JPS60152955A - 抱合ビリルビンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抱合ビリルビンの定量方法、更に詳しくは定量
試薬としてビリルビンオキシダーゼを使用したビリルビ
ンのうち、抱合ビリルビンの分別定量が可能な抱合ビリ
ルビンの定量方法に関する。

ビリルビンは、胆汁色素の主成分をなすもので、血清中
には抱合ビリルビン及び遊離ビリルビンが存在する。そ
して、血清中の抱合ビリルビンの増加からは、肝ミクロ
ゾームにおける抱合から十二指腸までのビリルビン這般
経路のどこかに障害をきたしたことを、また血清中の遊
離ビリルビンの増加からは、種々の原因による溶血性貧
廁が生じていること等を知ることができ、抱合及び遊離
ビリルビンを・分別定量することは臨床的に極めて重要
である。

従来、抱合ビリルビンの定量は、例えばスルファニル酸
を用いたジアゾ化法において、メタノールやダイフィリ
等を使用しない以外は総ビリルビンの定量と同様の方法
にょシ行なわれてきた。然し、ジアゾ化法は■呈色が弱
く、正常値付近の濃度では測定に大量の検体を必要とす
る、■検体に混濁が生じゃすく、定量値にバラツキが大
きい、■反応が十分平衡に達したとみなせるまでに長時
間装するため、反応のエンド・？インドが不明確となシ
、定量値が不正確になシ易い等の欠点を有していた。然
し、抱合ビリルビンの分別定量には、主として上記ジア
ゾ化法が利用されてきた。

本発明者は、斯かる実情において、□上記欠点のない抱
合ビリルビンの定量方法を開発すへく、ビリルビンに特
異的に作用しシこれを酸化してビリベルシンに変える酵
素として知られるビリルビンオキシダーゼを使用して抱
合ビリルビンの分別定量を種々試みたところ、抱合及び
遊離ビリルビンを含有する水性検体にビリルビンオキシ
ダーゼの特定ｐＨの溶液からなる試薬を作用せしめると
、ビリルビンオキシダーゼは単時間内には主として抱合
ビリルビンと反応することを見出し、本発明を完成した
。

すなわち、本発明は水性検体に、ビリルビンオキシダー
ゼ及び陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ５〜６の電性
Ｍ衝液からなる試薬（以下、本発明試薬と略称する）を
作用せしめ、その眩光度を測定することを特徴とする、
微量の検体で簡単かつ迅速に、しかも正確かつ再現性よ
く抱合ビリルビンを特異的に定量できる定量方法を提供
するものである。

本発明の測定原理は次の如くである。水性液体中のビリ
ルビンの極大吸収は、通常４４０〜４７０　ｎｍの範囲
にあるが、ビリベルシアはとの波長領域には吸収がほと
んどガい。また、本発明試薬を作用せしめると、ビリル
ビンオキシダーゼは単時間内には遊離ビリルビンとは１
１とんと反応しない。従って、ビリルビンな含有する検
体と、これに本発明試薬を作用せしめたものの４４０〜
４７Ｑｎｍにおける吸光度差を測定すれば、抱合ビリル
ビンのみを定量することができる。

検体は、血清、血しょう、尿等の水性のものであればよ
く、特に限定され力い。検体は、抱合ビリルビン含量に
もよるが、通例は少量でよく、ヒト血清中の平常値付近
（０−０，６ｒｒｑ　／　ｄＬ　）であっても２０〜１
００　ｐｔ８Ｕｈれば定量が可能である。なお、検体中
の遊離ビリルビン量が少ない程精度よく定量できる。

ビリルビンオキシダーゼは、検体中のビリルビン濃度に
もよるが、最終濃度として０．０１〜１．ＯＵ／―使用
するのが好ましい。

本発明に使用する陰イオン界面活性剤としては、？リオ
キシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、Ｎ−アシルアミ
ノ酸もしくはその塩、Ｎ−アシルメチルタウリン塩、？
リオキシェチレンアルヤルエーテル酢酸塩、アルキルス
ルホコハク酸塩、α−オレフィンスルボン酸塩等が挙げ
られ、就中ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩
が好ましく、例えば醪すオキシエチレンラウリルエーテ
ル硫酸ナトリウム［ＳＢＬ　−４Ｎ　（日光ケミカルズ
株式会１１１））、ｄＰ！Ｊオキシエチレンアルキルエ
ーテル硫酸ナトリウム（ＮＦＳ　−２０３（日光ケミカ
ルズ株式会社製）〕等を挙げることができる。陰イオン
界面活性剤は、最終濃度が０．０１〜５，０重量％（以
下、％と示す）となるように使用するのが好ましい。

本発明に使用する酸性緩衝液は１．■５〜６の範囲にあ
るもので、例えばフタル酸カリウム・水酸化ナトリウム
緩衝液、クエン酸、水酸化ナトリウム緩衝液等が挙げら
れ机ｐＨ域がこの範囲にない緩衝液では、ビリルビンオ
キシダーゼの抱合及び遊離ビリルビンに対する反応性に
顕著な差がなく好ましくない。また、ｐＨが５よシ小烙
い場合には、検体中の蛋白質が析出して検体に濁シが生
じ、ビリルビンオキシダーゼのｐＨ安定性が低下するた
め好１しく々い。

本発明試薬には、上記必須成分のほかに、乳糖、アラニ
ン、グリシン、牛アルブミン、シクロデキストリン等の
安定化剤、窒化ソーダ等を適宜添加配合することができ
る。

本発明試薬は、その使用にあたシ、１試薬として用いて
も、また、２試薬に分けておいて使用時混合して使用す
ることもできる。本発明に使用される陰イオン界面活性
剤とビリルビンオキシダーゼを共存させると、酵素活性
が低下することがあるため、陰イオン界面活性剤とビリ
ルビンオキシダーゼは２試薬に分けて保存することが好
ましい。この場合、本発明試薬は冷暗所にて３０日程度
保存が可能である。また、測定は２５〜４０℃で行なう
のが好ましい。

本発明試薬を用いて検体中の抱合ビリルビンのみを定量
するには、検体を２分し、一方の検体に本発明試薬を加
え、３７℃で反応させ、反応がエンド・緻インドに達し
たら、との液の４５０　ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を
測定する。通例、エンド・ポイントに達するのに要する
時間（ｔｅ　）は５〜２０分程度である。吸光度の測定
は、エンド・ポイントが確認できたら直ちに測定するの
が好ましい。さもないと、ビリルビンオキシダーゼの遊
離ビリルビンとの反応が進み、その影響を無視できなく
なり、抱合ビリルビンの定量値が不正確なものになる。

また、一方の検体にはビリルビンオキシダーゼを含有し
ない以外は上記と同じ組成の試薬を加え、３７°Ｃに保
ち、ｔｅ分経過後の４５０　ｎｍにおける吸光度（ＯＤ
）を測定する。次に吸光度差＝ＯＤ　−０ＤＢを計算し
、抱合ビリルビン標準液を用いて上記と同温度で得た検
量線を利用すれば、検体中の抱合ビリルビン量を定量す
ることができる。

抱合ビリルビンの標準液としては、オメガ・ケミストリ
ーコントロールセーラム・エレベイテツドビリルビン（
ハイランド社製）等が挙げられる。

本発明の定量方法を用いて、遊離ビリルビンを定量する
には、先に本発明者が別途出願した方法に従って、あら
かじめ検体中の総ビリルビン量をめておき、これから本
発明方法によりめた抱合ビリルビン量を差し引けばよい
。

次に実施例を挙けて本発明を説明する。

実施例１ 下記の第１試薬、第２試薬を用い、標準液又は高抱合ビ
リルビン血清を５段階希釈した液を各々検体として抱合
ビリルビン濃度を測定し、希釈倍率と定量された抱合ビ
リルビン濃度の間の直線性を調べた。

（試薬゛組成）： 第１試薬： ０．１Ｍフタル酸カリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（
ｐＨ５，５）、０２％ＳＢＬ　−４Ｎ或いは０．２％Ｎ
ＥＳ　−２０３含有。

第２試薬： ０．００５Ｍ炭酸緩衝液（Ｎ　ａ２ｃＯ３＋１’ＪａＨ
ＣＯ３）（Ｐ”’、５）％　ビリルビンオキシダーゼ〔
凍結乾燥品（日水製薬株式会社製）：３０．２ｓｕ／−
１乳糖、アラニン含有。

（測定方法及び結果） 検体２０μｔに、第１試薬５００μｔを加え、３７℃で
５分間反応させる。５９彼に吸光度を測定する（ＯＤ′
Ｂ）。次に、当該反応液に第２試薬１００μｔを加え、
３７℃で５分間反応させ、吸光度を測定する（ＯＤ′ｓ
）。吸光度差−〇Ｄ′８−ＯＤ′Ｂをめ、標準液（抱合
ピリルビリン既知濃度）での吸光度差と比較して抱合ビ
リルビン濃度をめた。なお測定には日立７０５（日立製
作新製）を使用し、測定波長は主波長４５０ｎｍ、副波
長５４６　ｎｍの２波長で行なった。

その結果、第１図に示す如く約３０ｍ９／ｄｉまでの直
線性が明らかとなった。また種々の濃度（０１η／ｄｔ
、５．５■／　ｄ４　）の検体を繰シ返し測定して再現
性を調べたところ、いずれの場合も再現性は良好であっ
た。

実施例２ 下記の試薬を用い、高抱合ビリルビン血清及び遊離ビリ
ルビン液を検体としてその反応曲線（吸光度０Ｄｓ一時
間曲線）を測定した。

結果を第２図に示す。

（試薬組成） 酵素試薬： ０、０８３　Ｍフタル酸カリウム・水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐｕｓ、ｓ）、０．１７％ＳＢＬ　−４Ｎ或いは
０．１７％邪Ｓ−２０３、ピリルビリンオキシダーゼ（
実施例１と同じ）０．０４２Ｕ／ｍ、乳糖、アラニン含
有。

ブランク試薬： ビリルビンオキシダーゼを含まない以外は、上記酵素試
薬と同組成。

第２図から明らかなように、高抱合ビリルビン血清では
反応は５分程度でエンド・、３Ｐインドに達している。

一方、本発明試薬は遊離ビリルビンとはほとんど反応せ
ず抱合ビリルビンに対し選択的に反応することがわかる
。

なお、ブランク試薬を作用せしめた場合の反応曲線（吸
光度０ＤＢ一時間曲線）は時間に対しほとんど変化しな
かった。

実施例３４゜ 実施例１と同じ試薬を用い、同様の方法によシ生血清中
の抱合ビリルビンを定量した。

また同じ検体をシアン化法、すなわちミノ・エルシン変
法によるアルカリアゾビリルビンブルー比色定量法〔［
ビリルビンキラ）−Ｋ」（日本商事株式会社製）〕で定
量し、本発明方法とシアン化法による結果の相関関係を
調べた。結果を第３図に示す。

第３図から、相関係数０．９９５７．回帰式７式％ ：木本法であり、良好々相関関係があることがわかる。

従って、本発明方法は、シアン化法の代わシに充分用い
られることが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は希釈倍率と定量された抱合ビリルビン濃度の関
係を示す図面、第２図は遊離ビリルビン液（−−−）と
高抱合ビリルビン血清（−）の反応曲線を示す図面、第
３図は本発明方法及びシアン化法で定量された抱合ビリ
ルビン濃度の相関を示す図面である。 以上 第１図 （■／ｄｔ） ０　１１５　２１５　３１５　４１５　５１５希釈倍率 第２図 反応時間（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　水性検体に、ビリルビンオキシダーゼ及び陰イオ
   ン界面活性剤を含有するｐＨ５〜６の酸性緩衝液から々
   る試薬を作用せしめ、その吸光度を測定することを％徴
   とする抱合ビリルビン、の定量方法。 ・２．　陰イオン界面活性剤が前リオキシエテレンアル
   キルエーテル硫酸塩である特許請求の範囲第１項記載の
   抱合ピリルぎンの定量方法。 ３、　酸性緩衝液がフタル酸カリウム・水酸化ナトリウ
   ム緩衝液である特許請求の範囲第１項記載の抱合ビリル
   ビンの定量方法。