JPH059066B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抱合ビリルビンの定量方法、更に詳し
くは定量試薬としてビリルビンオキシダーゼを使
用したビリルビンのうち、抱合ビリルビンの分別
定量が可能な抱合ビリルビンの定量方法に関す
る。

ビリルビンは、胆汁色素の主成分をなすもの
で、血清中には抱合ビリルビン及び遊離ビリルビ
ンが存在する。そして、血清中の抱合ビリルビン
の増加からは、肝ミクロゾームにおける抱合から
十二指腸までのビリルビン運搬経路のどこかに障
害をきたしたことを、また血清中の遊離ビリルビ
ンの増加からは、種々の原因による溶血性貧血が
生じていること等を知ることができ、抱合及び遊
離ビリルビンを分別定量することは臨床的に極め
て重要である。

従来、抱合ビリルビンの定量は、例えばスルフ
アニル酸を用いたジアゾ化法において、メタノー
ルやダイフイリ等を使用しない以外は総ビリルビ
ンの定量と同様の方法により行なわれてきた。然
し、ジアゾ化法は呈色が弱く、正常値付近の濃
度では測定に大量の検体を必要とする、検体に
混濁が生じやすく、定量値にバラツキが大きい、
反応が十分平衝に達したとみなせるまでに長時
間要するため、反応のエンド・ポイントが不明確
となり、定量値が不正確になり易い等の欠点を有
していた。然し、抱合ビリルビンの分別定量に
は、主として上記ジアゾ化法が利用されてきた。

本発明は、斯かる実情において、上記欠点のな
い抱合ビリルビンの定量方法を開発すべく、ビリ
ルビンに特異的に作用し、これを酸化してビリベ
ルジンに変える酵素として知られるビリルビンオ
キシダーゼを使用して抱合ビリルビンの分別定量
を種々試みたところ、抱合及び遊離ビリルビンを
含有する水性検体にビリルビンオキシダーゼの特
定PHの溶液からなる試薬を作用せしめると、ビリ
ルビンオキシダーゼは短時間内には主として抱合
ビリルビンと反応することを見出し、本発明を完
成した。

すなわち、本発明は水性検体に、ビリルビンオ
キシダーゼ及び陰イオン界面活性剤を含有するPH
５〜６の酸性緩衝液からなる試薬（以下、本発明
試薬と略称する）を作用せしめ、その吸光度を測
定することを特徴とする、微量の検体で簡単かつ
迅速に、しかも正確かつ再現性よく抱合ビリルビ
ンを特異的に定量できる定量方法を提供するもの
である。

本発明の測定原理は次の如くである。水性液体
中のビリルビンの極大吸収は、通常440〜470mmの
範囲にあるが、ビリベルジンはこの波長領域には
吸収がほとんどない。また、本発明試薬を作用せ
しめると、ビリルビンオキシダーゼは短時間内に
は雄離ビリルビンとはほとんど反応しない。従つ
て、ビリルビンを含有する検体と、これに本発明
試薬を作用せしめたものの400〜470mmにおける吸
光度差を測定すれば、抱合ビリルビンのみを定量
することができる。

検体は、血清、血しよう、尿等の水性のもので
あればよく、特に限定されない。検体は、抱合ビ
リルビン含量にもよるが、通例は少量でよく、ヒ
ト血清中の平常値付近（０〜0.6mg／dl）であつ
ても20〜100μl程度であれば定量が可能である。
なお、検体中の遊離ビリルビン量が少ない程精度
よく定量できる。

ビリルビンオキシダーゼは、検体中のビリルビ
ン濃度にもよるが、最終濃度として0.01〜1.0U／
ml使用するのが好ましい。

本発明に使用する陰イオン界面活性剤として
は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸
塩、Ｎ−アシルアミノ酸もしくはその塩、Ｎ−ア
シルメチルタウリン塩、ポリオキシエチレンアル
キルエーテル硫酸塩、アルキルスルホコハク酸
塩、α−オレフインスルホン酸塩等が挙げられ、
就中ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩
が好ましく、例えばポリオキシエチレンラウリル
エーテル硫酸塩ナトリウム〔SBL−4N（日光ケミ
カルズ株式会社製）〕、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸ナトリウム〔NES−203（日光ケ
ミカルズ株式会社製）〕等を挙げることができる。
陰イオン界面活性剤は、最終濃度が0.01〜5.0重
量％（以下、％と示す）となるように使用するの
が好ましい。

本発明に使用する酸性緩衝液は、PH５〜６の範
囲にあるもので、例えばフタル酸カリウム・水酸
化ナトリウム緩衝液、クエン酸、水酸化ナトリウ
ム緩衝液等が挙げられる。PH域がこの範囲にない
緩衝液では、ビリルビンオキシダーゼの抱合及び
遊離ビリルビンに対する反応性に顕著な差がなく
好ましくない。また、PHが５より小さい場合に
は、検体中の蛋白質が析出して検体に濁りが生
じ、ビリルビンオキシダーゼのPH安定性が低下す
るため好ましくない。

本発明試薬には、上記必須成分のほかに、乳
糖、アラニン、グリシン、牛アルブミン、シクロ
デキストリン等の安定化剤、化ソーダ等を適宜添
加配合することができる。

本発明試薬は、その使用にあたり、１試薬とし
て用いても、また、２試薬に分けておいて使用時
混合して使用することもできる。本発明に使用さ
れる陰イオン界面活性剤とビリルビンオキシダー
ゼを共存させると、酵素活性が低下することがあ
るため、陰イオン界面活性剤とビリルビンオキシ
ダーゼは２試薬に分けて保存することが好まし
い。この場合、本発明試薬は冷暗所にて30日程度
保存が可能である。また、測定は25〜40℃で行な
うのが好ましい。

本発明試薬を用いて検体中の抱合ビリルビンの
みを定量するには、検体を２分し、一方の検体に
本発明試薬を加え、37℃に反応させ、反応がエン
ド・ポイントに達したら、この液の450nｍにお
ける吸光度（OD_S）を測定する。通例、エンド・
ポイントに達するのに要する時間（te）は５〜20
分間程度である。吸光度の測定は、エンド・ポイ
ントが確認できたら直ちに測定するのが好まし
い。さもないと、ビリルビンオキシダーゼの遊離
ビリルビンとの反応が進み、その影響を無視でき
なくなり、抱合ビリルビンの定量値が不正確なも
のになる。また、一方の検体にはビリルビンオキ
シダーゼを含有しない以外は上記と同じ組成の試
薬を加え、37℃に保ち、te分経過後の450nｍにお
ける吸光度（OD_B）を測定する。次に吸光度差＝
OD_S−OD_Bを計算し、抱合ビリルビン標準液を用
いて上記と同温度で得た検量線を利用すれば、検
体中の抱合ビリルビン量を定量することができ
る。抱合ビリルビンの標準液としては、オメガ・
ケミストリーコントロールセーラム・エレベイテ
ツドビリルビン（ハイランド社製）等が挙げられ
る。

本発明の定量方法を用いて、遊離ビリルビンを
定量するには、先に本発明者が別途出願した方法
に従つて、あらかじめ検体中の総ビリルビン量を
求めておき、これから本発明方法により求めた抱
合ビリルビン量を差し引けばよい。

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例 １ 下記の第１試薬、第２試薬を用い、標準液又は
高抱合ビリルビン血清を５段階希釈した液を各々
検体として抱合ビリルビン濃度を測定し、希釈倍
率と定量された抱合ビリルビン濃度の間の直線性
を調べた。

（試薬組成）： 第１試薬： 0.1Mフタル酸カリウム・水酸化ナトリウム緩
衝液（PH5.5）、0.2％SBL−4N或いは0.2％NES−
203含有。

第２試薬？ 0.005M炭酸緩衝液（Na₂CO₃＋NaHCO₃）（PH
9.5）、ビリルビンオキシダーゼ〔凍結乾燥品（日
水製薬株式会社製）〕0.25U／ml、乳糖、アラニ
ン含有。

（測定方法及び結果） 検体20μに、第１試薬500μを加え、37℃で
５分間反応させる。５分後に吸光度を測定する
（OD′_B）。次に、当該反応液に第２試薬100μを
加え、37℃で５分間反応させ、吸光度を測定する
（OD′_S）。吸光度差＝OD′_S−OD′_Bを求め、標準液
（抱合ビリルビリン既知濃度）での吸光度差と比
較して抱合ビリルビン濃度を求めた。なお測定に
は日立705（日立製作所製）を使用し、測定波長は
主波長450nm、副波長546nmの２波長で行なつ
た。

その結果、第１図に示す如く約30mg／dlまでの
直線性が明らかとなつた。また種々の濃度（0.1
mg／dl、5.5mg／dl）の検体を繰り返し測定して
再現性を調べたところ、いずれの場合も再現性も
良好であつた。

実施例 ２ 下記の試薬を用い、高抱合ビリルビン血清及び
遊離ビリルビン液を検体としてその反応曲線（吸
光度OD_S−時間曲線）を測定した。結果を第２図
に示す。

（試薬組成） 酵素試薬： 0.83Mフタル酸カリウム・水酸化ナトリウム緩
衝液（PH5.8）、0.17％SBL−4N或いは0.17％NES
−203、ビリルビリンオキシダーゼ（実施例１と
同じ）0.042U／ml、乳糖、アラニン含有。

ブランク試薬： ビリルビンオキシダーゼを含まない以外は、上
記酵素試薬と同組成。

第２図から明らかなように、高抱合ビリルビン
血清では反応は５分程度でエンド・ポイントに達
している。一方、本発明試薬は遊離ビリルビンと
はほとんど反応せず抱合ビリルビンに対し選択的
に反応することがわかる。なお、ブランク試薬を
作用せしめた場合の反応曲線（吸光度OD_B−時間
曲線）は時間に対しほとんど変化しなかつた。

実施例 ３ 実施例１と同じ試薬を用い、同様の方法により
生血清中の抱合ビリルビンを定量した。また同じ
検体をジアゾ化法、すなわちミハエルソン変法に
よるアルカリアゾビリルビンブルー比色定量法
〔「ビリルビンキツトーＫ」（日本商事株式会社
製）〕で定量し、本発明方法とジアゾ化法による
結果の相関関係を調べた。結果を第３図に示す。

第３図から、相関係数を0.9957、回帰式ｙ＝
0.911x−0.4（ｘ：ジアゾ化法、ｙ：本法）であ
り、良好な相関関係があることがわかる。従つ
て、本発明方法は、ジアゾ化法の代わりに充分用
いられることが明らかとなつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は希釈倍率と定量された抱合ビリルビン
濃度の関係を示す図面、第２図は遊離ビリルビン
液（…）と高抱合ビリルビン血清（−）の反応曲
線を示す図面、第３図は本発明方法及びジアゾ化
法で定量された抱合ビリルビン濃度の相関を示す
図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水性検体に、ビリルビンオキシダーゼ及び陰
   イオン界面活性剤を含有するPH５〜６の酸性緩衝
   液からなる試薬を作用せしめ、その吸光度を測定
   することを特徴とする抱合ビリルビンの定量方
   法。 ２ 陰イオン界面活性剤がポリオキシエチレンア
   ルキルエーテル硫酸塩である特許請求の範囲第１
   項記載の抱合ビリルビンの定量方法。 ３ 酸性緩衝液がフタル酸カリウム・水酸化ナト
   リウム緩衝液である特許請求の範囲第１項記載の
   抱合ビリルビンの定量方法。