JPH044874A - フラクトシルアミノ酸分解酵素、その製造法及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素に関するものであり、更に詳細には、フ
ラクトシルリジンまたはフラクトシルアラニンに作用す
る新規なフラクトシルアミノ酸分解酵素、その製造法、
その利用及び生成菌に関する。

〔従来の技術〕

食品褐変化反応（メイラード反応）は食品中の還元糖と
タンパク質やアミノ酸の間で起こる非酵素的に生しる複
雑な反応である。メイラード反応は食品では褐変や香気
成分の変化、特に１分子内に２つのアミノ基を持つ必須
アミノ酸であるリジンとは特に反応し、リジンの損失等
を招くことが知られている。メイラード反応はグルコー
ス等の糖類のカルボニル基とアミノ酸等のアミノ基がシ
ッフ塩基を可逆的に生成し、更に不可逆的にアマトリ転
移を起こしアマトリ化合物と呼ばれるケトアミン体を生
成する。

そこで、食品に於てメイラード反応に防止するために、
メイラード反応生成物を酵素での分解を利用しようとす
る試みがある。メイラード反応の初期に生成するフラク
トシルアミノ酸を分解する酵素としては、コリネバクテ
リウムによるフラクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開
昭６ｌ−２６８１７８）が知られているが、メイラード
反応で最も問題になるリジンのフラクトシル化合物に対
する反応性が悪く、実用に供することはできない。また
、アスペルギルス属が生産するフラクトシルアミノ酸オ
キシダーゼがリジンのε−アミノ基に結合したアマトリ
化合物にも作用するとの記載があるが（日本農芸化学会
誌、６４巻３号１９９０年度大会講演要旨集５７９頁）
、ε−フラクトシルアミノカプリン酸に対する分解活性
を有るのみであり、フラクトシルリジンに対する分解活
性は認められていない。

本発明はペニシリウム属菌由来のフラクトシルアミノ酸
分解酵素に関するものであるが、該酵素はフラクトシル
リジン、フラクトシルアラニンを効率よく分解すること
ができる新規な工業用酵素であり、また従来、ペニシリ
ウム属菌がこのような酵素を生成することも知られてお
らず、本発明は従来未知の新規発明である。

〔発明が解決しようとしている課題〕

本発明の課題は、フラクトシルリジン及び／又はフラク
トシルアラニンに作用するフラクトシルアミノ酸分解酵
素を探索し該酵素を生産し更に該酵素によって、食品の
褐変を防止しまたリジンの損失を防ぐことである。

〔課題を解決するための手段〕

フラクトシルリジンを分解する酵素を生産する菌を捜す
ため、フラクトシルリジンを唯一の窒素源とした培地で
生育する菌をスクリーニングした。

その結果、東京都府中市幸町東京農工大学農学部前の土
壌よりペニシリウム属に属する微生物を発見した。本菌
株をペニシリウムｓｐ、５３３５と命名し、微工研に寄
託した。（微工研菌寄第１１４０８号）以下に本菌株に
ペニシリウムと同定した理由と、該菌株から採取された
新規酵素の酵素化学的性質を述へる。

（１）本発明の生産菌の同定 「カビの分離・培養と同定」（宇田用俊−・室井哲夫訳
、医歯薬出版株式会社１９８３）、「食品菌類ハンドブ
ック」（宇田用俊−・松田芳夫監訳、医師薬出版株式会
社１９８４）を参考とし、本菌株についてその菌学的性
質を検討した結果、以下の根拠よりペニシリウム属と同
定した。

１）子のう世代を形成しない。

２）ベニシラス形成が認められた。

３）分生子型はフィアロ型で環紋は形成しない。

４）分生子はフイアライド先端から形成され連鎖する。

５）フィアライドは版型で先端が細くならない。

（２）本発明の酵素の生産及び分離精製本発明に係る酵
素は、ペニシリウムｓｐ、５３３５菌を培地に培養し、
培養物から分離すれば得ることができる。本菌株の培養
は、微生物、特に糸状菌の培養における常法が適宜使用
され、常用される液体培地を用いて振どう培養、通気攪
拌培養等好気条件下２５〜３７℃の範囲で培養すればよ
い。

本発明において使用する培地としては、炭素源、窒素源
、無機塩その他栄養成分を含有する合成培地又は天然培
地が適宜使用可能である。炭素源としては、ぶどう糖、
果糖、グリセリン、澱粉、蔗糖等が用いられる。窒素源
としては、ペプトン、カゼイン分解物、脱脂大豆、酵母
エキス、麦芽エキス、ブイヨン、コーンステイープリカ
ー等が使用できる。無機塩としては、カリウム、ナトリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト
、鉄等の塩化物、リン酸塩、硫酸塩等塩類が適宜使用さ
れる。

特に本発明においては、培地にフラクトシルアミノ酸を
添加すると、目的とする酵素が効率よく生産、蓄積され
る。フラクトシルアミノ酸としては、フラクトシルリジ
ン、フラクトシルアラニンのほかハイドロキシアセトニ
トリルグリシンその他のフラクトシルアミノ酸が適宜使
用される。フラクトシルアミノ酸は、市販されている商
品が自由に使用できるが、必らずしも純品でなくともよ
く、例えばアミノ酸と糖とを溶媒の存在下で加温しなが
ら反応させた反応物から溶媒を除去したもの、あるいは
これを水に溶解懸濁させたもの、といった粗製品も自由
に使用することができる。

本酵素は培養物から抽出する。菌体から抽出する場合に
は、水及び／又は有機溶媒を用いて菌体から直接抽出す
るほか、酵素、超音波、機械的破砕処理等によって菌体
を破砕した後、抽出溶媒により抽出する。培養液から抽
出する場合には、培養液を必要に応じて減圧濃縮、限外
濾過処理した後、抽出溶媒により抽出する。このように
して酵素含有液を得ることができる。

酵素含有液は、このまま、又は濃縮した後、粗酵素とし
て利用することができるが、更に希望するのであれば、
酵素の単離精製における常法を単用ないし組み合わせて
用い精製することができる。

例えば各種のクロマトグラフィー、透析、再結晶等既知
の精製システムを利用することによって精製酵素とする
ことができる。

（３）本発明の酵素の酵素化学的性質 菌体を一８０℃で冷凍させ、乳鉢で同重量の石英砂と混
合してすりつぶして菌体を破砕して得たペーストに、６
７ｍＭ燐酸緩衝液（０，１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
酢酸　、　０５ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリ
ドを含む。）を加え、抽出し、抽出液を同し緩衝液で２
４時間透析し、１２０００Ｇで３０分間４℃で遠心し、
上清を蛋白量が１１あたり１．Ｂとなるように調整し、
粗酵素液として下記の特徴を持った酵素を製造した。

１）作用 本酵素はフラクトシルアミノ酸を分解し糖とアミノ酸を
産生ずる。

２）基質特異性 フラクトシルリジン及び／又はフラグトシルアラニンを
分解する。

３）至適ｐＨ及び安定Ｐ）ｌ範囲 ｐＨ５〜８の間で作用し、至適ｐ８７．５付近にある。

（活性はシフラクトシルリシンを基質として、０．０６
７Ｍの燐酸緩衝液中にて３０℃１０分反応させた。

フラクトシルリジンはフイノット等の方法により調整し
た。Ｊ、　Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ５２．１
４８８−１４９５）また、ＰＨ６から８の範囲にて安定
である。　（活性は各ｐＨに３０℃１０分放置後ｐＨ７
にてシフラクトシルリジンの分解活性を測定した。）第
１図に至適ＰＨとｐＨ安定性を示した。

４）作用温度範囲及び最適温度範囲 作用温度範囲は２０℃〜７０℃であり、最適温度範囲は
３０℃付近である。（活性はシフラクトシルリジンを基
質として、０．０６７Ｍ、ｐＨ７，５の燐酸緩衝液中に
て１０分間反応させた。）第２図に至適温度と温度安定
性を示した。

５）熱安定性 ｐＨ７，０の燐酸緩衝液中で４０℃１０分間放置後、シ
フラクトシルリジンを基質として４５％活性が残存する
。

（４）本酵素を用いる食品の褐変防止 本発明に係る酵素は、その作用が強力でありしかも非常
に安定であるので、これを食品に添加するだけで食品の
褐変を防止することができる。

本酵素は各種食品の褐変を広く防止することができ、味
噌、醤油、味りん、乳製品、果汁、パン、ビスケット、
菓子類その他の飲食品に対して広く添加使用することが
できる。その際１本酵素は作用が強力であるので少量の
使用で充分褐変の防止ができるが、異味がなく安全性の
面でも問題はないので、多量に使用しても差し支えない
。

本酵素としては、精製した酵素が使用されることはもち
ろんのこと、粗製酵素液も充分に使用することが可能で
あり、また、本菌株自体を使用することもできる。

〔実施例〕

本発明を実施例により更に具体的に説明する。

実施例１ （ａ）基質の調製 し−リジン１．０％、ぶどう糖６．５％を含むメタノー
ル溶液５００＋＋＋１２を４時間還流させ、活性炭０．
１％を加え、１時間攪拌する。メタノールを蒸発させた
後、水１００ｍΩに溶かして粗フラクトシルリジン液と
する。

（ｂ）菌体の培養 菌株（Ｐｅｎｉｃｊｌｌｉｕｍ　ｓｐ、５３３５　ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−１］４０８）を、ぶどう糖１％、燐酸２カリ
ウム０．１％、塩化カリラム０，０５％、硫酸第一鉄７
水和物０．００１％、硫酸マグネシウム０．１％、　粗
フラクトシルリジン液］６．７％、寒天１．５％より成
る傾斜寒天培地１０ｍρで、３０℃で１週間培養し、胞
子をつくらせる。滅菌水１．０ｍｇに胞子を懸濁させ胞
子懸濁液をつくる。５００ｍＱ逆ロフラスコ１０本に各
１００ｍＱの培地（ぶど　う糖１％、燐酸２カリウム０
．１％、塩化カリウム０．０５％、硫酸第一鉄７水和物
０．００１％、硫酸マグネシウム０．１％、粗フラクト
シルリジン液１６．７％）、胞子懸濁液２ＩＩｉｐを入
れ、３０℃で５日間振どう培養する。。培養液を吸引ろ
過して湿菌体２４ｇを得た。

（ｃ）粗酵素液の調製 菌体を一８０℃で冷凍させ、乳鉢で同重量の石英砂と混
合してすりつぶして菌体を破砕する。菌体を破砕して得
たペーストに、６７＋ｎＭ燐酸緩衝液（０，１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸、　０．０５ｍＭフェニルメタンス
ルホニルフルオリトを含む。）を加え、抽出する。抽出
液を同じ緩衝液で２４時間透析し一１１２０００ｇで３
０分間４℃で遠心し、上清を蛋白量が１ｍｇあたりＩｍ
ｇとなるように調整し、粗酵素液とした。

（ｄ）フラクトシルリジンの分解活性の確認粗酵素液及
び沸騰水中で】０分間加熱処理した粗酵素液０．２ｍｇ
を、０．１ｍｇの５０ｍＭジフルクトシルリジン溶液又
はＮｔ−フルクトシルリジン溶液、０．２ｍｇの０．６
７Ｍ、　ｐＨ７，０の燐酸緩衝液と混合し、３０℃で１
５時間反応させた。反応生成物を、高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて、移動相として８０ｍＭ、　ｐＨ４，
３６の酢酸アンモニア緩衝液を１分間あたり１ｍｇの流
速で、分析カラムとして５ＣＸ−１１５１−Ｎ４．６　
Ｘ　１５０＋ｎｍ（商品名、株式会社センシュー科学製
）、検出器は５ｈｏｄｅｘ　ＲＩ　５Ｅ−３１（商品名
、昭和電工株式会社製）を用いて分析した。その結果、
粗酵素液ではフルクトシルリジンが分解してリジン又は
モノフルクトシルリジンの生成が認められたのに対し、
加熱処理した粗酵素液ではフルクトシルリジンの分解は
認められなかった。

第３図に、その高速液体クロマトグラフィーの図を示し
、説明する。第３図ＡはＮｔ−フラクトシルリジンと粗
酵素液を混ぜて反応させたもの、第３図ＢはＮｔ−フラ
クトシルリジンと加熱処理した粗酵素液を混ぜて反応さ
せたもの、第３図Ｃは粗酵素液のみ、第３図りはシフラ
クトシルリジンと粗酵素液を混ぜて反応させたもの、第
３図Ｅはシフラクトシルリジンと加熱した粗酵素液を混
ぜて反応させたもの、第３図Ｆは加熱処理した粗酵素液
のみを高速液体クロマトグラフィーで分析したものであ
る。

第３図Ａより、本酵素がＮｔ−フラクトシルリジンを分
解し、リジンが生成していることが確認される。第３図
りより、本酵素がシフラクトシルリジンを分解しリジン
を生成する、すなわち本酵素がリジンのα、Ｅいずれの
アミノ基にフラクトースが結合したフラクトシルリジン
をも分解することが確認される。また、第３図Ｂ、Ｄの
結果より、加熱処理した粗酵素では、活性がなくなり、
本反応が酵素によるものであることを示唆する。

（ｆ）褐変の低減の確認 Ｎｔ−フルクトシルリジンと、粗酵素を混合した直後の
試液の色は淡褐色であり、分光光度計（株式会社日立製
作所製、３２０型）により４２０ｎｍにおけぬ吸光度を
測定したところ、０．２１３であったが、３０℃１５時
間後の試液の色は無色透明であり、４２０ｎｍにおける
吸光度は０．０５４であり、褐変物質の除去に本酵素が
有用であることがわかる。

実施例２ 実施例１の培養法に準じて湿菌体２００ｇを得た。

−８０℃で凍結後、同重量の石英砂と混合破砕し、６０
＋ｎＭ、ｐＨ７，０の燐酸緩衝液で抽出し、　１ｍｇの
蛋白あたり０．２ｎ＋ｇのプロタミン硫酸塩を加え遠心
後、上清を飽和硫酸アンモニウムで、沈澱を生じさせ、
沈澱を先の燐酸緩衝液で溶解し、同し緩衝液で透析し、
１６０ｍＱの粗酵素液を得た。

フラクトシルリジンの調製法に準じて調製した。

粗酵素液０　、２５＋ｎＱにフラクトシル−α−アラニ
ン、またはフラクトシル−β−アラニンの１００ｍＭ溶
液０．２ｍｇ、６０ｍＭ、　ｐＨ７，０燐酸緩衝液０．
１ｍｇを混合し、３０℃で２４時間反応させた。反応後
、各々０．０２Ｎ塩酸にて１００倍希釈してアミノ酸分
析計（日立製作新製、８３５−５０型日立高速アミノ酸
分析計）で分析した。フラシトシル−α−アラニン、及
びフラクトシル−β−アラニンはこの条件下では完全に
消失し認められず、各々α−アラニン、またはβ−アラ
ニンの産生が認められた。

実施例３ 市販こうじ味噌（原材料大豆、米、食塩、酒精、天然調
味料、化学調味料）　５００ｇに実施例１（ｃ）で調製
した粗酵素液１０ｍＱを加えてよく混合した。

また対照として同じ味噌５００ｇに６７＋ｎＭ燐酸緩衝
液（０，］ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１５ｍＭ
フェニルメタンスルホニルフルオリドを含む。）１０ｍ
ｌを加えよく混合した、両者とも密封容器にいれ、３０
℃の恒温槽に１週間放置したところ、酵素を加えた方に
は褐変が認められなかったが、酵素の入っていない対照
の方は褐変が認められた。また、粗酵素液をいれたこと
により異味異臭もなくすくれたものであることが認めら
れた。

〔発明の効果〕

本発明はフラクトシルリジンまたフラクトシルアラニン
に作用する新規なフラクトシルアミノ酸分解酵素に関す
るものであり、酵素による食品の褐変防止法の実用化に
寄与するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る酵素の至適ＰＨ及び安定ｐＨ範囲
を図示したグラフであり、第２図は本発明に係る酵素の
至適温度と温度安定性を図示したグラフである。第３図
はフラクトシルリジン分解活性の確認図であって、Ａ−
Ｆはそれぞれ次の場合のクロマトグラムである： Ａ：ＮＥ−フラクトシルリジンと粗酵素液を混せて反応
させたもの Ｂ：ＮＥ−フラクトシルリジンと加熱処理した粗酵素液
を混ぜて反応させたもの Ｃ：粗酵素液のみ Ｄニジフラクトシルリジンと粗酵素液を混ぜて反応させ
たもの Ｅニジフラクトシルリジンと加熱処理した粗酵素液を混
ぜて反応させたもの Ｆ：加熱処理した粗酵素液のみ 第　　２ １・ 第　　１ Ｌ′どＩ （−・−）至″Ｉａ温度 （−△−）温度安定性 岑 ピークの高さ ピークの高さ ピークの高さ ピークの高さ ピークの高さ ピークの高さ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）フラクトシルリジン及び／又はフラクトシルアラ
   ニンに作用するフラクトシルアミノ酸分解酵素。
2. （２）ペニシリウム属に属するフラクトシルアミノ酸分
   解酵素生産菌を培地に培養し、培養物からフラクトシル
   アミノ酸分解酵素を採取することを特徴とするフラクト
   シルアミノ酸分解酵素の製造法。
3. （３）フラクトシルアミノ酸分解酵素生産菌がペニシリ
   ウム属に属するペニシリウムｓｐ．５３３５であること
   を特徴とするフラクトシルアミノ酸分解酵素の製造法。
4. （４）ペニシリウムｓｐ．５３３５。
5. （５）請求項１に記載したフラクトシルアミノ酸分解酵
   素を用いて食品を処理することを特徴とする食品の褐変
   防止方法。