JPS60154162A - 遊離ビリルビンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遊離ビリルビンの定量方法、更に詳しくは定量
試薬としてビリルビンオキシダーゼを使用した、ビリル
ビンのうち、遊離ビリルビンの分別定量が可能な遊離ビ
リルビンの定置方法に関する。

ビリルビンは、胆汁色素の主成分をなすもので、血清中
には抱合ビリルビン及び遊離ビ□リルビンが存在する。

そして、血清中の抱合ビリルビンの増加からは、肝ミク
ロゾームにおける抱合から十二指腸までのビリルビン連
設経路のどこかに障害をきたしたことを、また血清中の
遊離ビリルビンの増加からは、種々の原因による溶血性
貧血が生じていること等を知ることができ、抱合及び遊
離ビリルビンを分別定量するととは臨床的に極めて重要
である。

従来、遊離ビリルビンの定量は、例えば通常のジアゾ化
法によシ総ビリルビン量を測定し、これから例えば前記
ジアゾ化法において使用しないで測定した抱合ビリルビ
ン量を差し引くことによシ行なわれてきた。然し、ジア
ゾ化法は■呈色が弱く、正常値付近の濃度では測定に大
量の検体を必要とする、■検体に混濁が生じやすく、定
量値にバラツキが太きい、■反応が十分平衡に達したと
みなせるまでに長時間型するため、反応のエンド・？イ
ンドが不明確となシ、定量値が不正確になシ易い等の欠
点を有していた。

本発明者は、斯かる実情において、上記欠点のない遊離
ビリルビンを直接定量する方法を開発すべく、ビリルビ
ンに特異的に作用し、これを酸化してレリベルゾンに変
える酵素として知うれるビリルビンオキシダーゼを使用
して遊離ビリルビンの分別定量を種々試みたところ、抱
合ビリルビン及び遊離ビリルビンを含有する水性検体に
ビリルビンオキシダーゼの特定の溶液からなる試薬をビ
リルビンオキシダーゼの最終濃度が一定の濃度範囲とな
るように作用せしめると、ビリルビンオキシダーゼは単
時間内には主として遊離ビリルビンとのみ反応すること
を見出し、本発明を完成　し　ブこ。

すなわち、本発明は水性検体に、ビリルビンオキシダー
ゼ及び陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ１３以上のア
ルカリ性緩衝液からなる試薬を、ビリルビンｌ　ｍｙに
対しビリルビンオキシダーゼがｏ、ｏｏｉ〜０．０１　
［１になるように作用せしめ、その吸光度ｆｃ測測定る
ことを特徴とする、微量の検体で簡単かつ迅速に、しか
も正確かつ再現性よく遊離ビリルビンを特異的に定量で
きる定量方法を提供するものである。

本発明の測定原理は次の如くである。水性液体中のビリ
ルビンの極大吸収は、通常４４０〜４７Ｑｎｍの範囲に
あるが、ビリベルシンはこの波長領域には吸収がほとん
どない。また、本発明試薬を作用せしめると、ビリルビ
ンオキシダーゼは単時間内には抱合ビリルビンとはほと
んど反応しない。従って、ビリルビンを含有する検体と
、これに本発明試薬を作用せしめたものの４４０〜４７
０ｎｍにおける吸光度の差を測定すれば、遊離ビリルビ
ンのみを定量することができる。

検体は、血清、血しよう、尿等の水性のものであればよ
く、特に限定されない。検体は、遊離ビリルビン含量に
もよるが、通例は少量でよく、ヒト血清中の平常値付近
（０〜０．６Ｑ／ｄｌ）であっても２０〜１００μ！程
度あれば定量可能である。なお、検体中の抱合ビリルビ
ン量が少ない程精度よく定量できる。

ビリルビンオキシダーゼは、検体中のビリルビン１■に
対しｏ、ｏ　ｏ　ｉ〜０．０１Ｕになる量、一般には最
終濃度が０．０１〜０．０５Ｕ　／１ｎｌ！となるよう
に使用される。ビリルビンオキシダーゼの量がこの範囲
外にある場合、ビリルビンオキシダーゼの抱合及び遊離
ビリルビンに対する反応性に顕著な差がなくなシ好まし
くな−。

本発明に使用する陰イオン界面活性剤としては、例えば
アルキル硫酸塩及びアルキルアリル硫酸塩が挙げられ、
ドデシル硫酸ナトリウム（８Ｄ８）、コール酸ナトリグ
ム、ドデシルベンゼンスルホンｆ！ｌ−）　Ｉ）　ウＡ
　（８ＤＢＥｌ）等が挙げられる。陰イオン界面活性剤
は、最終濃度が０．０１〜５．０重量ｑｂ（以下、襲で
示す）となるように使用するのが好まし１〇 本発明に使用するアルカリ性緩衝液はｐＴｌが８以上で
あシ、好ましくはｐＨ８〜１０のもので、例えはゾエチ
ルノ々ルビツール酸ナトリウム・塩酸緩衝液、トリスヒ
ト１０キシアミノメタン・塩酸緩衝液等が挙けられる。

　１本発明試薬には、上記必須成分の＃１かに、　１乳
糖、アラニン、グリシン、牛アルブミン、シフロブ今ス
トリン等の安定化剤、窒化ソ−〆等を適宜添加配合する
ことができる。また、検体の混濁を防ぐため、使用した
陰イオン界面活性剤と構造が類似でクラフト点のよシ高
い界面活性剤、例えばｓｐｓに対しては８Ｄ　ＢＳ等を
併用するのが好ましい。

本発明試薬は、その使用にあた９、１試薬として用いて
も、また２試薬に分けて使用時混合して使用することも
できる。本発明に使用される隘イオン界面活性剤、例え
は８Ｄ８は蛋白質変成作用があるため、８Ｄ８とビリル
ビンオキシダーゼを共存させた場合、本発明試薬の保存
可能な期間は冷暗所で３日程度であるが、８Ｄ８とビリ
ルビンオキシダーゼを別の試薬に配合した場合、冷暗所
で１箇月は安定に保存できる。従って、２試薬に分けて
使用するのがよシ好ましい。測定は２５〜４０℃で行な
うのが好ましい。

本発明試薬を用いて検体中の遊離ビリルビンのみを定量
するには、検体を２分し、一方の検体に本発明試薬を加
え、３７℃で反応させ、反応がエンド・？インドに達し
たら、仁の液の４５０　ｎｍにおける吸光度（ＯＤｓ）
を測定する。通例、エンド・？インドに達するのに要す
る時間（ｔｅ）は５〜２０分程度である。

吸光度の測定は、エンド・？インドが確認できたら直ち
に測定するのが好ましい。さもないト、ビリルビンオキ
シダーゼの抱合ビリルビンとの反応が進み、その影響を
無視できなくなシ、遊離ビリルビンの定量値が不正確な
ものになる。また、一方の検体にはビリルビンオキシダ
ーゼを含有しない以外は上記と同じ組成の試薬を加え、
３７℃に保ち、ｔｅ分経過後の４５０ｎｍにおける吸光
度（ＯＤＢ）を測定する。次に吸光度差＝　０ＤＳ−０
’ＤＢを計算し、遊離ビリルビン標準液を用いて上記と
同温度で得た検量線を利用すれば、検体中の遊離ビリル
ビン量を定量することができる。遊離ビリルビンの標準
液としては日商ビリルビン標準液、ビリルビンコントロ
ール（ディト社製）等が挙げられる。

本発明の定量方法を用いて、抱合ビリルビンを定量する
には、先に本発明者が別途出願した方法に従って、あら
かじめ検体中の総ビリルビン値をめておき、これから本
発明方法によりめた遊離ビリルビン量を差し引けばよい
。

次に実施例を挙けて本発明を説明する。

実施例１ 下記の第１試薬、第２試薬を用い、標準液又は高遊離ビ
リルビン血清を５段階希釈した液を各々検体として遊離
ビリルビン濃度を測定し、希釈倍率と定量された遊離ビ
リルビン濃度の間の直線性を調べた。

（試薬組成） 第１試薬： ０．０５Ｍ５Ｍジエチル／ζルビツールトリウム・塩酸
緩衝液（ｐＨ８，１）、ｏ、１ｓｓｐ８．０．１％５Ｄ
ＢＢ含有。

第２試薬： ０．００５　Ｍ炭酸緩衝液（Ｎａ、Ｃｏ、　＋ＮＩＬＨ
ＣＯ３）（ｐＨ９，５）、ビリルビンオキシダーゼ〔凍
結乾燥品（日水製薬株式会社製）　）　０．０２５Ｕ／
ｄ、乳糖、アラニン含有。

（測定方法および結果） 検体２０μｌに、第１試薬５００μｌを加え、３７℃で
５分間反応させる。５分後に吸光度を測定する（ＯＤ′
Ｂ）。次に、当該反応液に第２試薬１００μｌを加え、
３７℃で５分間反応させ、吸光度を測定する（ＯＤ’ｓ
）。吸光度差”　ＯＤ’Ｂ　−ＯＤ’Ｂをめ、標準液（
ビリルビン既知濃度）での吸光度差と比較してビリルビ
ン濃度をめた。なお、測定には、日立７０５（日立製作
成製）を使用し測定波長は主波長４５０ｎｍ、副波長５
４６　ｎｍの２波長で行なった。

その結果、第１図に示す如く、約１８１１１ｉ’／ｄＡ
’までの直線性が明らかとなった。また、種々の濃度（
０，３ＮＦ！／ｄｌ　、　５．５■／ｄＪ　）の検体を
繰シ返し測定して再現性を調べたところ、いずれの場合
も再現性は良好であった。

実施例２ 実施例１と同じ試薬を用い、同様の方法によシ、生血清
中の遊離ビリルビンを定量した。

一方、同じ検体の総ビリルビン量を、下記組成の試薬を
用いた別途出願の方法により定量し、抱合ビリルビン量
（＝総ビリルビン量−遊離ビリルビン量）をめた。また
、同じ検体の抱合ビリルビン量をジアゾ仕法、すなわち
ミハエルツレ変法によるアルカリアゾビリルビンブルー
比色定量法〔［ビリルビンキツ）−Ｋｌ（日本商事株式
会社製）〕で定量し、本発明方法とジアゾ化法による結
果の相開関係を調へた。結果を第２図に示す。

（試薬組成） 第１試薬＝４゜ ０．０５Ｍゾエテルパルビツール酸ナトリウム・塩酸緩
衝液’（ｐＨ８，１）、０．１％ＳＤＳ、　０．１％５
Ｄ８Ｂ含有。

第２試薬： ０．００５　Ｍ炭酸緩衝液（’Ｎｌ！Ｌ２　ＣＯ３＋　
ＮＥＬＨｏｏＢ　）（ｐＨ９，５）、ビリルビンオキシ
ダーゼ〔凍結乾燥品（日水製薬株式会社製）　）　０．
８　Ｕ／ｄ、乳糖、アラニン含有。

第２図から、相関係数０．９４７４、回帰式ｙ＝ｏ、７
７５ｅ＋０．８　（ｙｃ　：ジアゾ化法、ｖ：水元。

明方法）であシ、良好な相関関係があることがわかる。

従って、本発明方法はジアゾ化法の代わシに充分用いら
れることが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は希釈倍率と定量された遊離ビリルビン濃度の関
係を示す図面、第２図は本発明方法に基づいて定量され
た抱合ビリルビン濃度とジアゾ化法によシ定量された抱
合ビリルビン濃度の相関を示す図面である。 以上 （ （ｍｇ／ｄｌｌ　）　第１図 第２図 （ｍｇ／１１ｅ） （ｍｑｙｌ＋ｅ） 〕歿列１ビ　リ　ル　ビ／己゛′冒実

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性検体に、ビリルビンオキシダーゼ及び陰イオン
   界面活性剤を含有するｐＨ３以上のアルカリ性緩衝液か
   らなる試薬を、ビリルビン１　Ｆ＋９に対しビリルビン
   オキシダーゼが０．００１〜ｏ、ｏ　ｉ　ｏになるよう
   に作用せしめ、その吸光度を測定することを特徴とする
   遊離ビリルビンの定量方法。 λ　陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩又は／及ヒア
   ルキルアリルスルホネートである特許請求の範囲第１項
   記載の遊離ビリルビンの定量方法。 シ　陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであ
   る特許請求の範囲第１項記載の遊離ビリルビンの定量方
   法。 く　陰イオン界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム及び
   ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである特許請求
   の範囲第１項記載の遊離ビリルビンの定量方法。 ５、アルカリ性緩衝液がゾエチルｊルビツール酸ナトリ
   ウム・塩酸緩衝液である特許請求の範囲第１項記載の遊
   離ビリルビンの定量方法。