JPS60155203A - 化学修飾多糖及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ものである。

担子菌由来の多糖は、抗腫瘍性を示すことで注目されて
いる。この例としては、シイタケよりのレンチナン、ス
エヒ四タケよりのシゾフイランなどが知られている。こ
れらは、いずれも、β−１。

３−グルカンを主鎖とし、β−１，６一結合でグルコー
スが分岐しているといわれている。

担子菌プクリ日つよりのバキマン、スクレロチウム属の
微生物よりのスクレログルカン、キクラゲ由来の多糖等
も同様の構造を持つといわれている。

しかしながらこのような類似した構造を持つ多糖であっ
ても、それらの抗腫瘍性には、差が認められるのであり
、その原因の一つとして、分岐した糖、即ち側鎖の形態
（例えば、側鎖の数や長さ）の違いによることが考えら
れる。

これらの多糖類はいずれもその起原である菌類から単純
な抽出分離操作を行って得たものか、又はこうして得た
多糖類から酸化や還元等の単純な反応によって誘導され
たものであった。

本発明は式（Ｉ）、 一〔３）βーＤーＧｌｕ（１÷→ （式中Ｇｌｕはグルコピラノシル基を、数字は結合位置
を示す）で表わされるβ−１，３−グルコピラノシル基
単位を繰り返し単位とする主鎖並びにこの主鎖に結合さ
れた、式（Ｉｔ）、 （式中Ｇｌｕ及び数字は前記同様の意味を表わし、Ｘは
Ｎ−ヒドロキシアミドカルボニル基又は（２−ヒドロキ
シエチル）アミノ基を表わし、ｍは０ないし２の整数を
示す）で表わされる第二の繰り返し単位、又はこの第二
の繰り返し単位及び式（１）（式中Ｇｌｕ及び数字は前
記同様の意味を表わし、ｎはロないし２の整数を示す）
で表わされる第三の繰り返し単位から成る化学修飾多糖
を提供するものである。

本発明の化学修飾多糖は、好ましくは主鎖のグルコピラ
ノシル基単位１００個あたり、式（Ｉｆ）で表わされる
第二の繰り返し単位の数が約２０ないし約８５個、式（
Ｉ）で表わされる第三の繰り返し単位の数が約０ないし
約３０個である多糖である。

本発明の化学修飾多糖は代表的には以下の様な物理的、
化学的特性を示す。

１１１　分子葉 濃度０．１モル／ｌの塩化ナトリウム溶液を移動相とす
るゲルｒ過高速液体クロマトグラフイーで、カラムとし
て東洋１達製Ｇ−６０００ＰＷを用い、ゲルｆ過を行う
と、分子ｉｉ−１０万〜１５０万のリテンシｌンタイム
の位置に溶出する。

（２）　元素分析値 化学式から期待される値と実質的に一致する値を与える
。即ち式（ｎ）のＸがＮ−ヒドロキシアミドカルボニル
基の場合には Ｃ：３２．５％〜４３．２％ Ｈ：４．５％〜　６．２％ Ｎ：１．９％〜　８．６％ 程度の値を与え、（２−ヒドロキシエチル）アミノ基の
場合には Ｃ：３５．０％〜４５８０％ Ｈ：　５０％〜　６．２％ Ｎ：２．０％〜１１０％ 程度の値を与える。

（３）硫酸分解 ２Ｎ−硫酸で、８０℃、１８時間で化学修飾多糖を完全
に加水分解し、ガスクロマトグラフイーで分析すると、
グルコースは認められるが、グリセロールは認められな
い。

（４）　塩酸分解 １Ｎ−塩酸水溶液に、化学修飾多糖を溶解し、煮沸して
も、何らの沈澱をも生じない。

（５）溶解性 水及びジメチルスルホキシドに可溶で、メタノール、エ
タノール、アセトン、ベンゼンに不溶である。

（６）　赤外吸収スペクトル 臭化カリウム錠剤法による赤外吸収スペクトルを第１図
（式（ＩＩ）のＸがＮ−ヒドロキシアミドカルボニル基
の場合）及び第２図（同じく（２−ヒドロキシエチル）
アミノ基の場合）に示す。

（７）　メチル化分析 メチル死後加水分解して得られるメチル化糖をアルジト
ールアセテートに誘導し、ガスクロマトグラフィーによ
る分析を行うと、２゜４−ジー０−メチルグルコース及
び２．４．６−トリー〇−メチルグルコースが分離同定
される。２，５．４−）ジ−０−メチルグルコース及び
、２．３．４．６−テトラ−０−メチルグルコースは分
離・同定される場合と、全（認められない場合がある。

本発明の化学修飾多糖は非常に強い抗腫瘍性を有するが
哺乳動物への毒性は極めて低く、マウスに対する急性毒
性はＬ　Ｄｓｏ値で１５００■／ゆ以上である。

本発明の化学修飾多糖は公知の抗腫瘍性多糖と同様、生
理的に許容し得る基剤に溶解または分散させて、皮下、
筋肉内、静脈内などへの注射その他の慣用の方法によっ
て投与することができる。投与量は体重１ｋｇ当り約０
．１ないし約１００〜程度好ましくは間約１ないし約２
０ｒｖ程度である。

本発明の化学修飾多糖は式（１）、 −〔３）β−Ｄ−Ｇｌｕ（１÷→ （式中Ｇｌｕはグルコピラノシル基を、数字は結合位置
を示す）で表わされるβ−１，３−グルコピラノシル基
単位を繰り返し単位とする主鎖並びＫこの主鎖に結合さ
れた、式（Ｎ）（式中Ｇｌｕ及び数字は前記同様の意味
を表わし、ｍは０ないし２の整数を示す）で表わされる
カルボニル基を有する繰シ返し単位、又はこのカルボニ
ル基を有する繰シ返し単位及び式（ｍ）、（式中Ｇｌ　
ｕ及び数字は前記同様の意味を表わし、ｎは口ないし２
の整数を示す）で表わされる繰り返し単位から成るアル
デヒド型β−１，３−グル力／をヒドロキシ尿素又はヒ
ドラジノエタノールと反応させてシック塩基を形成させ
、これを還元することによって製造することができる。

この方法（以下本発明の方法と云う）で出発物質である
アルデヒド型β−１，３−グルカンの式（ＩＶ　）で表
わされるカルボニル基を有する繰り返し単位は以下の反
応式に従って式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位に変
換される。

分（以下アルカリ不溶部と云う）を過ヨウ素酸塩で分解
することによって調製することができる。

本発明の方法で、アルデヒド型β−１，３−グルカンと
ヒドロキシ尿素又は２−ヒドラジノエタノールからシッ
ク塩基を形成させる反応は、水性媒体中前者１ｇに対し
て後者約０、００１ないし約０．５モル、好ましくは０
．０１ないし０．１モルを添加することによって行うこ
とができる。その際のアルデヒド型β−１゜３−グルカ
ンは水性媒体中によく分散させる。

アルデヒド型β−１，３−グルカンに対する水性媒体の
量は重量比で約１０ないし約１．０００倍量、好ましく
は約３０ないし３００倍量程度である。反応の際の液性
はＤＨ約５ないし約１０、好ましくは約６ないし約８と
する。

液性調整のために酸、例えば塩酸、又はアルカリ、例え
ば水酸化ナトリウム等を使用することができる。

反応は、通常温度約５ないし約８０℃、好ましくは約１
０ないし約５０℃程度で行なう。

反応時間は通常約１０時間ないし５日間程度、好ましく
は２日間程度である。

こうしてシッフ塩基を形成させたのち還元を行う。還元
剤としては強い還元剤、例えば水素化ホウ素ナトリウム
、シアン化水素化ホウ素ナトリウムなどを用いる。特に
シアン化水素化ホウ素ナトリウムが好ましい。還元剤の
量は出発物質として用いたアルデヒド型β−１，６−グ
ルカン中のカルボニル基に対して当量以上である。還元
剤の濃度は限定的ではないが約０００１モル濃度以上、
例えば約０、００１ないし約０．１モル程度を例示する
ことができる。反応温度は約０ないし約８０℃、好まし
くは約１０ないし約５０℃程度、反応時間は通常数時間
ないし５日間程度、好ましくは２日間程度である。

これらの反応によって水溶性の本発明の多糖は水性媒体
中へ溶出される。水性媒体中へ溶出した本発明の多糖は
遠心分離などの慣用の方法で不溶性画分を除去したのち
、透析、凍結乾燥等の常法によって単離することができ
る。

以下本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例１ 容せ２５０ｍ１のフラスコに原料調製例１で得たアルデ
ヒド型β−１，３−グルカン１ｇをとり、これにヒドロ
キシ尿素０．１モルを加え蒸留水を加えて全ｚ１ｏｏｍ
ｌとした。アルデヒド型β−１，３−グルカンをディス
パーザ−でよく分散させた後、塩酸でｐＨ７に調整し、
２日間マグネチックスターラーで攪拌した。

そのあと塩酸でｐＨ６，５に調整した後、シアノ化水素
化ホウ素ナトリウム１１６ｇを加え、攪拌しながら、さ
らに２日間反応させた。反応終了後、けん濁物を含んだ
反応液を、遠心分離、口過し、水溶性画分を、水道水で
流水透析した。透析チーーブ内容液を凍結乾燥して目的
とする化学修飾多糖７２ｍ９を得た。（収率Ｚ２％λ得
られた化学修飾多糖の分析結果は以下の通りであった。

分子量 濃度０１モル／）の塩化ナトリウム水溶液を移動相とす
るゲルｆ過高速液体クロマトグラフィーで、カラムとし
て東洋曹達工業■製Ｇ　−（ＳＯＯＯＰＷを用い、ゲル
ｒ過を行なうと、分子量２１万のリテンシヨンタイムの
位置に溶出した。

元素分析値 Ｃ：　３６．７％ Ｈ：５．１％ Ｎ：４．２％ 赤外吸収スペクトル 臭化カリウム錠剤法による赤外吸収スペクトルを第１図
に示す。

メチル化分析 メチル化分析の結果から 式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の個数（主鎖１０
０個当り）　８２．５個 式（ＩＩＩ）で表わされる繰り返し単位の個数（主鎖１
００個当り）　０個 実施例２ 原料調製例２で得たアルデヒド型多糖を用いて実施例１
と同様にして化学修飾を行い、化学修飾多糖を得た。（
収率５．１％）、実施例１と同様にして行った分析の結
果は以下の通りであった。

分子量 分子蓋９５万のリテンシ薯ンタイムの位置に溶出した。

元素分析値 Ｃ：　３９１％ Ｈ：　５．２％ Ｎ：５．５％ メチル化分析 メチル化分析の結果から 式（ｎ）で表わされる繰り返し単位の個数（主鎖１００
個当り）　７４個 式（ｎ＋）で表わされる繰り返し単位の個数（主鎖１０
０個当り）　８５個 実施例３ ヒドロキシ銀系０１モルに代えて２−ヒドラジノエタノ
ール０．１モルを用いた以外は実施例１と同様にしてア
ルデヒド型β−１，３，−グルカンの化学修飾を行ない
目的とする化学修飾多糖８３ｍ９を得た。（収率８３％
）実施例１と同様にして行った分析の結果は以下の通り
であった。

分子量 分子量２１万のリテンシヨンタイムの位置に溶出した。

元素分析値 （”：　５Ｂ３％ Ｈ：　５４％ Ｎ：４．６％ 赤外吸収スペクトル 臭化カリウム錠剤法による赤外吸収スペクトルを第２図
に示す。

メチル化分析 メチル化分析の結果から 式（川）で表わされる繰り返し単位の個数（主鎖１００
個当り）　８２．５個 式（１）で表わされる繰り返し単位の個数（主鎖１００
個当り）　０個 実施例４ 原料調製例２で得たアルデヒド型多糖を用いて実施例３
と同様にして化学修飾を行い、化学修飾多糖を得た。（
収率５２％）、実施例１と同様にして行った分析の結果
は以下の通りであった。

分子量 分子量９５万のリテンシ賓ンタイムの位置に溶出した。

元素分析値 Ｃ：　４０．５％ Ｈ：　５８％ Ｎ：３．１％ メチル化分析 メチル化分析の結果から 式（Ｉｆ）で表わされる繰り返し単位の個数（主鎖１０
０個当り）　７４個 式（ｍ）で表わされる繰り返し単位の個数（主鎖１００
個当り）８，５個 実施例５ ＩＣＲマウス群で、本発明の化学修飾多糖のザルコーマ
１８０固形腫瘍に対する効果を試験した。

ＩＣＲマウス１匹につき、ザルコーマ１８ｏ腹水局細胞
６×１０６個をそけい部皮下に接種した。実験群は１群
６匹とした。癌細胞移植後、翌日より１０日間、１日１
回薬剤を腹腔内にｏｌｍｌずつ投与した。試験群には、
本発明の化学修飾多糖（実施例１で得たもの）を５ｍ９
／ｋｇ・ｄａｙの投与量になるようにして用い、対照群
には生理食塩水のみを投与した。腫瘍移植後３５日０に
腫瘍を摘出してその重量を測定した。各群の腫瘍抑制率
は次式により算出した。

ここでＣ：対照群の平均腫瘍重量 Ｔ：試験群の平均腫瘍重量 結果を第１表に示す。

本発明で原料として用いたアルデヒド型β−１゜３−グ
ルカンは以下の様にして調製した。

原料調製例１ アルカリ不溶部の調製 市販の乾燥させたキクラゲ５０４ｇを、１％塩化ナトリ
ウム水溶液６１で、家庭用ミキサーにより十分粉砕し、
−昼夜静置、浸漬した。このあと１％塩化ナトリウム水
溶液３１を加え、さらに６０℃、６時間、攪拌しながら
加熱し、キクラゲを十分膨潤させた。さらにキクラゲを
微細化するため、ホモジナイザーで粉砕した後、１２０
℃、２０分間オートクレーブで熱水抽出を行い遠心分離
して熱水抽出画分を除いた。残有画分について、もう−
炭熱水抽出操作を同様にして行った。

このようにして得られた残有画分に水９１と水酸化ナト
リウム３２４ｇを加え（この時全容量は１２１となった
）、６０℃、４時間、窒素雰囲気下でアルカリ抽出を行
った。遠心分離を行ないアルカリ抽出画分を除き、アル
カリ抽出残前を得た。このアルカリ抽出残前に水８１と
水酸化ナトリウム１５６ｇを加え（この時全容量は９１
となった１、）、再び同様にしてアルカリ抽出操作を行
った。

アリカリ抽出残前に水１０１を加え洗浄、遠心分離及び
再懸濁の操作を懸濁液のｐＨが約９になるまで繰り返し
た。懸濁液に希塩酸を加えｐＨを７に調整した。

次にこの懸濁液に水５１を加え、ホモジナイザー処理し
、アルカリ抽出残前をさらに細分化した。懸濁液にさら
に水を加えて凍結乾燥し、１４６ｇのアルカリ不溶部を
得た（収率２９％）。

このものは実質的に式（Ｉ） −０３）β−Ｄ−Ｇｌｕ　（１−３−＋（式中Ｇｌｕ及
び数字は前記同様の意味を表わす）で光わされるβ−１
，３−グルコピラノシル基単位を繰り返し単位とする主
鎖とこの主鎖に結合された式（ｍ） （式中Ｇｌｕ及び数字は前記同様の意味を表わす）で表
わされる繰り返し単位からなり、主鎖の繰り返し単位１
００個当り式（Ｉ）の繰り返し単位の数が約８２．５個
である多糖であった。ｎの値は平均値で約０１であった
。

アルデヒド型多糖の調製 内容量５ノの細口かっ色びんに、アルカリ不溶部２５ｇ
を入れ、蒸留水５１を加え、マグネチツクスターラーで
アルカリ不溶部をよく分散させた後、アスピレータ−を
用い脱気した。そのあとメタ過ヨウ素酸ナトリウム６６
９を加え、溶解させた後、攪拌しながら、室温で７日間
反応させた。反応が終了後水洗と遠心分離を３回繰り返
して行い、生成したギ酸及び残存のメタ過ヨウ素酸ナト
リウムを除去した。固相に水を加え、凍結乾燥して２０
．５９のアルデヒド型多糖を得た。（収率８２％）この
アルデヒド型多糖は実質的に式（１）で表わされる主鎖
と式（ＩＶ）で表わされる繰り返し単位からなるβ−１
，３−グルカンであった。式（ＩＶ）のｍの値は平均値
で約０１であった。また式（１）で表わされる主鎖１０
０個当りの式（■）で表わされる繰り返し単位の個数は
８２．５個であった。このアルデヒド型多糖の窒素の含
有量は定量限界以下であ、った。

原料調製例２ 原料調製例１のアルデヒド型多糖の調製で用いたメタ過
ヨウ素酸ナトリウムの量を１３．２９とした以外は同調
製例と同様にして原料ＩＡＩ製を行い、アルデヒド型多
糖を得た。このアルデヒド型多糖は実質的に式（１）で
表わされる主鎖と式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位
及び式Ｏｖ）で表わされる繰り返し単位からなるβ−１
，６−グルカンであった。

式（ｌｉｔ）の０１式（ＩＶ）のｍの値はともに平均値
で約０１であった。また式（Ｉ）で表わされる主鎖１０
０個当りの、式（ｍ）で表わされる繰り返し単位の個数
は８．５個、式（Ｎ）で表わされる繰り返し単位の個数
は７４個であった。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明の化学修飾多糖の赤外吸収
スペクトルを示す図である。 特許出願人　東洋曹達工業株式会社 （％）　＊　硬　誓 （ト）申　硬　誓

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（Ｉ）、 イ→３）β−Ｄ−Ｇｌｕ（１→→ （式中Ｇｌ　ｕはグルコピラノシル基を、数字は結合位
   置を示す）で表わされるβ−１，３−グルコピラノシル
   基単位を繰り返し単位とする主鎖並びにとの主鎖に結合
   された、式（Ｉ［）、−＋３）β−Ｄ−Ｇｌｕ６（１→
   → （式中Ｇｌｕ及び数字は前記同様の意味を表わし、Ｘは
   Ｎ−ヒドロキシアミドカルボニル基又は（２−ヒドロキ
   シエチル）アミン基を表わし、ｍは口ないし２の整数を
   示す）で表わされる第二の繰り返し単位、又はこの第二
   の繰り返えし単位及び式（Ｅｌ）、 （式中Ｇｌｕ及び数字は前記同様の意味を表わし、ｎは
   ０ないし２の整数を示す）で表わされる第三の繰り返し
   単位から成る化学修飾多糖。
2. （２）主鎖のグルコピラノシル基単位１００個あたり第
   二の繰り返し単位の数が約２０ないし８５個、第三の繰
   り返し単位の数が、口ないし約３０個である、特許請求
   の範囲第１項記載の化学修飾多糖。
3. （３）濃度０．１モル／ｌの塩化ナトリウム水溶液を移
   動相とするゲルｆ過高速液体クロマトグラフイにおいて
   、分子量の値として約１０万ないし約１５０万を示す化
   学修飾多糖である特許請求の範ＦＭ第１項又は第２項記
   載の化学修飾多糖。
4. （４）式（Ｉ） 刊→３）β−Ｄ−Ｇｌｕ（１→→ （式中Ｇｌｕはグルコピラノシル基を、数字は結合位置
   を示す）で表わされるβ−１，３−ゲルコピ２ノシル基
   単位を繰り返し単位とする主鎖並びにこの主鎖に結合さ
   れた、式（■［（式中Ｇｌｕ及び数字は前記同様の意味
   を表わし、ｍは口ないし２の整数を示す）で表わされる
   カルボニル基を有する繰り返し単位、又はこのカルボニ
   ル基を有する繰り返し単位及び式（１）、 （式中Ｇｌｕ及び数字は前記同様の意味を表わし、ｎは
   口ないし２の整数を示す）で表わされる繰り返し単位か
   ら成るアルデヒド型−：　β−１，６−グルカンをヒド
   ロキシ尿素又は２−ヒドラジノエタノールと反応させて
   シッフ塩基を形成させ、これを還元することを特徴とす
   る、式（１） ％式％（１ （式中Ｇｌｕ及び数字は前記同様の意味を表わす）で表
   わされるβ−１，３−グルコピラノシル基単位を繰り返
   えし単位とする主鎖、並びにこの主鎖に結合された式（
   ｎ） 味を表わす）で表わされる第二の繰り返し単位、又はこ
   の第二の繰り返し単位及び式（１１）（式中Ｇｌｕ、ｒ
   ｌ及び数字は前記同様の意味を表わす）で我わされる第
   三の繰り返し単位から成る化学修飾多糖を得ることを特
   徴とする化学修飾多糖の製造法。
5. （５）　主鎖のグルコピラノシル基単位１００個あたり
   、式（■）で表わされるカルボニル基を有する繰り返し
   単位の数が約２０ないし約８５個であり、式（１）で表
   わされる繰り返し単位の数が０ないし約３０個であるア
   ルデヒド型−β−１，３−グルカンを出発物質として用
   い、主鎖のグルコピラノシル基単位１００個あたり、式
   （Ｉ［）で表わされる第二の繰り返し巣位の数が約２０
   ないし約８５個、式（１１）で表わされる第三の繰り返
   し単位の数が口ないし約３０個である化学修飾多糖を得
   る、特許請求の範囲第４項記載の製造法。
6. （６）化学修飾多糖として、濃度０．１モル／ｌの塩化
   ナトリウム水溶液を移動相とするゲル濾過高速液体クロ
   マトグラフィにおいて、分子量の値として約１０万ない
   し約１５０万を示す多糖を得る、特許請求の範囲第４項
   または第５項記載の製造法。
7. （７）　出発物質として用いるアルデヒド型−β−１，
   ３−グル力ｙがキクラゲ子実体のアルカリ不溶部分を過
   ヨウ素酸で酸化して得たものである特許請求の範囲第４
   項ないし第６項のいずれかの項記載の製造方法。