JPS5863388A - ホスホリパ−ゼｄの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるホスホリパーゼＤの製造法に関す
るものである。すなわち一本発明はノカルディオプシス
（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　）属に属するホスホリパ
ーゼＤ生産菌を培地に培養し一培養物からホスホリパー
ゼＤを採取することを特徴とするホスホリパーゼＤの製
造法である。

ホスホリパーゼＤ　（Ｅ、Ｃ，３，）、ダ、ダ）は−グ
リセロ燐脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結合を
分解し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離する酵素であ
る。またホスホリパーゼＤは、エタノール、クリセロー
ル、エタノールアミン等のアルコール基を有する化合物
の共存下で一グリセロ燐脂質に作用させると、ホスファ
チジン酸をアルコール基へ転移することも知られている
。

ホスホリパーゼＤは、キャベツ、ニンジン等の植物界に
広く介在することが古くより知られ、主としてキャベツ
の組織中よシ抽出して製造されている。又、最近では一
微生物によるホスホリパーゼＤの製造方法として、スト
レプトマイセス属（特公昭１２−３９９１ｇ号公報）や
、ミクロモノスポラ属（特開昭ｔｉｔ−ＱＩＩ０９１を
号公報）に属する放線菌を用い１発酵法により製造する
方法が知られている。

ホスホＩＪ　ハーゼＤは、燐脂質の代謝に関連する研究
用試薬や血清中に含まれるリン脂質の定量用試薬等に利
用される他−各種リン脂質よりのホスファチジン酸製造
にも利用出来る。

本発明者等は、自然界の土壌中より広く微生物を分離し
、ホスホリパーゼＤを生産する菌株を検索した。その結
果−東京都八王子市の土壌よシ分離した菌株（ノカルデ
ィオプシス属Ｎｏ　７７　ｑと称する）を培地に培養す
ると一培地中にグリセロ燐脂質に作用してホスファチジ
ン酸と塩基とを遊離する作用がある酵素が生成されるこ
とを確認し。

本菌がホスホ−リパーゼＤを生産することを見出した。

またこの酵素を、エタノール、ンルビトール。

エタノールアミン、グリセロール等の適当なアルコール
基を有する化合物の共存下で、グリセロ燐脂質に作用さ
せた場合、ホスファチジン酸をアルコール基へ転移する
ことも認められた。

上記菌株の歯学的性状は次に示す通りである。

（ａ）形態 グルコースアスパラギン寒天、グリセリンアスパラギン
寒天、酵母麦芽寒天培地等では良好に−また澱粉無機塩
培地では中程度に生育して気菌糸の集落を着生する。

胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察時期により
若干変化するが、おおむね白色ないし灰白色から明るい
灰色を呈する。

シー−り示＜硝酸塩寒天、栄養寒天、オートミール寒天
培地では気菌糸を着生しないか一貧弱にしか着生しない
。

寒天培地上に生育させた本菌株を顕微鏡で観察すると、
気菌糸はθ、ｊ〜θ１ｇμで直線状でゆるく波形又は屈
曲を混じえなから分枝なもって長く伸び、気菌糸全体は
数ｌｏから１００ケ以上のすべて胞子からなる連鎖によ
って形成されている。

胞子の大きさハ０　、　ｊ−０、ｇ　Ｘ　Ｏ、？×ｌ、
０μで、はぼ短円筒形で大きさはやや不規則である。

基土菌糸は巾ｏ、Ｊ−一〇、ｔμで分枝なもって伸長し
、寒天培地上ではかならずしも分断しないが、液体培養
することによりほとんどの場合細が〈分断する。

しかし遊走胞子、胞子のり、菌核等は形成されない。

（ｂ）各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は主としてイー・ピー・シャー
リング（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｅｔｅｒｉ
ｏｌ。

１６巻、３１３〜３４ｔＯ，７９６６年）の方法にした
がって行った。

色調は「色の標準」（財団法人日本色彩研究所。

／９４４’年）を用いて決定し一色相名とともに括弧内
に色相名、彩度番号、明度番号の順に色相記号を記入し
た。

培養はコｊＣで行い、最も生育の旺盛な２〜３週間目の
各培地上における観察結果を第１表に示した。但し第１
表中、生育項目に記載した基生菌糸表面の色は胞子着生
前の培養−週間目における観察結果を示しており、胞子
着生が早く基生菌糸表面の色の判定困難な培地について
は、記載していない。

（ｃ）生理的性質 ■生育温度：ｊＣ〜３０Ｃ附近で生育し、ユＯ〜３０Ｃ
で最もよく生育する。

■ゼラチンの液化：液化しない（グルコース・ペプトン
・ゼラチン培地上、ユｊＣ，３週間培養）。

■スターチの加水分解：分解する（スターチ寒天培地上
、２！ｔ’ｌ：：、３週間培養）。

■脱脂牛乳の凝固−ペプトン化：凝固、ペプトン化共に
せず（３０Ｃ，３〜ｑ週間培養）。

■メラニン様色素の生成：ペプトンイースト鉄寒天、チ
ロシン寒天で生成する（コｊＣ，−〜１日間）０ （ｄ）炭素源の同化性（３０７：、１０〜）６日培養）
Ｌ−アラビノース　−　　　　シュークロース　−Ｄ−
キシロース　　−　　　　イノシトール　−Ｄ−グルコ
ース　　＋　　　　Ｌ−ラムラース　−Ｄ−フラクトー
ス　−　　　　ラフィノース　−（ｅ）細胞の化学分析 本菌株のディアミノピメリン酸はメソ型であり、ヒドロ
キシディアミノピメリン酸を含まない。

細胞壁の糖組成は一アラビノース、キシロース。

マデュロースーラムノース等を有せず、ガラクトース、
マンノース等を有する。又本菌株はノカルドミコール酸
を有しない。

以上の分析結果について−Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆｔｈｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂｅ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第ｇ版、１１７頁〜ｔｊｇ頁（ｉ
ｑ７ａ年）や、レシモパリエ（Ｉｎｔｅｒ、Ｊ、　Ｓｙ
ｓｔｅｍ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　２０巻、ａ、ｙｓ
頁〜＃＜ＺＪ頁、）９７Ｑ年）−メイヤー（Ｉｎｔ、　
Ｊ。

５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ユ６巻、４’ｆｆ７
頁〜４Ｉ９３頁１９７６年）らの分類法にしたがって判
定すると。

本望は細胞壁類型（ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｔｙｐｅ　）
　ＩＩＩ型、糖組成類型（ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｓｕｇ
ａｒ　ｐａｔｔｅｒｎ　）　Ｃ型となる０ 以上本望は、細胞壁類型がＩＩＩ　、糖組成類型がＣで
あることから、レシエバリエの分類法によればダンンビ
レイタイプのアクチノマデューラ属。

サーモアクチノミセス属、アクチノビイフイダス属、ゲ
オダーマトフイラス属のいづれかに属する。

しかじ本望は−その形態において気菌糸のすべてが胞子
の長い連鎖から成り一基生菌糸を細かく分断するが、内
生胞子−遊走胞子、胞子のうが見い出されないことより
、ダソンビレイクイプのアクチノマデューラ属（Ｇｅｎ
ｕｓ　Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａｄａｓｓｏｎｖｉｌｌ
ｅｉ　ｔｙｐｅ　）に同定するのが分類上妥当イオプシ
ス属に統合され一ノカルディオプシス属の名称で取り扱
われることが一般的である。

そこで本望は一ノカルディオプシス属Ｎ０７７９（Ｇｅ
ｎｕｓ　Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　８ｐ　Ｎｏ　７７
９　）と称することにした。そして本望は工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されており、その受託番号は
「微工研閑寄第６ノ３３号」である０ 本発明における使用菌としては、ノカルディオプシス属
Ｎ０７７９および本菌株を変異処理した変異株だけでな
く、ノカルディオプシス属（旧属名アクチノマデューラ
　ダソンビレイクイプ属）に属しホスホリパーゼＤを生
産する菌であれば全て用いることが出来る。

本発明を実施するに当り−その培養形態としては、液体
培養一固体培養いづれも用いることが出来るが一工業的
には深部通気攪拌培養を行うのが有利である。

また使用する培養源としては一一般に微生物培養に用い
られる炭素源、窒素源、無機塩−及びその他の微量栄養
素の他、ノカルディオプシス属に属する微生物の利用す
ることの出来る栄養源であれば−すべて使用することが
出来る。

培地の炭素源としては１例えばブドウ糖、果糖。

シヨ糖−乳糖一澱粉、グリセリン、デキストリン。

合せて用いられる。

窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源いづれでも利
用可能であり一無機窒素源としては１例えば硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、尿素。

硝酸ソτダー燐酸１アンモニウム、燐酸２アンモニウム
、塩化アンモニウム等が挙げられ、また有機窒素源とし
ては、大豆、米、とうもろこし、綿実、菜種−小麦など
の粉−糠一説脂粕をはじめ一コンスチーブリカー、ペプ
トン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が
用いられる。

無機塩及び微量栄養素としては、例えばリン酸−マグネ
シウム、カリウム、鉄、アルミニウム、カルシウム、−
７ンガンー亜鉛等の塩類の他、ビタミン、非イオン界面
活性剤、消泡剤等菌の生育やホスホリパーゼＤの生産を
促進する物であれば一必要に応じて使用出来る。

培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌が発育し
、ホスホリパーゼＤを生産する温度範囲で適宜変更出来
るが、特に好ましいのは一〇〜３ＩＣである。

培養時間は条件によシ異なるが、ホスホリパーゼＤが最
高生成量に達するまで培養すればよい。

液体培養の場合は通常ｌ〜３日程臀である０培養物中に
生成したホスホリパーゼＤは、液内培養では主として培
養液中に溶けているので、培養終了液より固形物を１別
して得られる培養Ｐ液よりホスホリパーゼＤを採取する
。

培養ｒ液中よりホスホリパーゼＤを採取するに当っては
１通常酵素精輿に用いられるあらゆる方法が使用出来る
。例えば硫安１食塩等による塩析。

アセトン、エタノール、メタノール等のｌ［剤による跣
澱−透析−イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマ
トグラフィー、ゲルｅ過、吸着剤−等電点沈澱等の方法
が使用出来る。さらにこれ等の方法を適当に組み合せる
ことによって、ホスホリパーゼＤの精製効果が上る場合
には１組合せて行うことが出来る。

これ等の方法により得られる酵素は、安定化剤として各
種塩類、糖質、蛋白質−脂質−界面活性剤等を加えるか
、もしくは加えることなく減圧濃縮、減圧乾燥、凍結乾
燥等の方法により液状又は固形のホスホリパーゼＤにす
ることが出来る。

ホスホリパーゼＤｎｌ！素活性測定法は、基質グリセロ
燐脂質に作用してリン酸と含窒素塩基とのエステル結合
を分解して生ずる塩基の量を測定して求める。ホスホリ
パーゼＤの活性は、特に記載性をｌＯＯとした時の相対
活性は一すゾレシチンｑ、９．スフィンゴミエリン０．
３であった。

■至適ｐＨ 力価測定法において用いる緩衝液の代りにｐＨ３，０〜
１１．Ｑでは蟻酸・蟻酸ソーダ緩衝液、ｐＨａ　、　ｏ
−ｚ　、ｔでは酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、ｐＨｊ、５〜
ｇ、ｊではトリスΦマレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、ｐ
Ｈ７，０〜ｑ、ｏではトリス争塩酸緩衝液、ｐＨ９，０
−１０，０ではグリシン拳苛性ソーダ緩衝液を用いてホ
スホリパーゼＤの活性ヲ測定し、至適ｐＨを求めた。ま
た同測定法で用いる蒸溜水０．ｌｊｍｔの代りに’　４
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−Ｚｏ。

（和光紬薬）水溶液ｏ、１ｓｒｕｌを用いた時の至適ｐ
Ｈについても求めた。

その結果は第１図に示す通りで、蒸留水を用いた場合の
至適ｐＨは４．ｊ〜７．０付近であり、／４Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ　−／　ｏ　ｏ水溶液を用いた場合の至適ｐＨは
ｓ、ｏ付近に認められた。

■至適温度 力価測定法において１反応源度条件をＩＱ、−〇。

＋２３．３７，４０．　　！　０．ｊ、ｔ、６０，７０
゜ｇｏおよびｑｏＣで酵素活性を測定した。その結果は
第２図に示す通りであって、至適温度は６０ＣからざＯ
Ｃの範囲であると認められる。

■ｐＨ安定性 酵素溶液０，１〜ｇにＯｌ−ｍＡのＱ、１Ｍの各種緩衝
液、すなわちｐＨ３、０〜３．ｊではグリシン・塩酸緩
衝液、ｐＨＪ、ｊ〜７．０では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液
、ｐＨ１，０〜ｇ、ＯではトリスΦマレイン酸・苛性ソ
ーダ緩衝液、　ＰＨ７、０〜９．０ではトリス・塩酸緩
衝液、ｐＨ９，０〜９．！ではＭトリス・塩酸緩衝液（
ｐＨ７，コ）／、−ｍｂを加え、ＰＲを７．０〜２．３
とした。この溶液Ｏ０７ｍＡを用い、力価測定法に従っ
て力価を測定し、安定ｐＨ範囲を調べた結禾、第３図に
示した通り本酵素の特に安定なｐＨ範囲はａ、Ｏ〜７．
０であると認められた。

また力価測定法で用いる蒸溜水０．ｌｊｍｅの代りに’
　４Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−ｔ　ｏ　ｏ水溶液０．ｉｒ
ｍｌを用いる他は一上記と同様に操作してｐＨ安定範囲
を調べたが、結果は第３図と殆んど変らな２１）λつた
。

■熱安定性 酵素溶液０．ｉｍｔｒに０　、　／　Ｍ　）、ＩＪスス
−酸緩衝液（ｐＨ７，２）ｌｌｒｎｔを加え、コ０，３
０．３？。

ａｏ　、ｔｏ　、ｔｏおよびｔＩＣに３０分間放置した
後−残存する酵素活性を測定した０その結果＆ま第４図
に示す通りで一３ＯＣで３０分の熱処理では殆んど失活
せず、ｌＯＯで３０分の熱処理でｇ。

幅の活性が残存したＯ ■各種物質による影響 力価測定法において（：：ａＣ１ｔ水溶液の代りに各種
物質の水溶液を０．Ｏｊｍｌ加え、酵素反応系中で／ｍ
Ｍ濃度に成るようにして活性を濱１１定した。その結果
は水添加の時の活性を１００とし、相対活性として賦活
作用のあった物＆末１例えばＡｌＣｌ５−ＣｕＳＯ４，
ＺｎＳＯ４，Ｃｏａｌ、、　ＣａＣｌ２．　ＦｅＣ１，
、ＦｅＳＯ４゜ＭｇＣ１ｔ　−５ｎＣ１ｚ−デオキシコ
ール酸ソーダ、　ＴｒｉｔｏｎＸ　−／　００等であり
、一方阻害作用のあったものとしてはドデシル硫酸ソー
ダーセチルビ１」ジニウムクロライド等である。

■力価の測定法 前述したとおりである。

■精製方法 前述したとおりであり、その具体例は実施例３に記載の
とおりである。

［相］等電点 ａｏｇｊｔｈＯ，’Ｃアンホライン電気泳動法により測
定） 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが１本発
明はこれによって制限されるもので＆まないＯ 実施例　１ 脱脂小麦胚芽ＩＱｆに硫安０．ｌｌ−、ペプトン０．１
？、及び水ざｍｂを１００ｍＩＶ容三角フラスコニ入れ
、ｌユノＣで１３分間蒸気殺菌後、ノカルディオプシス
属Ｎ０７７９の胞子水懸濁液−ｍｂを接種した。そして
培養温度コｊＣで静置３０日間培養した０ 培養終了後、ｔ□ｏｍｌの水を加えてホスホリパーゼＤ
を抽出した後−固形物をｒ別し、Ｐ液中のホスホリパー
ゼＤの活性を測定した。その結果は３．１ｙ／ｍｌであ
った。

実施例　２ シード培地として澱粉ｌ憾”　（ＮＨ＊）ＨｚＰＯ４ｏ
、２ｓ弧、ペプトンθ、コｒ　％、　Ｋ２ＨＰＯ４θ、
λ４　、ＭｇＳＯ４０，０１４を含む水溶液培地（ｐＨ
４，ｇ）ノθＯｍ６を１００ｍｂ坂ロフラスコに入れ一
蒸気殺菌後、ノカルディオプシス属ＮＱ７７９菌株の胞
子を一白金耳接種し、培養温度、７（７Ｃ，ｌユＯ回転
回転子一日間振盪培養しシード培養液を得た。

つぎに本培地すなわちグルコース１．０％、コーンスチ
ープリカー７．θ優−ペプトンθ、ｊｌｌ。

粉末酵母エキスＯ０）憾、１％ＮＯ３０、、を幅−Ｋ２
ＨＰＯ４０、コ憾−ＭｇＳＯ，・７Ｈ２００，０ノ憾か
らなる培地（ｐＨ６，０）ｒＯｍｌをｚｏｏｍＡ容坂ロ
フラスコに入れ、／ＪＩＣで７０分蒸気殺菌後、シード
培養液ｊｍ６を移植し、２ｊＣで２日間培養した〇培養
後−遠心分離して固形物を除去し、培養ｒ液ｊＯｍＡ（
ｊ、コｕ　／　ａｔ　）を得た。これに硫安ユｕ　、７
ｆを攪拌しながら徐々に加えてホスホリパーゼＤを沈澱
させた。遠心分離により沈澱を集め、０．０コＭトリス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７，コ）に溶解してホスホリパーゼ
Ｄ活性を測定した。

この時の培養ｒ液に対するホスホリパーゼＤの活性回収
率はｊ６優であった。

実施例　３ きな粉３．０％、コーンスチープリカー／、ＱＯ、４’
　４−　ＭｇＳＯ４１１７Ｈ２Ｑ　　Ｏ、０／　４．　
ツウ（７（Ｔｗｅｅｎ　）−ｇ、ｔ　　Ｏ、／　％カら
成る培地（ＰＨ６，０）約１ｊＪｌを３θ！ジャーファ
ーメンタ−に入れ。

１２０Ｃで７ｆ分間滅菌後、実施例２に記載したシード
培養液１．ｊｌｊ、を植菌し、コ２Ｃでｅｏ時間培養を
行った。　　　１ 培養後、菌体固形物を遠心分離により除去し一遠心上清
１３Ｉ／（３コ、コｕ／ｉＪ’）を得た。コノ遠心上清
をｊｃＫ冷却した後−−２０７：のアセトンを加えてア
セトン濃度３０〜７０４画分に相当するホスホリパーゼ
Ｄを含む沈澱物を遠心分離により集めた。この沈澱物を
ｐＨ４，Ｏ）リス−マレイン酸に溶解し、０，０２Ｍの
同緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衝化したＤ
ＥＡＥ−セルロースに通塔し１通過区分を集めた。次に
場内等の方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｇ　／　、　
　ｔｔ３ｑ　（／９７７））で調整したバルミトイルガ
ーゼをカラムに充填し。

充分に水洗してから上記ＤＥＡＥ−セルロース通過液を
注入し一活性を吸着した。これを０．０１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，２）で洗浄後、０．２４’ｌ’ｒｉ
ｔｏｎ　Ｘ−’　００を含む同緩衝液を加え活性を溶出
した。活性区分を集めてバイオエンジニアリング社製の
限外ｒ過膜（Ｔｙｐｅ　　Ｇ　−／　ｏ　Ｔ　）　（＝
に注入し、蒸留水を−用い−て通塔し、活赫区分を集め
て凍結乾燥を行った０ この乾燥粉末を０．０２１Ｍイミダゾール−塩酸（ｐＨ
２，ｕ）に溶解後−フアルマシア・ファインケミカルス
社製のポリバッファ交換体ＰＢＥ”？＜１（−〇ａｔ　
）充填カラムに通塔して活性を吸着後。

同社製の溶出用ポリバッファ（ｐＨ−ｔ、０）を用いて
ｐＨ勾配により溶出した。溶出したホスホリパーゼＤの
活性区分を集めて限外ｆ過膜にて濃縮し、セファデック
スＧ−７！充填カラムに通塔し、ホスホリパーゼＤ活性
区分を集めて凍結乾燥した。

かくして約ｙｏ４の活性回収率でホスホリパーゼＤを回
収し−この時の比活性はノθ７００ｕ７Ｊ１１蛋白質で
あった。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明方法によって得られるホスホリパーゼＤに
関するもので、第１図は至適ｐＨを示す曲線−第一図は
至適温度を示す曲線−第３図はｐＨ安定性を示す曲線、
第４図は熱安定性を示す曲線である。 りｔ　１’ｆＡ −？ト４４Ａ＜ ケ２　＠ １鎚 ヤＪｆ　　図 手　　続　　補　　正　　書 昭和ｓｔｒ年１月７日 特肝庁長官若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和３を年特許願第１ｄ／Ｑ７ｄ号” ３、補正をする者 ４、代理人 住所　郵便番号　１７１ ５、補正命令の日付 自　　発　　補　　正 ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、補正の内容 （１）明細書第１ｇ頁第７９行の「デオキシコール酸ソ
ーダ、ＴｒｉｔｏｎＪを次のように訂正します。 「デオキシコール酸ソーダ、エタノール、インプロパツ
ール、ｔ−ブタノールの如き第１．級、第一級、又は第
３級アルコール、ＴｒｉｔｏｎＪ（２）明細書第１９頁
第１Ｏ行と第１／行の間に次の文章を挿入します。 「◎転位作用 キャベツのホスホリパーゼＤはレシチンからホスファチ
ジン酸を生成し、これを炭素数ノから乙までの直鎖の１
級アルコールに転位してエステルを形成することが知ら
れてりる。本酵素についても同様に転位作用′を調べた
結果、本酵素では更に広範囲のアルコールに転位が起り
エステルが形成することが判明した。基質となるリン脂
質としてもレシチン以外のジアシルエステル型、モノア
シルエステル型、フラスマローゲン型、シクロアルキリ
デン型、ジアルキルエーテル型、モノアルキルエーテル
型のα−グリセロリン脂質、及ヒβ−グリセロリン脂質
が用いられ、またスフィンゴリン脂質もよい基質となる
。 転位の起るアルコールとしては次の分類ものがあげられ
る。 Ａ、１級アルコール （１）炭素数ｌからココまでの脂肪族アルコール及びそ
れに第１級、第２級、第３級アミン、ハロゲン、水酸基
、カルボン酸とそのエステル、エーテル、アルデヒド、
ケトン等の置換基を有するもの （２）ペントース、ヘキソース及びそれにアミノ基、酸
アマイド等の置換基を有するもの（３）ｆｉフルコール
及ヒ多（ｉ１１ｉアルコール（４）三糖類 （５）芳香族アルコール及びそれに了ミノ基、ノーロゲ
ン、カルボン酸等の置換基を有するもの（６）脂環式ア
ルコール （７］炭素多環式アルコール （８）フラン環、フタルイミド環、ピロール環、インド
ール環、ピリジン環、モルホ１１ン環、ピリミジン環、
ピペラジン環、イミダゾピリミジン環等の複素環アルコ
ール Ｂ、第２級アルコール （１）炭素数ｌからｌＯまでの脂肪族アルコール及びそ
れに各種置換基を有するもの 〔２）芳香族アルコール （３］脂環式アルコール これらの基質とアルコールを組合わせて転位作少量の生
成があったものを士、生成の認められなかったものを−
で示した。また各アルコールの前の記号は上記アルコー
ルの分類番号を示す。これと同様の検査を市販のキャベ
ツから得られたホスホリパーゼＤを用いて行ったが、転
位物

【エステル）の生成したものは全（なかった。 次に転位作用の実験方法を述べる。 ０．１７Ｍ、ｐＨ３，７酢酸緩衝液Ｑ、／祷、Ｑ、１Ｍ
　ＣａＣ１，水溶液ｏ、ｏｓｒｒｔｅ、ホスホリパーセ
ＤコＳＯ単位を含む酵素液ａ、／１１１、／　１１Ｊン
脂質エマルジョンＣＯ，ＩＰ＋）ン脂質、／ｍＡエーテ
ル、ｉｏｍｓ蒸留水の超音波乳化液】ｏ、ｔａｂ及びＩ
Ｏ係アルコール溶液（溶解度に応じて水、エーテルまた
はアセトンを用いる）０．／！；ｍＡを混合し、３りＣ
でＩ−３時間反応させた。反応終了後、ＳＯミリモルの
ＥＤＴＡを含む１モル、ｐ’ｆ１ｇ、０のトリス塩酸緩
衝液Ｏ，コｌｌｌ６とクロロホルム−メタノール混液Ｃ
コニ　／　）　ｊｌＲｌを加え、混合して転位生成物（
エステル）を抽出した。静置後、下層を分取し、減圧乾
燥後少量のクロロホルム−メタノール混液（／：／）に
溶かし、薄層クロマトグラフィーにて転位生成物（エス
テル）の検出を行った。 その結果を第２表に示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ノカルディオプシス属に属するホスホリパーゼＤ生産菌
   を培地に培養し、培養物からホスホリパーゼＤを採取す
   ることを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。