JPS60155135A - カンジダ・アルビカンスの細胞質抗原に対するモノクロ−ナル抗体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は徽カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａ
ｌｂｉｃａｎｓ　）の１群の細胞質抗原に対するモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリッド細胞ライン、この
ように産生される抗体、並びにこの抗体を用いる診断及
び治療法に関するものである。さらに、本発明はこれら
１群の細胞質抗原における１成分の精製、この抗原に対
するモノ特異性のポリクローナル抗体の産生、並びにこ
の抗体を使用する診断及び治療法に関するものである。

〔従来技術とその問題点〕

１９７５年に、フーラー及びミルシュタイン（ネイチャ
ー、第２５６巻、第４９５−４９７頁）は、骨髄腫細胞
とネズミの免疫牌ＩＩｆｉ胞との融会を記載している。

これらのハイブリッド細胞ライン（すなわちハイブリド
ーマ）は、親骨髄腔細胞にも免疫牌細胞にも存在しない
特性を有し、これらのハイブリッド細胞は均質（モノク
ローナル）抗体を連続的に産生ずることができる。これ
以前には、ポリクローナル血清のみが得られていた。単
一の抗原のみと反応しうる抗体を得るには、免疫化用の
高度に精製された抗原を得るために面倒な精製技術が必
要とされた。たとえ成功したとしても、これらの方法は
、ハイブリドーマ細胞ラインから産生されるモノクロー
ナル抗体のように均質かつ充分規定された抗体を与えな
かった。サイエンテイライン・アメリカン（第２４３巻
、第６６−７４頁、１９８０）におけるミルシュタイン
による論文は、ウサギ、ヤギ及びその他の実験動物にお
いて生成する慣用のボリク四−ナル・モノ特異性抗体に
比較したモノクローナル抗体の利点を要約している。各
種の抗原に対するモノクローナル抗体の産生については
、現在多くの化学的文献が存在する。幾つかの文献は、
モノクローナル抗体の産生及び使用につき一連の論文を
含んでいる〔たとえば、カレント・トピックス・イン・
マイク田バイオロジー・アンド・イミュノロジー、第。

８１巻、「リンパ球ハイブリドーマ」、エフ・メルヒエ
ルス（Ｆ　、　Ｍ＠ｌｃｈ＠ｒｓ　）、エム・ボッター
（Ｍ、　Ｐｏｔｔ＠ｒ　）及びエフ・ワーナー編（Ｎ、
Ｗａｒｎｅｒ）、スプリンガー出版社（１９７８）並び
にモノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析
における新規なデメンション、アール・ケネット（Ｒｏ
Ｋｅｎｎｅｔｔ　）　、ティー・ジエー・マツクカーン
（Ｔ。

Ｊ、　Ｍｃｋｅａｒｎ　）及びター・ビー・ベヒトール
（Ｋ、Ｂ。

Ｂｅｃｈｔｏｌ　）　編、ブレナムプレス社（１９８０
）：］。

ハハイプリドーマ成に関する概念上の基礎は現在充分に
理解されているが、任意所定の抗原に対するモノクロー
ナル抗体の産生はまだ実験段階にある。たとえば微生物
の抗原のような抗原の俣台混合物に対する抗体を作成す
るよう試みる場せ、その結果はまだ不確定である。Ｃ・
アルビカンスの場合、アクセルセン（Ａｘｅｌｓ＠ｎ　
）は７８櫨以上の異なる有力な抗原種類を識別しうると
推定している〔インフエクショナル・イミュノｐジー、
第７巻、第９４９−９６０頁、（１９７５））。この理
由で、診断及び治療目的に極めて有用な抗体を産生ずる
には、イミューノジエンの選択が重要である。

カビＣ・アルビカンスの細胞質抗原に対するモノクロー
ナル抗体の産生については、従来報告がない。事実、侵
食性カンジダ症を有する患者の血清において抗体により
識別されるカンジダ抗原の特性に関し、殆んど報告がな
されていない。本出願人による研究〔グリユー（Ｇｌｏ
ｗ）等、アメリカ′ン・ジャーナル・メデイスン、第８
４巻、第５８６−５９１頁、（１９７Ｂ））は、抗−細
胞壁マンナン抗体が恐らく重要な診断上の標識でないこ
とを確認した。何故なら、殆んどの個体は、現在又は過
去のＣ・アルビカンスによる感染とは関係なしに、その
血清中に抗マンナン抗体を有するからである。後の研究
が示すところでは、細胞質抗原は恐らく現在羅患してい
るカンジダ感染を診断する上でより重要である〔アール
・イー・ジベルソン（Ｂｙマ・ｒｏｏｍ　、　Ｒ，Ｅ、
　）及びエッチ・アール・パラフレ−（Ｂｔ＋ｅｋｌ＊
ｙ、　Ｈ，Ｒ，）、ジャーナル・クリニカル・パソロジ
ー、第６８巻、第２９−３８頁（１９７８））。最近の
研究〔ストロツクパイン（５ｔｒｏｅｋｂｉｎ＊　）、
ラーゲン（Ｌａｒｇｓｎ　）、ツバイベル（Ｚｒｖ＊ｉ
ｂ＠ｌ　）及びバラフレー、容認、Ｉｎｆ、　＆。

Ｉｍｍ、　）は、感染カンジダ症を有する患者の血清に
おいて抗体により識別される数種の抗原を確認した。４
８−５２キ四ダルトン（Ｋｄ）の抗原に対する抗体レベ
ルが、侵食性カンジダ症を有する患者、非侵食性の表在
性カンジダ症を有する患者、他の菌感染症を有する患者
及び正常な健康個体における血清で定量された。この研
究の結果は、侵食性カンジダ症を有する患者がｐ〈α０
０１のレベルにおいて、すなわち高度の有慧差をもって
比較群よりも４Ｂ−５２Ｋｄｆ白質に対し著しく高い抗
体レベルを有することを示した。

感染カンジダ症は、免疫抑制患者及び静脈カテーテルを
備えた個体において重大な臨床上の問題である〔アール
・マイエロピッッ（Ｍｙ・ｒｏｖｉｔｚ　。

Ｒ８）等、ジャーナル・クリニカル・パソロジー、第６
８巻、第２９−′５Ｂ頁（１９７７））。カンジダはし
ばしばコ四ニー発生部位から培養しうるが、血液培養物
はしばしば陰性である。治療過程はｔとえば、アンフォ
テリシンＢのような薬剤の投与を含み、これは病原体に
対しては有効であるが、しばしば重大な腎臓障害をもた
らす。したがって、医者にとって重要なことは、カンジ
ダの伝染が生じているかどうかを確認することである。

ｔことえば酵母菌症、アスペルギルス病、ヒストプラズ
マ症及びコクジオイデス症のような他のカビ病（ｆｕｎ
ｇａｌ　ｄｉｓｓａｓｅ　）の診断に役立てるには、免
疫学的方法を使用することができる〔マーアル・オプ・
クリニカル・マイクロバイオロジー、イー・エッチ・レ
ネット（Ｅ、　Ｈ，Ｌｅｎｎｅｔｔｅ　）、ニー・バワ
ース（Ａ、　Ｂａ１ｌｏｖｒｓ　）、ダブリュー・リュ
ー・ハウスラー（Ｗ、　Ｊ、　Ｈａｕｓｌｅｒ　）及び
リュー・トルラアント（Ｊ、　Ｔｒｕａｎｔ　）　編、
アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオリ
ジー（１９８０）：ｌつ免疫学的方法は、その特異性に
より診断試験において極めて重要であり、上記したよう
にモノクローナル抗体は慣用のポリクローナル抗体より
もずっと特異性である。

カンジダ症を有する患者の抗体が反応する抗原の同定及
び特性化は、たとえば、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩ
ＳＡ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ）又はラテックス膠着
のような、個体が抗原特異性の抗体を有するかどうかを
試験するための免疫学的試験を設計することを可能にす
る。陽性反応は、現在進行中のカンジダ感染を示しかつ
薬剤治療な指示するであろう。しかしながら、上記した
ように、感染カンジダ症は、その病気のｔζめ、或いは
現在進行中の治療の結果、たとえば化学治療を受けてい
る癌患者の揚台のように、免疫抑制されている患者にお
いてしばしば生ずる。したがって、カンジダに対する抗
体の検出は非実除的である。

カンジダに対する抗体検出方式に伴なう他の問題は、宿
主における免疫反応に必要とされる遅延時間である。

本発明によれば、免疫学的方法を使用して、たとえば血
清、尿、背髄液のような体液、或いは粘膜分泌物に存在
しうる抗原（抗体ではない）を検出することができる。

抗原検出法は、これら体液中に検出しうるレベルで存在
する抗原に対し特異的な抗体を必要とする。本明細書中
に記載する抗原は検出用の良好な候補である。感染カン
ジダ症を有する免疫競合性個体はこれら抗原に対し免疫
反応を示し、これら蛋白質が充分濃度で免疫系に存在し
て免疫反応を引起こすことを示している。

現在、感染カンジダ症の診断に関し抗体検出及び抗原検
出の両者につき種々の試験が科学文献に記載されている
が、現存する抗体を使用するこれら試験のいずれも、臨
床上有用となりうる積極的な信頼性及び予測価値も持た
ない。これらの試験のいずれにおいても、適切な抗原が
詳細に記載されていない。

〔発明の要点〕

本発明によれば、ドデシル硫酸ナト、リウムーポリアク
リルアミドのゲル電気泳動により藤定して、分子ｍ１２
０−１５５キレダルトン（Ｋｄ）、４８−５２Ｋｄ及び
３５−３８Ｋｄを有する一群の近縁な細胞質抗原に対す
る新規な種類ＩｇＧのモノクローナル抗体を産生しうる
細胞ラインを与える２種の新規なハイブリドーマが見出
された。このノ１イプリドーマは、ネズミの骨髄腫に融
せしたＢＡＬＢ／Ｃネズミ牌細ネズ融合細胞ハイブリッ
ドからなっている。供与体のネズミは、予めＣ・アルビ
カンスの細胞質抗原で免疫化される。これらノ１イプリ
ドーマはそれぞれＡＴＣＣＡＨＢ−８３９７及びＡＴＣ
ＣＡＨＢ−８３９８である。このように産生される抗体
は、近縁の細胞質抗原が共有する単一の決定子に対しモ
ノ特異性である。これらのモノクローナル抗体は、その
他任意のカンジダ抗原に関する他の免疫グロブリンで汚
染されていない。

さらに本発明によれば、これらモノクローナル抗体によ
り該別される蛋白質抗原の１種（４８−５２Ｋｄ）の生
化学的に純粋な調製物の製造方法も見出された。この純
粋な調製物を使用して、モノクローナル抗体と同じ５種
の抗原を識別するモノ特異性、メリク冒−ナル抗体を調
製する。得られるモノ特異性・ポリクローナル抗体を単
独で又はポリクローナル抗体と組み合せて使用すること
ができる。モノクローナル抗体とポリクローナル・モノ
特異性抗体との両者はＣ・アルビカンスの特異性抗原の
検出を可能にし、これは感染カンジダ症の診断において
重要と思われる。

本発明によるハイプリドーマ細胞ラインは、特異性Ｃ・
アルビカンス抗原の検出に対し均質かつ再現性ある新規
な試薬源（モノクローナル抗体）を提供する。この抗原
の生化学的精製は、これに対するポリクローナル・モノ
特異性抗体の産生と共に、従来技術では可能でなかった
抗原の原料及び抗体の代替源を提供する。

本発明のハイブリドーマ細胞ラインは、ネズミをＣ・ア
ルビカンスの細胞質抽出物で免疫化し、肺細胞を取り出
してその懸濁物を作ることにより作成される。これら牌
＃Ｉ胞を融合促進剤の存在下でネズミの骨髄腫細胞と融
合させる。融合細胞を希釈して、非融合骨髄腫又は肺細
胞を支持しない培地中において別々の穴部で培養する。

各穴部における上澄液を、Ｃ・アルビカンスの細胞質抗
原に対する抗体の存在につき測定する。Ｃ・アルビカン
スの細！Ｍ！ｌ質抗原３５−１８Ｋｄ、　４８−５２Ｋ
ｄ又は１２０−１’５５Ｋｄと反応する抗体を産生ずる
ハイブリドーマを選択して、これをクローン化する。抗
体をこのクローンの上澄液から回収する。

或いは、これらクローンをネズミの腹腔内に移植し、そ
して得られた所望の抗体を含有する悪性腹水又は血清を
回収する。

Ｃ・アルビカンスの５５−３８Ｋｄ、　４８−５２Ｋｄ
又は１２０−１３５Ｋｄの細胞質抗原に対するポリクロ
ーナル・モノ特異性抗体の製造方法も提供される。動物
をこれら抗原の１楓の生化学的に純粋な調製物で免疫化
し、そしてポリクローナル抗体を動物の血清から回収す
る。

モノクローナル抗体を作成するための病原性カンジダ種
の部分精製された細胞質抗原の製造方法も提供される。

真菌類の菌糸又は酵母の細胞質抽出物を親和性クロマト
グラフィーにより分画して、細胞壁マンナン、グリカン
及びマンノ−／グルコー蛋白質複合体を除去する。さら
に、マンナン除去された抽出物をさらにイオン交換りｐ
マドグラフィーにより分画する。溶出液の７ラタシヨン
を、ハイプリドーマの生成につき使用される肺細胞を有
する動物供与体を免疫化するために選択する。

さらに、七ツクｐ−ナル又はモノ特異性・ポリクローナ
ル抗体を作成するための病原性カンジダ種の生化学的に
純粋な細胞質抗原の製造方法も提供される。菌糸又は酵
母のマンナン−除去された細胞質抽出物を前記と同様に
イオン交換クロマトグラフィーにより分画する。溶出液
のフラクションを選択する。その成分蛋白質をゲル電気
泳動により分離する。所望の抗Ｗ、種類をほぼ純粋な形
で含有する分子量帯域を選択する。

〔発明の目的〕

したがって本発明の１つの目的は、Ｃ・アルビカンスの
６種の近縁な１群の細胞質抗原に対する抗体を産生じ、
したがってカンジダ感染症の免疫診断において有用なハ
イプリドーマを提供することである。

さらに本発明の他の目的は、イミューノジエンの部分′
ｌｉ１製方法及びこのイミューノジエンを使用してこれ
らハイブリドーマを作成する方法を提供することである
。

本発明の他の目的は、Ｃ・アルビカンスのこの細胞質抗
原群に対し実質的に均質な抗体を提供することである。

さらに本発明の目的は、モノクローナル抗体を作成する
ための病原性カンジダ種の部分精製された細胞質抗原の
製造方法を提供することである。

本発明の他の目的は、この精製蛋白質を使用してモノ特
異性・ポリクローナル抗体を作成しうるような、病原性
カンジダ種の細胞質抗原の生化学的精製方法を提供する
ことである。

本発明の他の目的は、この精製蛋白質を使用してモノ特
異性・ポリクローナル抗体を作成しつるような、病原性
カンジダ種の細胞質抗原の生化学的精製方法を提供する
ことである。

さらに本発明の他の目的は、Ｃ・７゛ルビカンスの所定
の細胞質抗原に向けられなモノクローナル及びボ９　？
　Ｈ−ナル・モノ特異性の抗体を使用する病気の診断若
しくは治療方法を提供することである。

〔発明の説明〕

本発明の他の目的及び利点は、以下の記載から明らかと
なるであろう。

バイブリドーマは、全般的にコーラ−（Ｋｏｈｌａｒ）
及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｌｎ　）の方法〔ネ
イチャー、第２５６巻、第４９５−４９７頁〕にしたが
って作成された。Ｃ・アルビカンス細胞質抗原の部分精
製されたマンナンを含まない調製物でネズミを免疫した
後、この免疫化牌細胞をネズミ骨髄腫細胞ラインと融付
させ、そして得られたハイブリドーマを免疫化に使用し
た部分精製抗原調製物に反応する抗体につきスクリーニ
ングした。感染カンジダ症を有する患者からの抗体によ
り専ろ識別されることが従来判明している抗原〔ストロ
ツクパイン、ラーゲン、ツバイベル及びバラフレー、Ｉ
ｎｆ、　＆、　Ｉｍｍ、　）に対する抗体を産生ずるこ
れらのハイプリドーマを同定するため、陽性ハイブリド
ーマを免疫沈澱によりスクリーニングした。

この抗原に対する抗体を産生ずる２種のハイプリドーマ
を次いでクローン化しかつ特性化した。さらに、これら
のモノクローナル抗体は他の２種の近縁な細胞質抗原が
共有する決定子を識別することが判明した。したがって
、２種のハイブリドーマラインを、次いで単離し、これ
らはＣ・アルビカンスの５種の近縁な細胞質わＬ原群を
品別する。

免疫学上重用な抗原の同定は、モノクローナル抗体を生
成させる前に、これらの方法を成功させるのに重要なフ
ァクタであった。しかしながら、特に部分精製されたイ
ミューノジエンについては所望の抗体を生成させ得ない
と推定される。さらに、モノクローナル抗体は、上記の
全ての利点を用するが、しばしばポリクローナル抗体に
伴なわない限界を有する。このため、ポリクローナル・
モノ特Ｍ性抗体の作成にイミューノジエンとして使用す
るための明らかに生物学上純粋な抗原の製造を可能にす
るような方法を誘導した。このイミューノジエンを精製
するのに必要とされる一連の完全な精製工程の方法は、
従来存在しなかった。

モノ特異性ポリクローナ〃抗体を産生ずるため、この均
質なイミューノジエンが使用されていた。

これは、さらにモノクローナル抗体の産生に対する有効
なイミューノジエンにもなりうる。

本発明のハイプリドーマの製造方法は一般に次の工程か
らなっている： ＢＡＬＢ／ｃネズミを、ネズアルビカンスの細胞質抽出
物から精製した抗原で免疫化した。この抗原は、Ｃ・ア
ルビカンスからの菌糸相の細胞を機械破壊して作成した
。次いで、得られた細胞質抽出物を遠心分離して細胞壁
、膜及び＃Ｉ飽内機能質を除去し、次いで親和性クロマ
トグラフィー及びイオン交換り四マドグラフィーにより
分画した。

抗原精製法の詳細な記載は、後記実施例１のＡ部に示す
。Ｃ・アルビカンス並びに他のカンジダ植の酵母相細胞
からの細胞質抽出物も抗原の製造に使用しうると思われ
る。さらに、他の細胞破壊技術及び分画技術を使用して
、この抗原を製造しつると信じられる。ＢＡＬＢ／ｅネ
ズミはハネズリドーマを作成するのに適する−の免疫牌
細胞を生成すると判明したが、他の種類のネズミも使用
しうると思われる。免疫化法及び抗原の濃縮は、有効−
の適当に予備処理した牌細胞を生成しうるようなものと
すべきである。次の免疫化法が有効であると判明した。

５７〜５０μｔの蛋白質を０．４３．１５７及び２４７
日目に次のようにして４回桜檎した：０及び１５７日目
には不完全７０インドアジユバントにおいて皮下投与に
より、４３日目間はアラムにて腹腔内投与により、さら
に２４７日目には食塩水にて腹腔内に投与した。最終免
疫化の４日後に、ハイプリドーマを作成するためネズミ
を殺した。

肺臓１個当り約６−の培地で充分である。これら実験技
術は周知されており、免疫学における基確約実験法に関
する雑誌及び書物に記載されている。

好適融合促進剤はポリエチレングリコール１０００（平
均分子量１０００−４０００、ＰＥＧ１０００として市
販されている）であるが、他の融合促進剤も使用するこ
とができる。好適融合技術は付着性単一層において骨髄
腫細胞と牌細胞とを用いて行なわれるが、当朶界で知ら
れた他の融合技術（たとえば、懸濁若しくはペレット融
合技術）も使用することができる。最適な細胞比は、骨
髄腫細Ｈａ　１個当り約２〜３個の牌細胞であるが、こ
の比は牌細胞源又は骨髄腫細胞自身に応じてそれより大
きくても小さくてもよい。多くのネズミ骨髄腫細胞ライ
ンが知られており、一般に学術団体或いはたとえばメリ
ーランド州・ロックビル在・アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションのような種々の寄託機関から入手
することができる。好ましくは、使用する細胞ラインは
、いわゆる「薬剤耐性」型のものとすべきである。これ
は、非融合骨髄腫細胞が選択培地中で生存せず、ハイブ
リッドが生存するので望ましい。最も一般的な種類は８
−アザグアニン耐性の細胞ラインであって、酵素ヒボキ
サンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラ
ーゼを欠如し、したがってＨＡＴ（ヒボキサンチン、ア
ミノビテリン及びチミジン）培地により支持されない。

さらに、使用する骨髄腫細胞ラインはいわゆる「非分泌
」振（たとえば骨髄腫細胞自身が抗体を産生じないもの
）とするのが一般に好適であるが、分泌型のものも使用
することができる。しかしながら、成る棟の場合には、
分泌型の骨髄腫ラインが好適である。

この選択培地は薬剤耐性（たとえば８−アザグアニン耐
性）の非融合骨髄腫細胞を支持しない。

この選択培地は、非融合骨髄腫細胞を死滅させうるのに
充分な時間（約７−１０日間）融甘さぜた後に使用され
る。非融合骨髄腫細胞は悪性でないため、所定数のみの
世代を有し、７−１０日後には増殖しなくなり最終的に
死滅する。他方、融合細胞は、悪性の骨髄腫源を有しか
つ選択培地において生存する牌細胞の能力を有するので
増殖し続ける。したがって、融合後、これら細胞を選択
培地（たとえば、）ＩＡＴ培地）に再懸濁させて、これ
を別々の容器（たとえば、９６穴のミクロ測定板の各穴
部）に加える。これら細胞を所定容置の希釈剤で再懸濁
して、それぞれ別々の容器（たとえばミクロ測定板の各
穴部）において所定数の細胞（たとえば穴１個当り１〜
４個細胞）を単離すべく統計計算する。

Ｅ、ハイプリドーマを含有する各容器（穴部）使用した
スクリーニング法は、酵素結合免疫吸収分析（ＫＬＩ８
Ａ　）としたが、他のスクリーニング分析（たとえばＲ
ＩＡ）も使用することができる。

Ｆ、所望抗体を産生ずるハイプリドーマの選択による） 所望のハイプリドーマを選択しかつクローン化させた後
、得られた抗体を２種の方法の１つで産生させることが
できる。最も純粋なモノクローナル抗体は、適当な培地
において所望の７飄イブリドーマを適当な長さの時間に
わたり試験管内で培養し、次いで所望の抗体を上澄液か
ら回収することにより産生される。適する培地及び適す
る培養時間は公知であり、或いは容易に決定される。こ
の試験管内の技術は、他の抗カンジダ免疫グロブリンを
殆んど含有しないほぼモノ特異性のモノクローナル抗体
を産生ずる。培地は外因性の血清（たとえば胎児牛血清
）を含有するので、少鼠の他の免疫グルプリンも存在す
る。この試験管内の方法に対する１つの欠点は、成る目
的のための充分鼠又は充分濃度の抗体を産生じえないこ
とである。

何故なら、モノク四−ナルの濃度が僅か約５０μＶ／−
であるからである。

それより大きい濃度の僅かに純度の低いモノクローナル
抗体を産生ずるには、所望のハイプリドーマをネズミ中
に、好ましくは有性生殖の或いは生育性生殖のネズミに
注入することができる。このハイブリドーマは、抗体産
生性の癌腫を適当な培養時間後に生成し、宿主ネズミの
血流及び腹腔滲出液（腹水）に所望の抗体の高濃度をも
たらす（約５〜２０■／−）。これらの宿主ネズミはそ
の血液及び腹水中に正常の抗体をも有するが、これら正
常抗体の濃度はこれら体液における全抗体濃度の僅か約
５％である。さらに、これら正常抗体はその特異性にお
いて抗カンジダ性でないため、回収した腹水或いは血清
から得られるモノクローナル抗体は殆んど汚染性の抗カ
ンジダ免疫グロブリンを含有しない。このモノクローナ
ル抗体は高いタイターを有する（１：ｇｏ、ｏｏｏ若し
くはそれ以上の希釈率にて活性）。ハイプリドーマの生
成に使用する骨髄腫細胞ラインが「非分泌性」ラインで
ある場合、産生される全抗体はその抗原に対し反応性で
ある。「分泌性」骨髄腫源から生成されるハイブリドー
マについては、これらハイブリッド細胞により分泌され
る抗体は、牌細胞により産生される軽鎖でなく、骨髄腫
細胞により産生され軽鎖を有するであろう。骨髄腫軽鎖
を有する抗体は非特異性の「ナンセンセ」抗体であって
、抗体特異性を失なうことなく機能的に活性なモノクロ
ーナル抗体を希釈するのみである。分泌性骨髄腫ライン
を使用する場合、腹水及び血清は高比率の特異性対非特
異性の免疫グロブリンを含有する。

〔発明の実施例〕

以下、実施例により本発明を説明する。

例　Ｉ モノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７の産生 Ａ、抗原作成 カンジダ・アルビカンスの血清型Ａ、　（ハーゼンフレ
バーＢ！＋１１、ＮＩＨ）をサボー四−ドのスラント上
に２５℃にて１８〜２４時間増殖させた。

１本のスラントからの増殖物を５０ｍの液体合成培地〔
り一等、サボーロージア、第１３巻、第１４８−１５３
頁、（ｔ９７ｓ））を含有する数個のフラスコに接種し
、１５０　ｒｐｍの回転振とう機にて２５℃で１８時間
培養した。これらフラスコからの増殖物の１部（約１−
）を、１００−の上記液体培地を含有する新たなフラス
コに加え、１５０　ｒｐｍにて′５７℃で２４時間回転
した。これら細胞を遠心分離により回収し、かつ緩衝液
（０，０５Ｍ　の　ト　リ　スー）（ＣＩ（ＰＨ７，４
）　、０．０２Ｗ／マ％ＮａＮ５）で再懸濁させた。こ
れら条件下で増殖した細胞は９０％の菌糸と１０％の酵
母細胞であった。

この細胞スラリーを、ガラス正対細胞スラリーの１部１
混合物を用いてブラウンホモゲナイザにより機械的に８
分間破壊した。破壊されない細胞と細胞残骸とを１０．
０００Ｘｒにて４℃で６０分間遠心分離して除去した。

上澄液を集め、そしてベレットを上記と同様に遠心分離
により緩衝液（α０１Ｍ燐酸ナトリウム紗衝液緩衝液７
．４）において３回洗浄した。原上澄液と洗浄上澄液と
を集め、そして８０，０００Ｘｆにて４℃で９０分間遠
心分離した。この上澄液を集めて、注射器により試験管
の表面における脂質層を除き、薄し）緩衝液（（Ｌｏｏ
ｌＭのトリス−ＨＣｌ５ｐＨ７，４、α０２Ｗ／Ｖ％Ｎ
　ａ　Ｎ　３を含有する）に対して透析した。蛋白質含
有−を、ラウリー等の方法〔ジャーナル・バイオロジカ
ル・ケミストリー、第１９５巻、第２６５−２７５頁、
（１９５１））により測定した。高速度遠心分離の後に
溶１反１１に残存する物質を、菌糸相の細胞質抽出物（
ＭＣＥ）と命名した。

このＭＣＥを次いで親和性りｐマＦグラフィーにより分
冊した。ＭＣＥ、（４２−１１４η蛋白質）をコンカナ
バリンＡの親和性カラムに通して細■呂壁マンナン、グ
ルカン及びマンノ−／グルコー蛋白質複曾体を除去した
。コンＡ−セファロース４Ｂ（スエーデン国・ウプサラ
在・ファルマシア社）のカラム（５〇−床容鼠）が好ｍ
ｌである。

０．００１〜（ＬＯＩＭ濃度の改の陽イオンを含有する
ｐＨ１４５〜約１５の充填用緩衝液を使用する；Ｍｎ２
＋、Ｍ　、２＋及びＣａ２＋。好適な充填用緩衝液Ｃま
（ＬＯ５Ｍ＋７））リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）であっ
”ｃ、０．００１　ＭのＭｇＣｌ２とα００１ＭのＭｎ
Ｃｌ２と０．００１ＭのＣａＣ１！とを含有する（緩衝
液Ａ）。

Ｎ　ａ　Ｎ　３を保存料として存在させることもできる
。

未結合のマンナン除去された物質（ＭＤ−ＭＣＩ）を集
め、凍結乾燥しうるｐＨ７〜８の緩衝液に対して透析し
、かつ凍結乾燥させた。好適な凍結乾燥しうる緩衝液は
［ＬＯＯＩＭのホ炭酸アンモニウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，
４）である。カラム上に充填された約６０％の物質を未
結合フラクションとして回収した。

このＭＤ−ＭＣＥをさらにＤＥＡＥイオン交換クロマト
グラフィーにより分画した。ＭＤ　−ＭＣＩ蛋白質（８
０，７■）を流過用緩衝液（００５Ｍのトリス−ＭＣＩ
、ＰＨ７，８）に溶解させ、そしてＤＥＡＥイオン交換
カラムに加えた。ＤＥＡＥ−セフアセ／！／（ファルマ
シア社）カラム（７０ｄ床容菖）が好適である。他の適
するカチオン性の流過用緩衝液はアンモニウム、イミダ
ゾールなどを包含する。これら蛋白質を流過用緩衝液に
おける０〜（１２２Ｍ塩素イオンの直線的塩濃度勾配を
用いて溶出させた。塩素イオンの原料としてはｌＬａＣ
１が好適である。α０２８〜０．０６６ＭのＮ　ａ　Ｃ
ｌにて溶出する７ラクシヨンを集め、α００１Ｍのトリ
ス−ＭＣＩ（ｐＨ７，４）に対し透析し、蛋白質につき
分析した。これらフラクションからの蛋白質を使用して
、ハイブリドーマの生成に対するネズミを免疫化した。

第１図は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドのゲル電気泳動により分析しかつ銀技術で染色した、
α０２−α０６Ｍ　ＮａＣ１におけるＤＥＡＥイオン交
換カラムから溶出されたフラクションを示している。

雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃネズミ（フォックス・チェー
ス・インスチチューツ・フォア・カンサー・リサーチ、
ペンシルバニア州、フイラデルフイア在）を０目間に不
完全７０インドアジユバントにおいて５０μＶの蛋白質
を皮下投与しかつ４５日目にアラムにおいて５０μ２の
蛋白質をＷ腔内投与して免疫化した。１５７日目に、こ
れらネズミに不完全７ｐインドアジユバントにおいて５
７μＶの蛋白質を皮下投与して接種し、かつ２４７日目
にこれらネズミに食塩水中の５０μｔの蛋白質を腹腔内
投与した。最後の免疫化の４日後（２５１日目）に、こ
れらネズミを頚動脈切除により殺し、膵臓を融合用とし
て、無菌除去した。バンクの調和塩溶液にューヨーク州
、グランドアイランド在、ギブコ社）における単一細胞
懸濁物を、無菌鉗子で牌顧を引き裂いて作成した。

０．１７Ｍの塩化アンモニウムにより氷上で１０分間分
解することにより、赤白球を除去した。未分解の牌細胞
及びＳＰ２１０−Ａｇ１４の骨髄腫細胞（シュルマン、
ネイチャー、第２７６巻、第２６９−２７０頁）を血清
を含まない培地中で激しく３回洗浄して、融合工程を阻
害する血清蛋白質を除去した。

ＳＰ２１０−Ａｇ１４骨髄腫細胞とネズミ牌細胞との細
胞融合は、マツクカーンの変法〔モノクレーナル抗体、
ハイプリドーマ：生物学的分析における新規なディメン
ション、アール・エッチ・ケネット（Ｒ，Ｈ，Ｋｅｎｎ
ｅｔｔ　）　、ティー・ジエー・マツカーン（Ｔ、　Ｊ
、　Ｍｅｋｓａｒｎ　）及びター・ピー・ベヒトール（
Ｋ、　Ｂ、　Ｂ＠ｃｈｔｏｌ　）編、プレナムプレス社
、第３６８−５６９頁、（１９８０）及びゴバラクリシ
ナン（Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ　）、ジャーナル
・セル・パイオルジー、第８５巻、第４４８ａ頁（１９
７９））にしながって行なった。細胞を、コンＡ被覆し
た組織培養皿（マザチューセッツ州、ケンブリツチ在、
コスタ−社、Ａ３０６０）の付着性単一層において、５
０ｖ／マ％のポリエチレングリコールｊ　０００　にュ
ージャージイー升−フイリイプスプルグ在、ジエー・テ
ィー・ベーカー・ケミカルス社）と５０マ／マ％のジュ
ルペツコ改変イーグル培地（ギプコ社、ＤＭＥＭ）との
溶液に５０〜４５秒間鱈出し融合させた。これら細胞を
。骨髄腫細胞１個に対し２〜３個の牌細胞の比率にて混
合し、７〜１０Ｘ１０７個の全細胞を各融合皿に加えた
。これら融合血は、組織培養皿を１５η／ｍｅのコンＡ
（カリフォルニア州、ラグモー２在、カルビオヘムーベ
ーリング社）を含有するａＩＭ（７）酢酸ナトリウム（
ｐＨ４，８）１−及び５０岬／ｓｎｔのカルボジイミド
（カルビオ７工ムーベーリング社）を含有する０、１Ｍ
の酢酸ナトリウム（ｐ　Ｉ（４，８）　１−と共に揺動
台上で室温にて１時間培養することにより作成した。次
いで、これら皿をバンク調和塩溶液（ギブコ社）で５回
洗浄し、使用するまで一２０℃にて空貯蔵した。

細胞融合の後、これら細胞をＨＡＴ培地（２０マ／マ％
の胎児牛血清（ペンシルバニア州、デンバー在、ダツチ
ランド・ラボラドリース社）を含有する４、　５　ｔ　
／ｌのグルコース、１３．６μ２／ゴのヒボキサンチン
（カルビオヘムーベーリング社）、ｉｓμｊ’／ｍｔの
ナトリウムメトトレキセート（カルビオヘムーベーリン
グ社）、５．８７ｐｆ／ｌｄのチミジン（カルビオヘム
ーベーリング社）、０．２２’　５μＬ／−のグリシン
〔オハイオ州、クリー−ｊランド在、工ＣＮニュートリ
ショナル・バイオケミカルス社）、α１５岬／−のオキ
ザル酢酸塩（ミズリー州、セントルイス在、シグマ・ケ
ミカルス社）、［ｌＬｏ５ＷＩｇ／−のピルビン酸塩（
シグマ社）、α２Ｕ／−の牛インシュリン（シグマ社）
、α８ミリそのグルタミン（バージニア州、マツクリー
ン在、７四−・ラボラドリース社）、ｓ　ｏ　ＩＵ／ｍ
！、のペニシリン（７ｏ−社）、及び５０μｔ／ｌａｐ
のストレプトマイシン（７０−社）を含むＤＭＥＭ）に
おいて３７℃で５％のＣＯ２と共に湿潤雰囲気中で培養
した。融合してから７〜１０日後、細胞をＨＴ培地（１
０マ／マ％の胎児牛血清のみを含有し、ナトリウムメト
レキセードを含まないＨＡＴ培地）に移して、さらに培
養しかつクローン化した。融合してから約２〜３週間後
、ハイプリドーマを含有する培養物からの上澄液１００
μｔを取り出し、そしてカンジダ特異性の抗体につきス
クリーニングした。

細胞培養物上澄液を、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳ
Ａ　）により特異性抗体につきスクリーニングした。こ
の分析は、９６大の組織培養板（コスタ−社、＋１ｆｌ
ｔ５５９６）をα０１５Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９６）
における部分精製したカンジダ蛋白質の１μ２／−溶液
５０μｔで４℃にて１晩被覆して行なった。これらプレ
ートをα０１５Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ９，６）にお
ける牛血清アルブミンの３　ｗ／マ％溶液２００μｔに
より４℃にて１晩ブロツクした。上澄液を取り出し、プ
レートをα８　ｗ／マ％のＮ　ａ　ＣＩとα０５　ｗ／
ｖ％のツイーン２０（ＰＢＳＴ）とを含有するα０５Ｍ
の燐酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）で４回洗浄した。西洋
ワサビペルオキシダーゼでｍＭした抗ネズミＩ　ｇＧ＋
Ｉ　ｇＭ（ａ＋Ｌｍ）（メリーランド州、ガイサースプ
ルグ在、カーケガード・アンド・ベリー・ラバラドリー
ス社）の１μ２／−溶液５０μｔを各穴部に加えて、６
７℃で３時間培養した。この第２の抗体を取り出し、プ
レートを上記と同様に洗浄した。

１００μｔの基質（０，０２％Ｈ２Ｏ２を含有するＬＩ
ＬｌＭのクエン酸塩緩衝液ｐ　Ｈ４，０におけるα２ミ
リＭの２．２′−アジノージ（６−ニチルベンズチアゾ
リンスルホネート）（シグマ社））を各穴部に加え、そ
して室温で３０分間反応させた。抗体を含有する穴部を
肉眼観察した。

陽性のハイブリッドを増殖させ、抗体産生につき再試験
し、そして制限希釈により２回サブクローン化した。腹
水は、プリスティン（ウィスコンシン州、ミルウオーキ
ー在、アルドリッチ・ケミカル社の２．４１０．１４−
テトラメチルペンタデカン）において１０７個のハイプ
リドーマ細胞の腹腔内注射により（ｓ　ｏ　ｏ　ｔ、　
）で予備処理したＢＡＩ、Ｂ／Ｃネズネズら作成した。

腹水及び血清を集め、８００Ｘｆでの遠心分離により清
澄化させ、−８０℃にて貯蔵した。免疫グルプリンＧ（
ＩｇＧ）を、半飽和の硫酸アンモニウム（ｐ　Ｈ７，０
）による沈設に続き、０．０４　Ｍの燐酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ＆８）で透析して培養上流液から作成した。腹水と血
清と濃厚培養上減液とを試験して、下記例２に記載した
ようにそれらの反応性につき特性化した。検体、すなわ
ちモノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７を標準技術
（ミズウリー州、ケンシントン在、リットン・ピオネテ
ィックス社の特異性抗体による免疫拡散）により、Ｉｇ
Ｇ１鎮とカッパＫ）軽鎖との両者であることが示された
。

検体のハイプリドーマ細胞ラインは、メリーランド州、
ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに１９８３年１１月１日付けで寄託した。検体
細胞ラインにはＡＴＣＣＡＨＢ−８３９７及びＡＴ　Ｃ
ＣＡＨＢ　−８５９８カそれぞれ付与された。

例　１■ 中　法度化法 Ｃ・アルビカンスからの部分精製した蛋白質〔例ＩのＡ
部に記載したようにＤＥＡＥカラムから１：１．０２　
ｖ／ｖ％ＮａＮ５を含む０．０５　Ｍのトリス−ＨＣＩ
（ｐＨ７，８）における０、　０２８〜０．０６６　Ｍ
のＮａＣ１で４出させた蛋白質〕の沃素化は、法度化技
術〔プレーカー及びスペック、）ぐイオケミカル・バイ
オフイジオロジカル・リサーチ・コミューニターション
、第８０巻、第８４９−８５７頁（１９７８））により
行なった。２００μｔのり四ロホルムに溶解したイオド
ゲン〔イリノイ州、ロック７オード在、ピアス・ケミカ
ル・カンノくニー社、１．５．４．６−チトラクロ／Ｉ
／−３α、６α−ジフェニルグリクリル〕１０μ２をＭ
ｍなガラス壜（平底）の表面上に蒸着させた。カンジダ
蛋白質（０，１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）　２０
０１１　Ｌ中２００μ？〕とαｌＮＮａＯＨにおける１
　ｍＣｉヒａＩ”〔マサチューセッツ州、ポストン在、
ニューイングランド、ヌクレア社〕とをこの境に添加し
、そして定期的に回動させながら室温にて１時間培養し
た。標識した蛋白質をＧ−２５セフアデツクス（ファル
マシア社）カラム（１０Ｘ２００ｄ）を通すゲルア過に
よって未反応沃素から分離した。

ゼラチン燐酸塩緩衝液（Ｅｌ　２　ｖｒ／ｖ％ゼラチン
と１０２　ｗ／ｖ％ＮａＮ３とを含有するα１Ｍの燐酸
塩緩衝液ｐ　Ｈ７，４）を平衡化及び流過用緩衝液とし
て使用した。排出したピーク（標識蛋白質）を集め、−
８０℃にてこれら部分を貯蔵した。

（１１）免疫沈澱 ケスラーにより実質的に記載されたように免疫沈澱も行
なった〔ジャーナル・イミュ・ノロジー第１１５巻、第
１６１７−１６２４頁（１９７５））。

洗浄用緩衝液はＲＩＰＡとした（ａｏｌＭのトリス−Ｈ
ＣＩ（ｐ　Ｈ７，４）、０．５　Ｍ（７）ＮａＣ１，０
，００１Ｍのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）
、ｔ　Ｏｗ／ｖ　％　の　ト　リ　ト　ン　Ｘ−１００
、ｔ　Ｏｗ／ｖ　％　のデスオキシコール酸ナトリウム
、０．１　ｗ／ｖ％のドデシ／ｌ’硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）及び０．０２　ｖ／マ％のＮａＮ５）。標識され
九拍原抽出物を、熱滅菌しかつホルマリン処理したＳ・
アウレウス・コーアンＩ（ＳＡＣ）（パンソルビン、カ
ルビオヘムーベーリング社）の１０Ｗ／マ％懸濁液８ｄ
からのペレットに加えて予備清澄させた。抗原とＳＡＣ
とを氷上で定期的に回動しながら１時間培養し、そして
細菌を遠心分離により除去した。次いで、標識した抗原
〔予備清澄された毎分１〜５　Ｘ　１０’のトリクロル
酢酸−沈澱性カウント）を、１００μＬの硫酸アンモニ
ウム−濃厚モノク四−ナル上澄液、ハイブリドーマを有
するネズミからの血清１０μＬ又はハイブリドーマを有
するネズミからの腹水１０ｐＬに加えて４℃で１８時間
培養した。

第２の抗体（ウサギ抗−ネズミＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇ
Ａ、カルビオヘムーベーリング社）の５μｔを各試験管
に加え、４℃で１８時間培養した。過剰の５ＡＣ（５０
０μｔ）を加え、さらに４℃で２時間培養した。遠心分
離により細菌を築め、そしてＲＩＰＡ緩衝液で４回洗浄
した。次いで、ベレットを２×電気泳動試料緩衝液に再
懸濁させ、レムリーにより記載されたような５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（８ＤＳ−ＰＡＧＥ）〔
ネイチャー（ＵＳＡ）第２２７巻、第６８０−６８５頁
（１９７０））の準備をした。遠心分離により細菌を除
去し、そして上澄液を５ＤＳ１２Ｗ／マ％ポリアクリル
アミドゲルに加えた。免疫沈澱物の電気泳動の後、これ
らゲルを固定化し、かつクーマシー青（１０マ／マ％メ
タノール、１０マ／マ％酢酸及び８０マ／マ％蒸留水に
おけるクーマシー青Ｇ２５０の０．５　ｗ／マ％溶液）
で４５分間染色し、染料を含まない上記溶剤にて染色除
去し、５戸紙上で乾燥させ、そしてデュポン・クロネツ
クス・ハイ−プラス強化スクリーン（プラウエア州、ウ
イルミントン在、デュポン・インストルーメンツーＡＣ
Ａ社）を用いて又は用いずにコダックＡＲ−５フィルム
にューヨーク州、ロチニスター在、イーストマン・コダ
ック社）に露出した。この実験からのデータを第２図に
示す。

例ｎＩ モノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７の反応性を、
カンジダ症を有する患者の血清における抗体の反応体と
、スタフＡ免疫沈澱により比較した。ヒト抗体に対する
標識抗原及び免疫沈毅法は、例■に実質的に記載したよ
うに行なった。これら方法における相違点は、５μｔの
ヒト血清を毎分ｌＸ１０６のトリクロル酢酸−沈澱性カ
ウントの工１２ｍ−標織した抗原と共に培養しかつ抗ネ
ズミの第２抗体を省略した点である。５１種のヒト血清
を分析した。これら血清を次のような４群に分割した： ｔ　深部組織、すなわち感染カンジダ症。

これらの血清は深部組織、すなわち感染カンジダ症を有
すると診断された患者からのものとした。

この診断の基準は、（１）血液からのカンジダｓｐｐ。

の反復単離（２４時間に１回以上分離される）、（１１
）正常な無菌体液（尿を除く）からの或いは深部組織侵
食から無菌的に得られるカンジダｓｐｐ。

の単離、（ｌｉｌ）非無菌表面と接触しない深部組織侵
食の組織学的証明、又はＧｖ）典型的なカンジダ症の視
鏡所見とカンジダ感染症に一致する臨床状態とを伴なう
肉眼球炎を含む。この群には、局部的な侵食性カンジダ
症を有する患者からの２種の血清と、Ｃ・パラプシロシ
ス（Ｃ−ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｇ）による心内膜炎を
有する患者からの２４４１の血清とが含まれた（２５種
の血清を群１に入れた）。

λ　非侵食性カンジダ症。

これらは、血清を抜き取った際に感染カンジダ症を発生
する危険があるが、明らかに感染していない患者からの
ものとした。この群における患者は、その素質状態とし
て手術、やけど、俊又は癌を有した。カンジダｓｐｐ、
をこれら患者の粘膜表面及び尿から分離した（１０種の
血清を群２に入れた）。

五　他の菌感染症。

これらの血清は、ヒストプラスマ・カブスラツム（Ｈｌ
ｓｔｏｐｌａｓｍａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ　）、クリ
プトコツカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｅｅ
ｕ＠ｎｓｏｆｏｒｍａｎｓ）、コツキジオイデス・イミ
チス（Ｃｏｅｅｉｄｉｏｉｄｓｓｉｍｍｉｔｉｍ　）及
びアスペルギルス・スベシース（Ａｍｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ　ｓｐｐ、　）に基づく菌感染症を有する患者からの
ものとした（１０種の血清を群５に入れた）。

４、　正常な健全個体。

これらの血清は、健全な入院してない男女からのものと
した（６種を群４に入れた）。

第３図は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画された免疫沈澱
物の放射能写真を示す。４Ｂ−５２Ｋｄの見かけ分子短
をもって移動する免疫沈澱帯域を切除し、Ｉｌｓをｒカ
ウンターで計数した。この分析の結果を第４図に示す。

例　■ 明らかな生化学的均質性までの４８−５２Ｋｄ産生 Ａ、菌糸細胞質抽出物（ＭＣＥ）の作成は例Ｉに記載し
た通りである。

１１４ＷＩｇの蛋白質）を例１−Ａと同様にコンカナバ
リンＡ親和性カラムに通した。結合しない物質、たとえ
ばマンナン除去された成分を集め（２−７ラクシヨン）
、２８０ｎｍにおける光学密度を分光光度法により測定
した（ボッシュ・アンド・ロブ社、ニューヨーク州、ロ
チェスタ）。マンナン除去された物質を集め、凍結乾燥
しうるｐＨ約７〜約８の緩衝液に対し透析し、そして凍
結乾燥した。

好適な凍結乾燥しうる緩衝液はα００１Ｍの（ＮＨ４）
ｚＨｃＯｓ　（ｐ　Ｈ７，４）である。コンカナバリン
Ａのカラムに充填された蛋白質の約６０％を未結合７ラ
クシヨンとして回収し、これをコンＡの存在下で交差免
疫親和電気泳動法によりマンナンの存在につき試験した
。未結合物質が検出しうるマンナンを含有した場合、こ
の試料を単味のコンＡ　ｄＢカラムに再び通した。この
カラムは、結合マンナンを緩衝液Ａにおける０、０５モ
ルのα−メチルアンノシド（アルドリッチ社）で溶出さ
せた後に緩衝液Ａのみにより数回溶出させて書生した。

マンナン除去した細胞質抽出物（ＭＤ−ＣＥ）１５２キ
／蛋白質を、約ｐＨ６，５にて緩伽能力を有する緩衝剤
で約０．０５　Ｍの緩衝イオン濃度に平衡化したカルボ
キシメチルセルロース（ｒｃＭＪ）イオン交候カラムに
通した。０．０５　Ｍのイミダゾール（ｐ　Ｈ６，５）
が好適である。他の有用なアニオン性緩抽剤は酢酸塩、
バルビッール酸塩、クエン酸塩、燐酸グリシンなどを包
含する。ＣＭ−セファカラム力ラムが好適なカルボキシ
ルメチルセルロースカラムである。非結合物質ライミダ
ゾール緩衝液によりカラムから洗浄除去し、そして０〜
α５ＭＮａＣｌの濃度勾配を用いて結合蛋白質を溶出さ
せた。ナトリウム若しくはカリウムの他の塩も使用する
ことができる。非結合物質及びＮ　ａ　Ｃｌ濃度勾配の
最初のピークをアミコン濾過により濃縮し、次いで１２
％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離
の後、ゲルを蒸留水で洗浄し、そして氷冷した０２５　
ＭのＫＣＩ／１ミリＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）
によりバンドが不明瞭になるまで染色した。適切な分子
風のバンドを切り取って、これをテフロンチューブ内に
入れ、ここで洗浄しかつ２回染色除去し、次いで氷冷し
た１ミリＭＤＴＴにおいて２０分間培養した。５ゴの溶
出Ｖ衝液（５ミリＭ　ＤＴＴ。

α　１５　ミ　リ　Ｍ　の　ＮａＣ１、α　１　ミ　リ
　Ｍ　の　ＥＤＴＡ。

０．０５Ｍ（７））す７．−ＨＣｌ並びに０．１％ＳＤ
Ｓ及びＰＭＳＦ　１ミリＭ）をチューブに加え、そして
乳棒を用いてこのゲルを破砕した。蛋白質をゆっくり攪
拌しながら室温で２時間溶出させ、次いで４℃にて１晩
置いた。この物質を５００　Ｏｒｐｍにて−２℃で１５
分間遠心分離することにより、アクリルアミドを沈澱８
ＤＳとの両者を単離蛋白質から分離した。５Ｄ８−ＰＡ
ＧＥ分析を行なって、蛋白質純度を検査した。第５図は
、製造用ゲルから溶出させ、次いでウサギ接種に使用し
た蛋白質について行なった８ＤＳ−ＰＡＧＥの例を示し
ている。これらのゲルをグマシー青Ｇ２５０で染色する
。分子斑標準は右側の帯であり、左側の帯は精製した４
８−５２Ｋｄの蛋白質を含む。

Ｃ１抗体産生 ニューシーラント産の白色ウサギ（体重５ｉｃ９）を使
用して、４Ｂ−５２Ｋｄｆ白質に対する抗体を産生させ
た。不完全フ四インドアジパントにおける２００〜５０
０μりの蛋白質を最初に皮下注射した後、不完全フロイ
ントアジバントにおける１５０μｍの蛋白質を２週間毎
に３ケ月間注射し、次いで毎月１回注射した。これらウ
サギを毎週出血させて、抗体レベルをロケット免疫電気
泳動により測定した。

スタフ免疫沈澱は、Ｃ・アルビカンスの３７℃ハイファ
ル高速度上澄液調製物のパルス標誠したＬ−（Ｃ１４）
シイシン溶解物（ＰＬＬ　）につき行なつた〔アーレン
ス等、ジャーナル・ジェネラル・マイクジバイオロジー
、第１２９巻、第１１３′５−１１３９頁（１９８５）
）。２００μＬのＰＬＬを１００ＰＬの正常ＩｇＧと共
に５７℃で１５分間培養することにより予備清浄した。

５００μｔのスタフＡを混合物に加え、６７℃で１５分
間及び４℃で６０分間培養した。遠心分離後、上澄液を
デカントし、そしてこれを６００μｔのスタフＡ及び１
ミリＭの弗化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）に
加え、そして３７℃で１５分間及び４℃で６０分間培養
した。この物質を遠心分離し、インターテクニック３０
００ＳＬ型の液体シンチレーションカウンターで計数す
ることにより全分解物を毎分測定した。分析に使用した
免疫グロブリンは、４Ｂ−５２Ｋｄｆ白質を接種したウ
サギからのものとした。４ＴＩｗの免疫グロブリンを５
０ｐＬの予備清浄したＰＬＬに加え、そして３７℃で１
５分間及び４℃で１２時間培養した。５００μＬのスタ
フＡ及びＰＭＳＦを加え、次いでこの物質を遠心分離し
、上澄液を計数し、そしてベレットを緩衝液で洗浄した
。ペレットを電気泳動緩衝液に再懸濁し、そしてレムリ
により記載されたように５Ｏ８−ＰＡＧＥの準備をした
〔ネイチャー（ＵＳＡ）、第２２７巻、第６８０−６８
５頁（１９７０））。遠心分離により細菌を除去し、そ
して上澄液を５ＤＳ１２Ｗ／ｖ％ポリアクリルアミトゲ
〃に加えた。免疫沈澱物の電気泳動の後、ゲルを固定し
、クーマシー青〔１０マ／マ％メタノール、１０ｖ／マ
％氷酢酸及び８０マ／マ％蒸留水における０、　５ｗ／
ｖ％クマシー青Ｇ２５０：ｌで４５分間染色し、染料を
含まない上記溶剤中で脱色し、１紙で乾燥させ、そして
デュポン・クロネンクス・ハイ−プラス強化スクリーン
〔プラウエア州、ウイルミントン在、デュポン・インス
トルーメンツーＡＣＡ社〕を用いて又は用いずにコダッ
クＡＲ−５フィルム〔ニューヨーク州、ロチニスター在
、イーストマン・コダック社〕に露出した。

この実験からのデータを第６図に示す。

例　■ プチド地図 免疫沈澱により同定され九１１２６標識した蛋白質抗原
の制限蛋白分解切断を、クリープランド等により実質的
に記載されたように行なった〔ジャーナル・バイオレジ
カル・ケミストリ・−１第２５２巻、第１１０２−１１
０６頁（１９７７））。小力の刃を用いて乾燥ゲルから
バンドを切り取り、蒸留水中７　ｖ／ｖ％氷酢酸の溶液
中で１晩再水和した。ゲルスライスにおける蛋白質の切
断法は、０．１５μ？　（０，１０Ｕの酵素活性）のＳ
・アウレウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ　）　Ｖ　８プロテ
アーゼ（マイルス・ラボラドリース・エルトハルト社）
を用いて行なった。基質（１１２ｍ標識蛋白質）及び酵
素を、債層した分離ゲルの界面において４５分間培養し
た。

レムリにより記載されたように〔ネイチャー、第２２７
巻、第６８０−６８５頁（１９７０））、１５　ｗ／ｖ
％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ　−ＰＡＧＥによ
りペプチド断片を分離した。ゲルを固定し、染色し、濾
紙で乾燥させ１．がっ例■に記載したようにデュポン・
り田ネックス・／１イープラス強化スクリーンを用いて
コダックＡＲ−５フィルムに露出した。これら分析から
のデータを第７図に示す。

データの説明 第１図は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された０、０２
−０．０６Ｍ　ＮａＣｌを含有する流適用紛衝液により
ＤＥＡＩＣ−セファ七ル力ラムから溶出されたフラクシ
ョンを示している。これらフラクションにおける蛋白質
を使用して、ハイプリドーマ生成用としてネズミを免疫
化した。ゲルを銀技術により染色した。

第２図は、スタフＡ免疫沈澱を用いてモノクローナル抗
体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７により識別された■１！５標識
抗原の放射能写真を示している。部分精製したカンジダ
抗原をイオドゲン技術によりＩ１６により標識した。帯
１ａ及び１ｂはそれぞれ、免疫沈澱における抗原として
使用したｉｌ！Ｓ−標識領域Ａの蛋白質の１分間当り２
．５Ｘ１０５及び５　Ｘ　１０５のトリク四ル酢酸−沈
澱性カウントを示している。帯２〜１２はウサギ、ヒト
及びモ／り四−ナルの抗体により沈澱した抗原を示して
いる。

帯２ａ及び２ｂは、それぞれ免疫ウサギ血清により識別
された抗原の７０時間及び２４時間筋出音示している。

帯６は正常なウサギ血清により沈おされた抗原を示して
いる。帯４はＣ・パラブシロシスに基づく心内膜炎を有
する患者からの血清（Ａ６１８　）により沈澱した抗原
を示している。

帯５ａ及び５ｂはそれぞれ侵食性カンジダ症を有する患
者からの血清（Ｃ−２１）により識別された抗原の７０
時間及び２４時間鮎出音示し、帯６は正常な健全個体か
らの血清を示している。帯７及び８はそれぞれハイプリ
ドーマＡ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７を接種したネズミからの悪
性腹水により沈澱した抗原を示している。帯９及び１０
は、Ｃ・アルビカンスに対するモノクローナル抗体（Ｉ
ｇＧｘ／カッパ）を分泌する他のハイプリドーマ、或い
は不明確な特異性を有する七ツク四−すル抗体を分泌す
るハイプリドーマからの培養上澄液をそれぞれ接種した
ネズミからの悪性腹水により沈澱した抗原を示している
。帯１１及び１２は抗原及び第２抗体（ウサギ抗−ネズ
ミ）と共に培養したＳ・アウレウス細胞、並びに抗原の
みと共に培養したＳ・アウレウス細胞によりそれぞれ沈
澱させた蛋白質を示している。

第５図は、ヒト血清における抗体によりＤＥＡＥカラム
から溶出した部分精製カンジダ蛋白質のスタフＡ免疫沈
澱物の放射能写真を示している。カンジダ蛋白質は、イ
オドゲン技術により標品した。

各群における血清からの代表的放射能写真を示す。

群１は感染カンジダ症を有する患者からの血清を含み、
群２は非侵食性の表在性カンジダ症を有する患者からの
血清を含み、群６は他の菌感染症を有する患者からの血
清を含み、さらに群４は健全な入院してない男女からの
血清を含んでいる。パネルＡは１８，５〜２５時間露出
した放射能写真を示し、パネルＢはパネルＡにおける群
１からの血清の６７時間露出を示し、パネルＣはＳ・ア
ウレウス細胞のみ及び１１２５−標識カンジダ蛋白質に
より沈澱させた抗原の２１時間露出である。

第４図は、ヒト血清における抗体によりＣ・アルビカン
スの４８−５２ＫｄのＳ・アウレウス免疫沈澱を示して
いる。この抗原は、イオドゲン技術により工１２５で標
識した。データは、４８−５２Ｋｄ抗原を５Ｄ８−ＰＡ
ＧＥゲルから切り取りかつこれをγカウンタで計数して
得られた。各点は４Ｂ−５２Ｋｄ抗原につき沈澱した特
定カウントを示し、すなわち１分間当りの試料カラン）
　（ｃｐｍ　）マイナスＳ・アウレウス細胞のみのｃｐ
ｍである。肝１は感染カンジダ症又は侵食性カンジダ症
を有する患者からの２５種の血清を含む。画は局部的侵
食性カンジダ症を有する２人の患者からの血清を示し、
口はＣ・バラプシロシスに基づく心内膜症を有する患者
からの血清を示す。詳２はカンジダ症の危険性を有する
患者からの１０４４の血清を含む。

これらの患者は非侵食性の表在性カンジダ症を−ｑした
。群３は他の菌感染症を有する患者からの１０種の血清
を含む。群４は健全な入院してない男女から６種の血清
を含む。幾何平均及び平均からの標準偏差は次の通りで
ある二群１　＝　１，００α２４（２１２−９０〜４，
６９９．４５）　ｅｐｍ；群２＝１９７（ｔ０７〜５．
６５　）　ｅｐｍ　；群３３−４２２（１５〜１９．７
３　）　ｃｐｍ　；及び群４＝Ｏ（０）　ｃｐｍｏ一定
効果による変動の片側分析を用いて得られたＦ値は２０
．２７であり、これはｐ＞ｏ、ｏ　０１をもって高度に
有意である。

第５図は、製造用ゲルから溶出されかつウサギ接種に使
用した４　８　Ｋｄｆ白質のＳ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥ分
析を示している。左側の帯は４８Ｋｄｆ白質を示し、か
つ右側の帯は分子組標準を示している。

第６図は、４８Ｋｄ蛋白質に対し免疫化したウサギから
の血清のスタフ免疫沈澱の４週間放射能写真を示してい
る。全ての帯は穴１個当り毎分７０００個の分解物を含
む。帯１及び２はＣ１４−ロイシンでパルス標識した高
速度上澄抽出液の１分当り７０００個の分解物を示し、
帯３は分子濾標準を示す。帯４及び５は４８Ｋｄｆ白質
で免疫化したウサギからの血清により沈澱させた抗原を
示している。

第７図は、Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７，２梱のヒト血清並び
に４８−５２Ｋｄのカンジダ蛋白質に対し免疫化したウ
サギからの血清によって免疫沈澱させ九３種の抗原（４
８〜５２Ｋｄ蛋白質、１２０〜１５５Ｋｄ蛋白質及び３
５〜３８Ｋｄ蛋白質）の制限蛋白分解を示している。各
血清により免疫沈澱させた５種の抗原を初期ゲルから切
り取り、かつＳ・アウレウスのプロテアーゼで処理した
。酵素切断により生じた断片を１５％アクリルアミド５
ＤＳ−ゲルで分離した。主要なペプチド断片のパターン
を図示する。各帯及びその内容は次の通りである：帯１
はＳ・アウレウス細Ｂｌｌ！！のみにより沈澱した４８
−５２Ｋｄの抗原であり、帯２は侵食性カンジダ症を有
する患者からの血清（Ｃ−２１）により洗絨した４８−
５２ＫｄのわＴ、原であり、帯３は免疫ウサギからの血
清により沈澱した４８−５２Ｋ（１の抗原であり、帯４
はＣ・パラブシロシス（ｐａｒａｐｓｌｌｏｓｉｇ　）
に基づく心内膜炎を有する。勘考からの血清（Ａ６１Ｂ
）により沈澱した４８−５２Ｋｄの抗原であり、＠５は
Ｃ２Ｃ７により沈澱した４８〜５２Ｋｄの抗原であり、
帯６はＡ２Ｃ７により沈澱した４　Ｂ　−５２Ｋｄの抗
原であり、帯７はＡ６１８により沈澱した１２０〜１！
＋５Ｋｄの抗原であり、帯８はＣ２Ｃ７により沈澱した
１２０〜１５５　Ｋｄの抗原であり、帯９はＣ−２１に
より沈澱した１２０−１５５Ｋｄの抗原であり、帯１０
は免疫ウサギからの血清により沈澱した１２〇−１５５
Ｋｄの抗原であり、帯１１はＡ２Ｃ７により沈澱した１
２Ｑ−１５５Ｋｄの抗原であり、帯１２はＡ２Ｃ７によ
り沈澱した５　５−５８　Ｋｄの抗原であり、帯１３は
免疫ウサギからの血清により沈澱した５５〜５８　Ｋｄ
の抗原であり、帯１４は分子斑範囲３５−３８　Ｋｄの
瓜６１８により沈澱したダブレットの上方バンドであり
、帯１５は分子ｂ−ｘ範囲５５−３８Ｋｄの＆６１８に
より沈澱したダブレットの下方バンドであり、帯１６は
Ｃ−２１により沈澱した３５−１８Ｋｄの抗原であり、
帯１７はＣ２Ｃ７により沈澱した５５−５８Ｋｄの抗原
である。帯１及び２は４００時間の露出を示し、帯３　
ａ　〜６　ａは２２，５時間の露出を示し、帯５ｂ−６
ｂは７時間の露出を示し、帯７及び８は４００時間の露
出を示し、帯９〜１１は２１５時間の露出を示し、帯１
２及び１３ａ〜１６ａは２１５時間の露出を示し、帯１
３ｂ〜１６ｂ及び１７は９１時間の露出を示す。全ての
露出は強化スクリーンの存在下で行なった。

スタフＡ免疫沈澱を行なって、モノクローナル抗体Ａ２
Ｃ７及びＣ２Ｃ７により識別された抗原の見かけ分子量
を特性化した。第２図におけるデータは、モノクローナ
ル抗体Ａ２Ｃ’７及びＣ２Ｃ７の両者が５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより１２ｗ／ｖ％アクリルアミドゲルで測定（この
方法の説明については例Ｕ参照）ｔ、Ｔ１２０−１３５
Ｋｄ、　４Ｂ−５２Ｋｄ及び５５−３８Ｋｄの見かけ分
子量を有する３種の蛋白質の最小量を免疫沈澱させるこ
とを示している。これらモノクローナル抗体により識別
され４Ｂ−５２Ｋｄの蛋白質は、抽出物からなるこれら
７ラクシヨンの銀染色ゲルから判るように、Ｃ・アルビ
カンスの部分精製した抽出物における主要な蛋白質であ
る（第１図参照）。

モノクシ−ナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７にＪ：り識別
される３種の抗原の関係を、Ｓ・アウレウスｖ８プレテ
アーゼを用いる制限蛋白分解により検討した。この分析
による結果を第７図に示す。

５　ｉｔの抗原蛋白質（１２０−１３５Ｋｄ、　４８−
５２Ｋｄ及び５５−３８Ｋｄの蛋白質）の制限蛋白分解
切断は、これら３種の蛋白質が著量の主構造を共有する
ことを示している。さらにこのデータは、Ａ２Ｃ７及び
Ｃ２Ｃ７の両者が同じサブ群のカンジダ蛋白質を識別す
ることを示している。これら３種の蛋白質の間の共有主
構造は、２種のモノクローナル抗体により識別される抗
原決定子を規定することができる。同−若しくは類似の
主構造を有する他のカンジダ蛋白質もモノクローナル抗
体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７により識別されると思われる。

これらモノクローナル抗体の血清診断能力を、カンジダ
症を有する患者からの血清における抗体をスタフＡ免疫
沈澱により特性化して検討した（例■）。この検討のデ
ータを第５図及び第４図に示す。第４図に示したデータ
は、侵食型のカンジダ症を有する患者が非侵食性のカン
ジダ症を有する患者、他の菌感染症を有する患者又は正
常な健全個体よりも著しく高いレベル（−窓効果による
変動の片側分析を用いてｐ＜Ｏ，ｏｏｌ）の４８−５２
Ｋｄカンジダ蛋白質に対する抗体を有することを示して
いる。侵食性カンジダ症を有する２人の患者の血清にお
ける抗体により免疫沈澱させた同じ見かけ分子量の抗原
を、例■に記載したように制限蛋白分解により検討した
。これらのデータ（第７図）は、侵食性カンジダ症を有
する患者の２種の血清における抗体で識別された抗原が
モノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２Ｃ７により識別さ
れた同じ抗原であることを示している。これらのデータ
は、モノクローナル抗体がＣ・アルビカンス（ａｌｂｉ
ｃａｎｓ　）からの血清診断上重要な抗原（４８−５２
Ｋｄ）を識別することを確認した。この抗原は、他のカ
ンジダスペシースの抽出物においても検出しうると思わ
れる。何故なら、Ｃ・バラブシロシスに基づく心内膜炎
を有する患者からの血清がＣ・アルビカンスからの４８
−５２Ｋｄ抗涼を識別するからである。

４８−５２Ｋｄ蛋白質を明らかな均質性まで精製しく第
５図）、これを使用してウサギを免疫化した。得られた
モノ特異性ポリクローナル抗体の特異性につき、Ｃ１４
−標識した細胞質蛋白質の免疫沈澱により検査した。第
６図に示したように、４Ｂ−５２Ｋｄの単一バンドが免
疫沈澱された。制限蛋白分解により示すように、この４
Ｂ−５２Ｋｄ蛋白質は、モノクローナル抗体及び感染カ
ンシタ症を有するヒトの血清により沈澱したものと同じ
テアッた（第７図）。さらに、この抗血清ハ１ｓｚｓ標
識した１２０−１３５Ｋｄ及び５５−３８Ｋｄの分子鼠
を有する領域Ａの蛋白質を沈澱させ、これは上記したよ
うに４８−５２Ｋｄ蛋白質と極めて類似したペプチド地
図を有する。

本発明のモノクローナル及びポリクローナル抗体は、カ
ンジダ抗原を識別する診断用途を有する。

これらの抗体は、限定はしないが、ラテックス膠珊、放
射線免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬ
ＩＳＡ　）又はその他の適当な抗原検出方式を包含する
各種の標準分析を用いて、免疫抑制された患者における
体液の抗原を検出するのに有用であると思われる。患者
の体液を抗体と接触させ、これに結合した物質を測定す
る。

精製法につき本明細書に開示したカンジダ抗原も診断用
途を有する。従来の研究（ストロツクパイン、ラーゲン
、ツバイベル及びバラフレー、容Ｍ　、Ｉｎｆ、＆　Ｉ
ｍｍ、　）に示しだように、感染カンジダ症を有する患
者の血清における抗体はこれらの抗原を識別するのに対
し、（１）正常個体、（２）カンジダのコ四ニーを有す
るが侵食性の病気をもたない患者、及び（３）他の菌感
染症を有する患者、の血清における抗体はこれら抗原を
識別しない。たとえばＥＬＩＳＡＳＲＩＡ、ラテックス
膠着、免疫プロット分析又は他の適当な分析方式のよう
な検出刃出を使用して、上記抗原に対する抗体を検出す
ることができる。

それぞれＣ・アルビカンスの細胞質抗原に対する単一の
モノクローナル抗体を産生ずる２種のハイブリドーマに
ついてのみ記載したが、本発明はここに記載した特徴を
示す全てのモノクローナル抗体を包含すると考えられる
。

さらに本発明には、ここに説明したハイプリドーマ技術
を用いる上記モノクローナル抗体の製造方法も包含され
る。２つのハイプリドーマの例のみをここに説明したが
、当業者はここに示した免疫化、融合及び選択法にした
がって、ここに記載した反応特性を有する抗体を産生し
うる他のハイブリドーマも得ることができることが了解
されよう。公知のネズミ骨髄腫細胞ライン及び公知種類
のネズミからの牌細胞から得られた個々のハイブリドー
マはこのハイブリドーマにより産生される抗体ｉ参照す
る以外には同定しえないので、上記反応特性を有する抗
体を産生ずる全てのハイブリドーマは本発明の範囲内に
包含され、このハイブリドーマを使用するこの抗体の製
造方法も同様に包含されることが了解されよう。

本発明によるモノクローナル抗体の産生に使用するイミ
ューノジエンの部分精製は、Ｃ・アルビカンスの細胞質
抗原の部分精製により示される。

しかしながら、この新規な方法は、他の病原性カンジダ
種の細胞質抗原の部分精製についても応用できる。

本発明によるモノクローナル抗体及びモノ特異性ポリク
ローナル抗体の産生に使用するほぼ生化学上純粋なイミ
ューノジエンの製造方法をＣ・アルビカンスの４８−５
２Ｋｄ細胞賀抗原につき説明した。しかしながら、細胞
質抗原を単離するためのこの精製法は、他の病原性カン
ジダ種につし）でも応用できると信じられる。

本発明はその思想及び範囲を逸脱することなく他の特定
形態で実現化することもでき、したがって上記の説明は
本発明の範囲を限定するものでないＯ 第１図は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析しかつｉλ染色し
たｎｏ　２−（ＬＯ６Ｍ　ＮａＣ１を含有する流ｉ用緩
衝液によりＤＥＡＥイオン交換カラムから溶出させたカ
ンジダ・アルビカンスのマンナン除去された菌糸相の細
胞質抽出物の７ラクシヨンを示し、 第２図は本発明のモノクローナル抗体Ａ２Ｃ７及びＣ２
Ｃ７によりスタフ人免疫沈澱を用いて識別されるＩｔｚ
ｓ標減した抗原の放射能写真を示し、第３図はヒト血清
中の抗体により部分精製されたカンジダ（ＤＥＡＥイオ
ン交換クロマトグラフィーによる）のスタフ人免疫沈澱
からの放射能写真を示し、 第４図はヒト血清中の抗体によるＣ・アルビカンスの４
８−５２Ｋｄ抗原のＳ・アウレウス（Ｓ・ａｕｒｅｕｓ
　）免疫沈澱のプロットであり、第５図は製造用ゲルか
ら溶出されかつウサギ接種に使用する４Ｂ−５２Ｋｄ蛋
白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す略図であり、 第６図は４８−５２Ｋｄ蛋白質に対し免疫化したウサギ
からの血清のスタフ人免疫沈澱に閃する４週間の放射能
写真を示し、 第７図はＡ２Ｃ７、Ｃ２Ｃ７，２種のヒト血清及び４８
−５２Ｋｄカンジダ蛋白質に対し免疫化したウサギから
の血清によって免疫沈澱させた４８−５２Ｋｄ蛋白質、
１２０−１３５Ｋｄ蛋白質及び３５−３８Ｋｄ蛋白質の
制限蛍白質分解を示す略図である。

１ｏ１ｂ　ｔａ２ｋ　３　４６ａ６ｂｌＳ　７１１１１
１０日−８１ＦＩＧ、　５ Ｓ　４３’、、、２．　１ 第１頁の続き ＱＩｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理１優先権主張
　０１９８４１？１月１６日［相］米国（Ｕ　Ｓ）［相
］二〇発　明　者　マイケル・ティー・ラ　アメリカ合
衆−ジエン　スト・モント ＠発明者　ナンシー・エイ・スト　アメリカ含塵ロック
バイン　ン４９００アバー 国ペンシルベニア州フィラデルフィア、イーゴメリ・ア
ベニュー１４２９ 国メリランド州ベセズダ、バッテリー・レイトメント３
０１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ネズミ骨髄腫ラインと、予めＣ・アルビカンス
   （ａｌｂｉｃａｎｓ　）の細胞質抗原により免疫化され
   たネズミとからの細胞の融合により形成されたハイプリ
   ドーマによって産生される種類ＩｇＧのモノクローナル
   抗体において、 ８ＤＳ−ＰＡＧＥにおける見かけ分子社１２０−１３５
   Ｋｄ、　４８−５２Ｋｄ及び３５−３８Ｋｄを有するＣ
   ・アルビカンスの細胞質抗原と反応し、上記見かけ分子
   −を有するＣ・アルビカンスの細胞質抗原により共有さ
   れる単一の抗原決定子に対しモノ特異性であり、かつ その他任意のカンジダ（Ｃａｎｄ１４ａ　）抗原に対し
   て向けられる他の免疫ブレプリンで汚染されていなこと
   を特徴とするモノクローナル抗体。 （２）　ＩｇＧｘ、カッパ型である特許請求の範囲第１
   項記載のモノクローナル抗体。 （５）　ＳＰ２１０−Ａｇ１４ネズミ骨髄腫細胞と、予
   めＣ・アルビカンスの細胞質抗原により免疫化されたＢ
   ＡＬＢ／ｃネズミからの牌細胞との融合により形成され
   たハイブリドーマから産出される特許請求の範囲第１項
   記載のモノクローナル抗体。 （４）　５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して見かけ分子坦
   １２０−１３５Ｋｄ、　４　Ｂ−５２Ｋｄ及Ｕ６５−５
   ＢＫｄを有する３ａｋのＣ・アルビカンスの細胞質抗原
   のいずれかと反応するネズミモノクローナル抗体。 （５）見かけ分子輩１２０−１３５Ｋｄ、　４８−５２
   Ｋｄ及び５５−５８Ｋｄを有するＣ・アルビカンスの３
   種の細胞質抗原のいずれかと反応するネズミモノクロー
   ナル抗体において、 （ａ）　ネズミをＣ・アルビカンスの細胞質抽出吻で免
   疫化し、 （ｂ）　このネズミから肺細胞を取り出して懸濁物を作
   成し、 （ｅ）　前記肺細胞を融合促進剤の存在下でネズミ骨髄
   腫細胞と融合させ、 （ｄ）　融合細胞を、非融合骨髄腫若しくは肺細胞を支
   持しない培地において別々の穴部で希釈しかつ培養し、 （、）　各穴部における上澄液をＣ・アルビカンスの細
   胞質抗原に対する抗体の存在につき測定し、（ｆ）　見
   かけ分子Ｍ’ｓ　５−３８Ｋｄ、　４８−５２Ｋｄ及び
   １２０−１３５ＫｄのＣ・アルビカンス細胞質抗原のい
   ずれか又は全部と反応する抗体産生性のハイブリドーマ
   を選択しかつクローン化し、（ｇ）　前記りｐ−ンの上
   方の上澄液から抗体を回収する ことを特徴とする方法により作成されるネズミ七ツク四
   −ナル抗体。 （６）分子坦１２０−１３５Ｋｄ及び（又は）４８−５
   ２Ｋｄ及び（又は）３５−３ｓｘａのＣ・アルビカンス
   の細胞質抗原と反応するネズミ七ツクｏ　−ナル抗体に
   おいて、 （ｍ）　ネズミをＣ・アルビカンスの細胞質抽出物で免
   疫化し、 （ｂ）　前記ネズミから肺細胞を取り出して、この肺細
   胞の懸濁物を作成し、 （ｅ）　前記肺細胞を融合促進剤の存在下でネズミ骨髄
   腫細胞と融合させ、 （ｄ）　融合細胞を、非融合骨髄腫細胞又は肺細胞を支
   持しない培地において別々の穴部で希釈しかつ培養し、 （ｅ）各穴部における上澄液をＣ・アルビカンスの細胞
   質抗原に対する抗体の存在につき測定し・（ｆ）　見か
   け分子社５５−３８Ｋｄ、　４　Ｂ−５２Ｋｄ及び１２
   ０−１３５ＫｄのＣ・アルビカンス細胞質抗原の１部又
   は全部と反応する抗体を産生ずるハイブリドーマを選択
   しかつクローン化し、（ｇ）　前記りｐ−ンをネズミの
   腹腔内に移植し、（ｈ）　このネズミから所望の抗体を
   含有する急性の腹水又は血清を回収する ことを特徴とする方法により作成され党ネズミモ７クロ
   ーナル抗体。 （ハ　ハイブリドーマＡＴＣＣＡＨＢ−８５９７又はＡ
   ＴＣＣＡＨＢ−８３９８を適する培地において培養し、
   かつ前記ハイブリドーマの上澄液から抗体を回収するこ
   とを特徴とする５５−５８Ｋｄ、４Ｂ−５２Ｋｄ及び１
   ２０−１３５Ｋｄの分子−を有するＣ・アルビカンスの
   細胞質抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法。 （８）特許請求の範囲第７項記載の方法により作成され
   たモノクローナル抗体。 （９）　ハイブリドーマＡＴＣＣＡＨＢ−８５９７又は
   ＡＴＣＣＡＨＢ−８７９８をネズミ中に注入し、かつ前
   記ネズミの悪性腹水若しくは血清から抗体を回収するこ
   とを特徴とする３５−５８Ｋｄ、　４８−５２Ｋｄ及び
   １２０−１３５Ｋｄの分子飯を有するＣ・アルビカンス
   の細胞質抗原に対するモノクローナル抗体の製造方法。 （１０）　特許請求の範囲第９項記載の方法により作成
   されたモノクローナル抗体。 （１１）　Ｃ・アルビカンスの細胞質抗原に対する種類
   ＩｇＧのモノクローナル抗体を産生ずる連続細胞ライン
   からなり、ネズミ骨髄腫に融合したＣ・アルビカンスの
   細胞質抗原により予め免疫化されたＢＡＬＢ／ｃネズミ
   牌細ネズ融合細胞ハイブリッドと、このハイブリッドに
   対する培地とからなる組成物。 （１２）　ネズミ骨髄腫がＳＰ２１０−Ａｇ１４である
   特許請求の範囲第１１項記載の組成物。 （１５）　モノクローナル抗体が見かけ分子社１２０−
   １５５Ｋｄ、４　Ｂ−４２Ｋｄ及び３５−３８Ｋｄの３
   槙の細胞質抗原のいずれかと反応：する特許請求の範囲
   第１１項記載の組成物。 （１４）　七ツクｐ−ナル抗体がＩｇＧ、カッパ型であ
   る特許請求の範囲第１１項記載の組成物。 （１５）　細胞ラインがＡＴＣＣＡＨＢ−８３９７及び
   ＡＴＣＣＡＨＢ−８５９８よりなる群から選択される特
   許請求の範囲第１２項記載の組成物。 （１６）　分子型５５−５８Ｋｄ、　４８−５２Ｋｄ及
   び１２０−１３５Ｋｄを有する抗原の群から選択された
   Ｃ・アルビカンスの細胞質抗原に対するポリクローナル
   ・モノ特異性抗体を製造するに際し、前記抗原の生化学
   的に純粋な調製物により動物を免疫化し、かつこの動物
   から抗体を回収することを特徴とするポリクローナル・
   モノ特異性抗体の製造方法。 （１７）　特許請求の範囲第１６項記載の方法により作
   成されたポリクローナル・モノ特異性抗体。 （１８）　モノクローナル抗体の製造に使用するための
   病原性カンジダ棟の部分精製された細胞質抗原を製造す
   るに際し、 （ａ）カどの細胞の細胞質抽出物を作成し、（ｂ）親和
   性り四マドグラフィーにより細胞質抽出物を分画して、
   細胞壁マンナン、グルカン及びマンノ−／グルコー蛋白
   質複合体を実質的に除去し、 （ｅ）　マンナン除去された細胞質抽出物をイオン交換
   クロマトグラフィーにより分画し、 （ｄ）　溶出液の７ラクシヨンを選択して、ハイブリド
   ーマの生成に使用される牌細胞を有する動物ドナーを免
   疫化する ことを特徴とする、部分精製された細胞質抗原の製造方
   法。 （１９）　親和性クロマトグラフィーによる分画が、（
   ａ）　細胞質抽出物を約ｐＨ６，５〜約ｐＨ７５の充填
   用緩衝液と共にコンカナバリンＡ親和カラムに通し、 （ｂ）　流出液を集めて、これをｐＨ約７〜約８の凍結
   乾燥しうる緩衝液に対し透析し、 （ｃ）　マンナン除去された細胞質抽出物を凍結乾燥す
   る ことを特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ＋２ （２０）　充填用緩衝液がＭｎ　％　Ｍｇ　及びＣａ　
   を含有し、それぞれの濃度が約０．００１Ｍ〜約α０１
   Ｍの範囲である特許請求の範囲第１９項記載の方法。 （２１）　充填用緩衝液が０．０５Ｍのトリス−ＨＣｌ
   縫衝緩衝液ｐ　Ｈ７，４）か、らなり、約０．００１　
   ＭのＭｇＣ１，と約α００１ＭのＭ　ｎ　Ｃ１ｚと約０
   ．００１ＭのＣａＣ１ｚとを含有する特許請求の範囲第
   １９項記載の方法。 （２２）　凍結乾燥しうる緩衝液が約ｐ　Ｈ７，４の約
   α００１　Ｍ　ＮａＨＣＯ３からなる特許請求の範囲第
   １９項記載の方法。 （２！ｌ）　イオン交換クロマトグラフィーによる分画
   が、 （ａ）　マンナン除去された細胞質抽出物を約α０５Ｍ
   のトリス−ＭＣＩ（約Ｐ　Ｈ７，８）の流過用緩衝液に
   溶解させ、かつこの抽出物をＤＥＡＥイオン交換カラム
   に施こしかつ、 （ｂ）　前記流過用緩衝液において０〜約α２２ＭのＮ
   ａ１ｌの直線的塩濃度勾配により溶出させることを特徴
   とする特許請求の範囲第１８項記載の方法。 （２４）　モノクローナル抗体を製造するためのＣ・ア
   ルビカンスの部分精製された細胞質抗原を作成するに除
   し、α０２８〜０．０６６Ｍの塩素イオンで溶出する蛋
   白質７ラクシヨンを選択する特許請求の範囲第２５項記
   載の方法。 （２５）　特許請求の範囲第２４項記載の方法により作
   成される部分精製された抗原。 （２６）　モノクローナル又はモノ特異性のポリクロー
   ナル抗体を製造するための病原性カンジダ種の生化学的
   に純粋な細胞質抗原を製造するに際し、（ａ）　カビの
   細胞の細胞質抽出物を作成し、（ｂ）　親和性クロマト
   グラフィーにより細胞質抽出物を分画して、細胞壁マン
   ナン、グルカン及びマンノー／グルコ−蛋白複合体を除
   去し、（ｅ）　親和性りｐマドグラフィーの溶出液の７
   ラクシ日ンを選択し、 （ｄ）　この７ラクシヨンをゲル電気泳動により蛋白質
   種類に分離し、かつ、 （ｅ）所望の蛋白質種類を選択する ことを特徴とする生化学的に純粋な細胞質抗原の製造方
   法。 （２７）　モノクローナル又はモノ特異性のポリクロー
   ナル抗体を製造するための病原性カンジダ桶の生化学的
   に純粋な細胞質抗原を製造するに際し、（ａ）　カビの
   細胞の細胞質抽出物を作成し、（ｂ）　この細胞質抽出
   物を約ｐＨ１ｈ５〜約ｐ　Ｈ７，５の充填用緩衝液と共
   にフンカナバリン人の親和性カラムに通して細胞壁マン
   ナン、プルカン及びマンノ−／グルコー蛋白複合体を実
   質的に除去し、 （ｃ）　この溶出液を集めて、これを約ｐＨ７〜約ｐＨ
   ８の緩衝液に対し透析し、 （ｄ）　マンナン除去された細胞質抽出物を凍結乾燥し
   、 （＠）　このマンナン除去された細胞質抽出物を、ｐＨ
   約６．５の約０．０５’Ｍのアニオン性緩衝液で平衡化
   したカルボキシメチルセルロースイオン交換カラムに通
   過させ、 （ｆ）　結合した蛋白質のカラムを、塩のカチオンがナ
   トリウム及びカルシウムよりなる群から選択される約０
   〜約０．３Ｍの塩濃度勾配で溶出させ、（ｇ）　所望フ
   ラクションを濃縮すると共に、その成分蛋白質槙類を８
   ＤＳゲル電気泳動により分離し、 （ｈ）　所望蛋白質檎類を生化学的にほぼ純粋な形で選
   択する ことを特徴とする、生化学的に純粋な細胞質抗原の製造
   方法。 （２８）　コンカナバリンＡ充填用緩衝液がＭｎ　。 ２＋ Ｍｇ　及びＣａ　を含有し、それぞれが約α００１Ｍ〜
   （ＬＯＩＭの濃度である特許請求の範囲第２７項記載の
   方法。 （２９）　コンカナバリンＡ充填用緩衝液がα０５Ｍの
   トリス−ＭＣＩ緩衝液（約ｐＨ７４）からなり、約α０
   ０１ＭのＭｇＣｌ２と約０．００１ＭのＭｎＣｌ２と約
   Ｑ、００１ＭのＣａＣｌ２とを含有する特＃′ｆＨａ求
   の範囲第２７項記載の方法。 （６０）　凍結乾燥しうる緩衝液が約ｐ　Ｈ７，４の約
   ０、００１　Ｍ　ＮａＨＣＯ３からなる特許請求の範囲
   第２７項ａＣ載の方法。 （５１）　Ｃ・アルビカンスの生物学的に純粋な細胞質
   抗ＪＲＬ種類を製造するための特許請求の範囲第２７項
   記載の方法。 （５２）　特許請求の範囲第５１項記載の方法により作
   成される生物学的に精製された抗原。 （！＋５）（ａ）　５Ｄ８−ＰＡＧ、Ｔ：において１２
   ０−１３５Ｋｄ、４Ｂ−５２Ｋｄ及び３５−７５８Ｋｄ
   の見かけ分子−を有するＣ・アルビカンスの細胞質抗原
   と反応し、かつＡＴＣＣＡＨＢ−８３９７及びＡ　Ｔ　
   ＣＣＡＨＢ−８３９８よりなる群から選択されるハイブ
   リッド細胞により産生される抗体に相当するモノクロー
   ナル抗体に対し体液を接触させ、かつ（ｂ）　この抗体
   により規定される物質を測定することを特徴とするＣ・
   アルビカンスを検出するための診断方法。 （５４）　測定手段をラテックス膠着、放射線免疫分析
   、及び酵素結合免疫吸収分析よりなる群から選択する特
   許請求の範囲第５６項記載の診断方法。 （３６）（ａ）　Ｓ　Ｄ　５−ＰＡＧ、ｌにおいて１２
   ０−１３５Ｋｄ、４Ｂ−５２Ｋｄ及び５５−３８Ｋｄよ
   りなる群から選択される見かけ分子−を有するＣ・アル
   ビカンスの細胞質抗原を含有する組成物に対し血清を接
   触させ、かつ （ｂ）　この抗原により規定される物質を測定すること
   を特徴とする感染カンジダ症の存在を検出するための診
   断方法。 （３６）　測定手段をラテックス膠着、放射線免疫分析
   、酵素結合免疫吸収分析及び免疫プロット分析よりなる
   群から選択する特許請求の範囲第５５項記載の診断方法
   。