JPS60156385A - ラツカ−ゼの製造法 - Google Patents

ラツカ−ゼの製造法

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JPS60156385A
JPS60156385A JP20339483A JP20339483A JPS60156385A JP S60156385 A JPS60156385 A JP S60156385A JP 20339483 A JP20339483 A JP 20339483A JP 20339483 A JP20339483 A JP 20339483A JP S60156385 A JPS60156385 A JP S60156385A
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JP
Japan
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laccase
medium
irpex
auricularia
ganoderm
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Pending
Application number
JP20339483A
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English (en)
Inventor
Takemitsu Arai
新井 雄光
Shigeaki Tamura
田村 繁昭
Hideo Katsumata
勝又 英雄
Masanobu Kawai
川合 正允
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KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、イルペックス属、オウリキニラリア属、ガノ
デルム属、コプリナス属、ダエダレオプシス属又はフラ
ムリナ属に属し、ラッカーゼ生産能を有する微生物を栄
養培地に培養し、得られた培養物から、ラッカーゼを採
取することを特徴とするラッカーゼの製造法に関する。
ラッカーゼ(E、 C,110,,3,2)は、パラ・
ジフェノール(p −Jiphenol ) 、オルト
・ジフェノール(o −diphenol )またはポ
リ・フェノール(Poly phenol )を酸化し
それぞれのキノン(quinone )に変換する反応
を触媒する酵素であり、植物、微生物に広く分布するこ
とが知られている。近年診断用試薬として酵素法による
発色系が広く用いられるようになったが、本発明者等は
新しい発色系を触媒する酵素について鋭意検討を行った
結果、ラッカーゼがアミン類化合物とフェノール類化合
物を分子状酵素の存在下に酸化縮合し、色素を生成する
反応を触媒することを見い出した。本反応系は、新しい
発色系として診断用試薬等に利用できることからラッカ
ーゼの工業的製造法を開発すべく、その供給源を微生物
界にめ鋭意検討を行った。ラッカーゼの微生物にふける
存在については、ポドスポラ属(Podospora 
) 。
(Archiv fur Microbiologie
 (1963) :l 、ポリスボラ属(Polysp
ola ) l:Acta Chemica 5can
dinavica (1967) )やノイロスポラ属
(Neurospora )(Journal of 
Bacteriology 120,458 (197
4) :1等のカビ類及びコリオラス属(Coriol
us) 、ポリポラス(polyporus )プレウ
ロタス属(Pleurotus )〔発酵協会誌20,
293 (1962) )等の担子菌が知られている。
本発明者等は担子菌のラッカーゼに着目し、検索したと
ころインペックス属、オウリキュラリア属、ガノデルム
属、コプリナス属、ダエダレオプシス属及びフラムリナ
属に属する微生物がラッカーゼ高生産能を有することを
見い出し、これら微生物よりラッカーゼを工業的安価に
製造する方法を確立し、本発明を完成した。以下本発明
について詳細に説明する。
本発明に使用される菌株としては例えば、イルペックス
・ラフテラス(Irpex 1acteus )八TC
C−20123、オウリキュラリア・ポリトリ力(Au
riculariapolytricha) Z−22
9〔微工研菌寄No、7119) 。
ガノデルム・ルシダム(Ganoderm Iucid
um)2−262〔微工研菌寄No、7120〕、コプ
リナス・ミヵセウス(Coprinus m1cace
us、、) ATT−20122、ダエダレオプシス・
スチラシナ(Daedaleopsis 5tyrac
ina)ATCC−20188,7ラムリナ・ベルチヘ
7. (Flammulinaveltipes) A
TCC−13547があげられる。菌株の性質について
は、伊藤誠哉著「日本菌類誌」第2巻、養賢堂(195
5)に記載されている。
本発明に使用する栄養培地としては炭素源、窒素源、無
機物および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素
を程よく含有するものであれば天然培地1合成培地のい
ずれもよい。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜、デキ
ストリン、デンプン、グリセリンなどの炭水化物などが
用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ソーダ、グ
ルタミン酸などのアミノ酸などの無機有機窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー7’l
+−1大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュ
ブルベジタブルプロテインなどの窒素含有天然物等が使
用できる。
j(1’[壊物としてはリン酸−カリウム、リン酸二カ
リウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン
、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カル
シウムなどが用いられる。
その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応
じ使用する。
培養は、固体培養でもよいが通常振とう又は通気攪拌液
体培養で行う。培養温度は20〜40℃。
培地pHは3〜7にて2〜6日間培養する。こうして培
養液中に生成蓄積されたラッカーゼは菌体を分離したの
ち、上清液より通常酵素精製に用いられる方法例えば、
塩析、有機溶媒沈殿、透析。
等電点沈殿、吸着体及びイン交換体を用いるカラムクロ
マトグラフィー等の方法を組み合せて単離精製できる。
ラッカーゼは血清中のビリルビン、アスコルビン酸及び
尿酸等にも作用を及ぼずので9種々の血清中の物質、例
えばトリグリセライドなどの測定の際に本発明のラッカ
ーゼを用いることによってビリルビン、アスコルビン酸
及び尿酸等が測定系に及ぼす悪影響を回避することがで
きる。またビリルビン自身の吸光度減少法を利用したビ
リルビン等の定量へも応用できる。
ラッカーゼの活性の測定法は種々あるが本発明において
は、ラッカーゼによって4−アミノアンチピリンとフェ
ノールが酸化縮合し定量的に発色する作用を利用してカ
ツカーセの活性を測定した。
即ち1 、.10mM4−アミノアンチピリンQ、2ml。
10 mM phenol 0.2 ml、0.1 M
リン酸緩衝液(pH6,0)2.5mlを混合し、37
℃、5分間放置後、測定すべき酵素液01m1を添加し
、37℃10分間反応させ、吸光度OD nm(E、)
を分光々変針により測定する。一方同じ操作にて酵素液
の代りに水Q、1mlを添加し、吸光度OD nm(E
2)を測定する。酵素力価は下記の式によりめ、1分間
に1μMの色素を生成する酵素量を1単位(U)とした
ラッカーセ力価(U/m1)− 次いで本発明を実施例によって説明する。
郵施例1゜ イルペックス・ラリテラスATCC20123Q250
ml三角フラスコ中のグルコース2.0%、シニークロ
ース1.0%、大豆粕2.0%、コーンスチープリ力−
0,5%、K2HPO40,1%、MgSO4’ 78
200.05%、FeCjl!36H201Or/ml
 (pH6,0)を含有する3 Qmlの培地に植菌し
28℃で4日間培養する。
尋られる種培養液30m1を培養フラスコに入れた肪記
と同じ組成を有する種培養培地300m1に接即し28
℃、4日間振盪培養する。得られる種培痒液1.2βを
30βジヤーフアーメンクーに入れtこ前記と同じ組成
を有する発酵培地15pに接種し、30℃、25 Or
、p、m、通気量15β/miηで3日間培養を行う。
培養終了した培養液151を吸引濾過して、菌体を濾゛
別し、約101の上清液に硫安を0.7飽和娼加し、該
酵素の粗沈殿物を得る。この沈殿物を脱イオン70 Q
mlに溶解し、セロファンチューブにて透析後、ダイヤ
イオンHPA−75(三菱化成社製)の50 Qmlカ
ラムを通過させる。通過液11に硫安を0.7飽和添加
し、該酵素の沈殿物を1昇る。この沈殿物を脱イオン水
20 Qmlに溶解し、DEAE−Cellurose
 l Q Qmlカラムに吸着させ0、05 M硫安で
洗浄後、0.1M硫安にて該酵素を溶出する。溶出液1
5 Qmlを限外濾過膜にて濃縮し400U/mlの酵
素液l Omlを得る。
ここで得られた酵素の性質は以下のとおりである。
1)至適pH p H4,5付近にある(第1図) 2)至適温度 50℃付近にある。(第2図) 3)pH安定性 37℃、60分処理でpH4〜8では90%以上残存活
性がある。(第3図) 4)温度安定性 p H6,5分処理で50℃まで安定(第4図)5)等
電点 pH3〜10のキャリア・アンホライトを用い測定した
結果等電点は3.1であった。
6)分子量 セファクリル−3−300(ファルマシア社製)を用い
たゲル濾過法にて測定した結果、分子量72.300で
あった。
実施例2 2β容三角フラスコ中の実施例1と同様の培地30 Q
mlに第1表に示す菌株を植菌し、28℃。
4日間培養し、第1表に示す活性のラッカーゼを得る。
菌株基 ラッカーゼ活性 (U/ml ) イルペックス・ラフテラス ATCC−201231,
56オウリキニラリア・ポリトリ力 Z〜229 1.
51ガノデルム・ルシダム l−2620,64コプリ
ナス・ミカセウス ATCC−201220,47ダエ
ダレオプシス・スチラシナ ATCC−201880,35 フラムリナ・ベルチペス ATCC−135470,3
2(生産能が知られている菌株) コリオラス・ベルンカラー IPO−49370,63
ポリポラス・ベルシカラーATCC−201550,0
1プレウロクス・オストレアタス NRRL−125070,28
【図面の簡単な説明】
第1〜4図はそれぞれ本発明のラッカーゼの至適pH,
至適温度、pH安定性及び温度安定性を示す。 手続補正書(方式) 昭和(、o年3月6日 特許庁長官 殿 1、事件の表示 昭和58年特許願第2’03394号 2、発明の名称 ラッカーゼの製造法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 東京都千代田区大手町−丁目6番1号名 称 
(102)協和醗酵工業株式会社昭和59年1月11日
(発送日:昭和59年1月31日)5、補正の対象 明 細 書 6、補正の内容 明細書の浄書(内容に変更なし)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. イルペックス属、オウリキュラリア属、ガノデルム属、
    コプリナス属、ダエダレオプシス属又はフラムリナ属に
    属し、ラッカーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培
    養し、得られた培養物から、ラッカーゼを採取すること
    を特徴とするラッカーゼの製造法。
JP20339483A 1983-10-29 1983-10-29 ラツカ−ゼの製造法 Pending JPS60156385A (ja)

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