JPS60141288A - 耐熱性β−ガラクトシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアスペルギルス・オリーゼに属する微生物を利
用する耐熱性β−ガラクトシダーゼの製造法に関する。

β−ガラクトシダーゼは乳糖をガラクトースとグルコー
スに加水分解する酵素であり、乳製品中の乳糖を分解す
る酵素として又は乳糖不耐症による下痢を治療するため
の医薬品として広く利用されている。

特に食品工業に於ける牛乳の処理の場合は雑菌汚染を避
けるため、高温で処理するのが好ましく、安価な耐熱性
β−ガラクトシダーゼの提供が切望されているところで
ある。従来市販されているアスペルギルス・オリーゼ産
生のβ−ガラクトシダーゼは６０℃、　３０分間の熱処
理で殆んど完全に失活するものと４０〜５０％の残存活
性を示すものが知られているが、これらは耐熱性の点で
充分とは言えない。

本発明者等は、耐熱性のより優れたβ−ガラクトシダー
ゼを創製する目的で、アスペルギルス・オリーゼの培養
条件を種々検討した。

まず始めに９本発明者等は、アスペルギルス・オリーゼ
を培養するための培地組成を種々変えて、そこに産生じ
たβ−ガラクトシダーゼの耐熱性を測定すると同時に、
アルカリ性プロテアーゼ活性を測定した結果１両者の間
に極めて密接な相関性があり、培養物のアルカリ性プロ
テアーゼ活性の低い方が、β−ガラクトシダーゼの耐熱
性が著るしく優れていることを見出した。

次に９本発明者等は２種々の方法で、アルカリ性プロテ
アーゼ活性を抑制した培地を用いて。

アスペルギルス・オリーゼを培養し、いづれの場合もそ
こに産生されたβ−ガラクトシダーゼは耐熱性が優れて
いることを確認し９本発明を完成した。

即ち本発明は「アスペルギルス・オリーゼに属テるβ−
ガラクトシダーゼ生産菌をアルカリ性プロテアーゼ活性
の抑制された培地中で培養することを特徴とする耐熱性
β−ガラクトシダーゼの製造法」に関するものである。

本発明に利用するアスペルギルス・オリーゼに属するβ
−ガラクトシダーゼ生産菌は、特に限定されるものでは
ないが、耐熱性の特に優れた酵素を得るためには、当然
のこととして、微生物自体耐熱性β−ガラクトシダーゼ
産生能の高いものを利用する方が有利である。従来、耐
熱性β−ガラクトシダーゼ産生菌として、アスペルギル
ス９オリーゼＹ−２２の変異株ＹＵ−２２Ｂが報告され
ている。〔ジャーナル・オブ・ファーメンティジョン・
テクノロジー第５８巻第１１５−１２２頁（１９８０年
）〕 本発明者等は、このＹＵ−２２Ｂ　に匹敵スル優れた耐
熱性を示すβ−ガラクトシダーゼを産生する野生株をわ
かもと製薬株式会社相模大井工場の敷地内の土壌から分
離し、アスペルギルス・オリーゼに属する菌株であるこ
とを確認し。

アスペルギルス・オリーゼＬ−８３と命名し、工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した。

寄託番号は微工研菌寄第　７３７Ｔ号である。

さらに本発明者等は、Ｌ−８３株に紫外線を照射して変
異株を作り、アルカリ性プロテアーゼ産性能の低い株を
分離して、純粋培養し、この菌株をとりあえず「アスペ
ルギルス・オリーゼＵ−８」と命名し、これも微生物工
業技術研究所に寄託した。

寄託番号は微工研菌寄第　７３７ｇ号である。

次に、アスペルギルス・オリーゼＬ−８３及びＵ−８の
菌学的性質を説明する。

〔ｌ〕　アスペルギルス・オリーゼＬ−８３株の菌学的
性質 使用菌株：アスペルギルス・オリーセＬ８３上記の菌株
の麦芽エキス寒天培地で培養して得た分生胞子の１白金
耳量な所定の培地に接種した。

使用培地： 麦芽エキス寒天培地、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、
ツアペック寒天培地の３種類を直径９ｚｗ　厚さ１．５
ｃｒｎのプラスチックシャーレに２５−ずつ分注して用
いた。

■、形態的性質 ３０℃、８７時間培養して観察した結果を記載する。

（１）麦芽エキス寒天培地： 生育は旺盛。淡黄褐色の分生胞子を全面につけたビロー
ド状の１〜２ｍｙｎの白色の気菌糸を豊富に着生する。

可溶性色素は認められない。

（２）　バレイショ・ブドウ糖寒天培地：生育は旺盛。

麦芽エキス寒天培養と同程度の生育状態で、菌叢全面に
１〜２制の気菌糸が密生してビロード状をなし、中心部
は２〜３ｍ＋盛り上がる。分生胞子は緑褐色である。

菌叢の裏面は平滑で白色である。可溶性色素の産生は認
められない。

（３）　ツアペック寒天培地： 生育は良好であるが、麦芽エキス寒天培養より劣る。分
生胞子は黄色であり、菌叢の中心部に着色し、外縁は白
色の短い（０，５〜１覇）気菌糸が密生し、やや隆起し
ている。分生胞子をつけた気菌糸は１〜２椙の長さであ
る。

裏面は平滑で淡黄色をしているが、可溶性色素は認めら
れない。

■９分　離 本菌株の分離源は、わかもと製薬相模大井工場の敷地（
神奈川県足柄上郡大井町金手３７８）より採取した土壌
より分離したものである。

■、顕微鏡観察 麦芽エキス寒天平板培養（３０℃、８７時間）した菌に
ついて観察した結果を述べる。

分生子柄の先端はフラスコ形で巾２５〜５０μｍの頂の
うとなり、頂のうは多数のトラクリ形の測子（長さ１０
〜２０μｍ×中５〜８μｍ）を着生（１段）シ、その先
端から６〜８μｍの分生胞子を生ずる。分生胞子の表面
は平滑である。分生子柄（長さ３００〜１０００μｍ前
後×巾１０〜２０μｍ）の表面は粗であり、特に項のう
に近い部分で著しい。

被子器は形成しない。　・ ■、生理的性質 （１）最適生育条件： 生育に対する最適ｐＨは４〜１１で、最適温度は２５〜
３５℃であり、好気性である。

（２）生育しうる条件： ｐＨ３〜１２の広いｐｎ領域で、温度は１５〜４０℃で
生育可能である。

前記の菌学的諸性質の観察の結果に基づいてラッパート
フェンネル著、ザジイーナス　アスペルギルス３５７〜
４０４頁（１９６５年）及び食品衛生誌、１３巻１〜１
１頁（１９７２年）に記載の分類法に従って比較検討し
た。その結果９本菌株は。

アスペルギルス・オリーゼと一致する性質をもつことか
らアスペルギルス・オリーゼと同定した。

〔■〕　アスペルギルス・オリーゼＵ−８株の菌学的性
質 使用菌株：アスペルギルスーオリーゼＵ−８上記の菌株
の麦芽エキス寒天培地で培養して得た分生胞子の１白金
耳量な所定の培地に接種した。

使用培地： アスペルギルス・オリーゼＬ−８３株の場合と同様の培
地を使用した。

■、形態的性質 ３０℃、８７時間培養して観察した結果を記載する。

（１）麦芽エキス寒天培地： 生育は良好。白色の分生胞子を全面につけたビロード状
の１〜２間の白色の気菌糸な豊富に着生する。可溶性色
素は認められない。

（２）　バレイショ・ブドウ糖寒天培地：生育は良好。

麦芽エキス寒天培養と同程度の生育状態で、菌叢の全面
に１〜２ｍｍの気菌糸が密生してビロード状をなし、中
心部は２〜３ｍ盛り上がる。分生胞子は淡黄色である。

菌叢の裏面は平滑で白色である。可溶性色素の産生は認
められない。

（３）　ツアペック寒天培地： 生育はやや良好であるけれども、麦芽エキス寒天培養よ
り劣る。分生胞子は白色である。

巨大集落の特徴は、キャビィティ）　（ＣａｐｉＬａｔ
ｅ　）状である。気菌糸は極めて短かい（０１〜０．５
ｍｍ）。

裏面は平滑で、淡黄色をしているが、可溶性色素は認め
られない。

１１、分　離 アスペルギルス・オリーゼＬ−８３株の分生胞子を紫外
線照射して変異させて得た株より分離した。

■・　顕微鏡観察 麦芽エキス寒天平板培１（３０℃、８７時間）した菌に
ついて観察した結果を述べる。

分生子柄の先端はフラスコ形で、巾１０〜１５μｍの頂
のうとなり、頂のうはトラクリ形の測子（長さ１０〜２
０μｍ×巾５〜８μｍ）を比較的少数着生（１段）シ、
その先端から６〜具μ−の分生胞子を生じる。頂のうは
デホームド型（ｄｅｆｏｒｍｅｄ　ｔｙｐｅ）のものも
見られる。分生胞子の表面は平滑である。分生子柄・（
長さ１５０〜５００μｍ前後×巾７〜１０μｍ）の表面
はやや粗である。被子器は形成しない。

■、生理的性質 （１）最適生育条件： 生育に対する最適ｐＨは４〜１１で、最適温度は２５〜
３５℃であり好気性である。

（２）生育しうる条件 ｐＨ３〜１２の広い一領域で、温度は１５〜４０１？。

で生育可能である。

本発明は、これらのアスペルギルス・オリ−ゼに属する
β−ガラクトシダーゼ生産菌をアルカリ性プロテアーゼ
活性の抑制された培地中で培養することを特徴とする耐
熱性β−ガラクトシダーゼの製造法に関するものである
。培地中のアルカリ性プロテアーゼ活性を抑制する方法
としては１例えば次の方法が有効である。

■　培地にアルカリ性プロテアーゼ阻害剤を添加するこ
と。

■　培地に酸性側緩衝剤と窒素源物質とを併用添加する
こと。

■　アルカリ性プロテアーゼ低力価変異株を利用するこ
と。

上記の方法は単独で採用しても効果があるが。

それらを組合わせて採用する方がより効果的である。

アルカリ性プロテアーゼ阻害剤としては７例えばポテト
エキスやジイソブロピルホヌホフロリデート等、公知の
阻害剤が適宜利用出来る。

酸性側緩衝剤と窒素源物質とを併用するため、に最も都
合の良いのは、リン酸１アンモニウムやクエン酸２アン
モニウムのように両成分を併せ持つ物質である。これら
は９通常皺１２当り４０■以上好ましくは５０〜１５０
Ｆ＃添加するのが好ましい。

勿論、酸性側緩衝剤と窒素源物質は、それぞれ独立した
成分を適宜組合わせて利用することが出来る。

酸性側緩衝剤としては２例えば、リン酸塩。

クエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩１等無機及び有機の弱酸
塩が利用出来る。

窒素源物質としては、無機及び有機の窒素化合物を利用
することが出来る。その代表例としては９例えばペプト
ン、肉エキス、アミノ酸。

尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。これらの添
加量は、岐Ｉｆ当り、尿素の場合１３７ｎ９程度で充分
であるが、その他の場合は一般に約５０〜１５（１９程
度が適当である。

次に本発明の効果を試験例により説明する。

試験例１．　β−ガラクトシダーゼの耐熱性【二及番１
す培地のアルカリ性プロテアーゼ活性の影響 （イ）試験方法 ９１．５　ｆと水２．５−を含む滅菌培地に第１表で示
す成分を添加し、アスベルギルヌ・オリーゼＬ−８３の
分生胞子を接種し、３０℃、　５０時間培養した。

培養物に水１５−を加え、３０℃、１時間激しく振盪し
て酵素を抽出し、Ｐ液を得た。残査は。

マツキールベイン緩衝液（ｐＨ４，５）５−を加えて充
分均質に同じくした後１５０００回転１０分間遠心分離
して上澄液を得、これをｒ過（東洋沢紙扁４）して先き
のＦ液に合わせ酵素活性測定用試料として用いた。

各種組成の培地での培養物より上述のようにして得たそ
れぞれの抽出液について、β−ガラクトシダーゼ活性と
アルカリ性プロテアーゼ活性を測定し、さらにそれら抽
出液をｐＨ４，５で６０℃。

３０分間加熱した後のβ−ガラクトシダーゼの残存活性
を測定し、その活性残存率を算出して。

β−ガラクトシダーゼの耐熱性を評価した。

第１表 本試験の結果は、下記第２表に示す通りである。表中に
示された成績から明らがなように。

培地のアルカリ性プロテアーゼ活性が低い方がβ−ガラ
クトシダーゼの耐熱性が優れていた。

第２表 試験例２．　β−ガラクトシダーゼの耐熱性に及ぼすア
ルカリ性プロテアーゼ阻害剤添加の影響 （イ）試験方法 ＠１．ｓｔ、−ｙ−ｙステイープリカー７５ｍ９．水２
．５−を含む滅菌固体培地にアスペルギルス・オリ−ゼ
ム−８３株の分生胞子を接種し、３０℃、２０時間培養
した後にアルカリプロテアーゼ阻害剤として、２ｏｏｍ
ｔ２／−濃度のポテトエキス溶液を５０μｔ。

１００μｔ、　２５０μを及び５００μｔを添加し、そ
れぞれの対照として同量の水を添加した培養物を調製し
た。

それぞれの培養物を引続き、３０℃、３０時間培養した
後、試験例１と同様な方法で、β−ガラクトシダーゼの
耐熱性とアルカリ性プロテアーゼ活性を測定した。

（ロ）　試験結果 本試験の結果は第３表に示す通りである。

第　３　表 第３表の成績から明らかなように、ポテトエキスを培地
に添加して、培地のアルカリ性プロテアーゼ活性を阻害
することにより、そこに産生ずるβ−ガラクトシダーゼ
の耐熱性は著るしく向上した。

次に、アスペルギルス・オリ−ゼム−８３株とこの株に
紫外線照射して得た低アルカリ性プロテアーゼ活性の変
異株、アスペルギルス・オリーゼＵ−８株を利用し９両
者を通常の培地で培養した場合と９本発明方法による培
養を行なった場合について、産生ずる酵素を比較し、微
生物の種類に係りなく本発明方法が有効であることを説
明する。

試験例３゜ 皺１５２七水２５ゴを含む固体培地（通常培地）とその
培地にリン酸１アンモニウム１１５■を添加した培地（
本発明培地）にアスペルギルス・オリ−ゼム−８３株と
アスベルギルヌ°オリーゼＵ−８株の分生胞子をそれぞ
れ接種し、３０ｔｌ：。

６０時間静置培養した。

試験例１と同様にして酵素を培養物より抽出し、β−ガ
ラクトシダーゼの耐熱性と、アルカリ性プロテアーゼカ
価を測定した。

本試験の結果は第４表に示す通りである。

第　４　表 実施例１゜ 蚊４５ｔ、水７．５ｍｇ　、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４，０
，５９（皺に対し１１．１％）よりなる滅菌培地にアス
ペルギルス・オリ−ゼム−８３株の分生胞子を接種し、
３０℃、６０時間静置培養した。

培養物に６０−のマツキールパイン緩衝液（ｐＨ４，５
）を加えて２時間振盪した後、１夜４℃で放置した。

この上澄液から５０〜９５チ硫安処理により、粗酵素を
沈殿させ、これを再びマツキールパイン緩衝液（ｐＨ４
，５）に懸濁させ、その懸濁液の酵素力価及び蛋白質の
定量を行った。

その結果、皺１ｇ当りのβ−ガラクトシダーゼ産生量は
３８．０単位で、粗蛋白の産生量は２７．６吟、従って
比活性は１４３８Ｕ／ｎ９蛋白であった。

このβ−ガラクトシダーゼは、　ｐ）！４．５．６０℃
。

３０分の加熱処理で６８．９　％の残存力価を示し、著
るしく耐熱性が優れていた。

比較のため、（ＮＨ，）Ｈ２ｐ０４を０．０３Ｆ（蚊に
対し０．６７％）使用するほかは上記と同様に培養して
。

同様な試験を行った。その結果、β−ガラクトシダーゼ
の比活性（１，１９Ｕ／ｍ９蛋白）及び皺１２当りの産
生量（３６，９単位）は類似した値を示したが、耐熱性
（３１，３％）が約十の値を示した。

以上の試験例及び実施例は本発明を説明するためのもの
で１本発明はアスペルギルス・オリーゼに属する微生物
を培養してβ−ガラクトシダーゼを産生させる場合、そ
の培地のアルカリ性プロテアーゼ活性を抑制すれば、そ
こに産生ずるβ−ガラクトシダーゼの耐熱性が著るしく
高くなるという、いわば基本発明に関するものである。

培地中のアルカリ性プロテアーゼ活性を抑制するための
具体的方法は、上記試験例及び実施例に限定されるもの
でなく、適宜公知方法を組合わせて当業者が行い得るも
のである。

なお、前記の試験例及び実施例に於いて、β−ガラクト
シダーゼカ価、アルカリ性プロテアーゼ活性、β−ガラ
クトシダーゼの耐熱性及び蛋白質定量値はそれぞれ下記
の方法による測定値で示した。

（β−ガラクトシダーゼカ価の測定法）ＯＮＰＧ基質法
によった。

即ち、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトビラノン
ド（ＯＮＰＧ）５．７ミリモルを含有する基質液３．５
ｍｌ　（ｐＨ４，５）に酵素液０．５ｆｎＩ！を混合し
、３０℃で１０分反応後、１モル炭酸す）リウム液１−
を加え反応を停止させた。この溶液中に生成したＯ−二
トロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度を測定し
てめた。１分間に１μモルの０ＮＰＧを加水分解する酵
素量を１単位（Ｕ）とした。

（アルカリ性プロテアーゼ活性の測定法）プロテアーゼ
活性測定はアンソン−萩原改変法におおむね従った。即
ち、２０ミリモルのＥＤＴＡを含む酵素液０．５ｍ　（
ｐＨ７，０）を４０℃、１５分間前処理して中性プロテ
アーゼを失活させた後。

２．５ｍｊ！の０．６％（Ｗ／Ｖ）礼装カゼイン、５０
ミリモルリン酸２ナトリウム溶液（ｐＨ７，０）を混合
し、３０℃で１０分反応後、　２．５ｍｌの０．１１モ
ルトリクロロ酢酸、０．２２モル酢酸ナトリウム、及び
０．３３モル酢酸混合液を加えて反応を停止させた。３
０℃、３０分放置後１反応液を沢過した。沢液中に生成
したチロシンに相当する非蛋白性のフォリン試薬呈色物
の増加を定量した。１分間に反応液１−中１μモルの生
成チロシン量をもって１単位とした。

（β−ガラクトシダーゼの耐熱性試験法）ｐＨ４，５，
６０℃で３０分間処理した後、３０℃で基質を分解しう
る残存活性割合（係）でめた。

（蛋白質の定量） ローリ−法によった。

特許出願人 わかもと製薬株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アスペルギルス・オリーゼに属するβ−ガラクトシダー
   ゼ生産菌をアルカリ性プロテアーゼ活性の抑制された培
   地中で培養することを特徴とする耐熱性β−ガラクトシ
   ダーゼの製造法。