置換鎖を形成している
   基に置換アリール基をアミド架橋により固定し、こうし
   て連鎖上に単位Ｃを導入し、一単位Ｃを塩化して単ｔＤ
   を形成し、 −場合により、デキストラン誘導体を分画して分子量が
   ５０００未満の誘導体を除去することからなる方法。 （８）特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載
   の誘導体から製造される代用血漿または増量剤。