JPS5840471B2 - グルタミン酸脱水素酵素の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルタミン酸脱水素酵素の製造方法、更に詳し
く言えば、エンテロバクテリアシイ科のプロテウス属に
属する細菌の菌体内産生グルタミン酸脱水素酵素の製造
方法に関するものである。

従来、グルタミン酸を酸化してα−ケトゲルタール酸と
アンモニアとする公知のグルタミン酸脱水素酵素として
は、酵素番号１．４．１．２．．１．４．１．３．１、
４．１．４が挙げられ、これらの酵素は次式で示す反応
を触媒する。

１４．１．２はＮＡＤ依存性で、高等植物、ゴキブリの
筋ミトコンドリア、アカパンカビに存在し、１、４．１
．３はＮＡＤ、ＮＡＤＰ両依存性で、動物の肝臓、ミト
コンドリアに存在、１．４．１．４はＮＡＤＰ依存性で
アカパンカビに存在するとされている〔酵素ハンドブッ
ク、第５版第１１１頁〜第１１３頁（１９７０）、朝食
書店参照〕。

また、この酵素の調製法としては、メノウズ・イン・エ
ンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ＝
１ｏｇｙ）１７巻、Ａ、第８３９頁〜第８５６頁（１９
７０年）、〔アカデミツクプレス （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ）発行〕にオタマジ
ャクシの肝、ツノザメの肝、酵母の起源からのグルタミ
ン酸脱水素酵素の抽出法が記載されている。

更に、ジ・エンザイムス（Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ ）
１１巻、第２９３頁〜第３６７頁（１９７５）（アカ
デミツクプレス発行〕にグルタミン酸脱水素酵素の総説
があり、種々の起源のグルタミン酸脱水素酵素について
記載がある。

本発明者は、微生物よりグルタミン酸脱水素酵素を工業
的に製造する方法を確立するために各種細菌、酵母、カ
ビについてグルタミン酸脱水素酵素の産生能を検索した
結果、種々の細菌に活性が認められたが中でもプロテウ
ス（Ｐ ｒｏｔｅｕｓ ） 属の細菌が驚異的に強いグ
ルタミン酸脱水素酵素活性を有することを見出し、その
菌株の培養法、酵素の抽出法、及び精製法を確立し、本
発明を完成した。

本発明において使用可能な菌株は、例えばプロテウス・
イノコンスタンスＩＦＯ１２９３０，プロテウス・バル
ガリスＩＦＯ３０４５、プロテウス・ミラビリスＩＦ０
３８４９などが挙げられるが、これらの菌の他にフロテ
ラス属の細菌であってグルタミン酸脱水素酵素を生産す
る菌はすべて本発明方法において使用することが出来る
。

本発明の方法を実施するにあたっては、プロテウス属の
グルタミン酸脱水素酵素生産性を抗生物質、酵素などを
生産する通常の方法で培養する。

培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、工業的
にはグルタミン酸脱水素酵素生産菌の細胞をその生産用
培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利であ
る。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用される。

窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例
えばコーン・スチーブ・リカー、大豆粉、ペプトン、種
々の肉エキス、酵母エキス、グルタミン酸、グリシン、
硫安、塩化アンモニウムなどが使用される。

これら窒素源１種以上にリン酸１カリ、リン酸２カリ、
硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄、硫酸マンガンなど無機塩類の１種以上を加え
、さらにグルコース、グリセリン、糖蜜、スターチ加水
分解物等の炭素源を１種以上必要に応じて加え、ビタミ
ンなどを適量添加したものが用いられる。

但し、培地中にグルタミン酸を添加せしめることによっ
て培養物中の酵素の生産性を良好にせしめることはない
。

培養温度は、菌が発育しグルタミン酸脱水素酵素を生産
する範囲内で適宜変更し得るが、特に好ましくは３０℃
前後である。

培養時間は条件によって異なるが、通常１５〜３０時間
程度であって、グルタミン酸脱水素酵素が最高力価に達
する時期をみはからって適当な時期に培養を終了すれば
よい。

また、培地の初発ｐＨは７〜８に調節するのが適当で、
通気、攪拌深部培養または振盪培養等により好気的に培
養するのが好ましい。

かくして得られたグルタミン酸生産菌の液体培養の培養
物中において酵素はその菌体内に含有、蓄積されている
。

この様にして得られた培養物中よりグルタミン酸脱水素
酵素を抽出するための一例を挙げれば、まず培養物を固
液分離し、得られる湿菌体を必要に応じて、リン酸緩衝
液などの溶液を用いてリゾチーム処理、超音波処理、フ
レンチプレス処理など種々の菌体処理手段を適宜選択組
合せることにより粗製の酵素含有液が得られる。

次いで、この粗製のグルタミン酸脱水素酵素含有液は、
さらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製手段を用い
て、精製された酵素液を得る。

例えば、粗製のグルタミン酸脱水素酵素含有液にアルコ
ール、アセトンなどの有機溶媒、あるいはポリエチレン
グリコールによる分別沈澱法、硫安、食塩などによる塩
析法などを用いて水溶液から酵素を分画沈澱せしめ、回
収すればよい。

さらに、この酵素の精製品を得るためには、グルタミン
酸脱水素酵素の性質を利用した手段を用いればよい。

例えば、上記の沈澱物をリン酸緩衝液などの媒体に溶解
し、これをジエチルアミノエチル−セルロース、ジエチ
ルアミノエチル−デキストランゲル架橋体などの陰イオ
ン交換樹脂による吸着クロマトグラフ法を行なうことが
できるし、また、これらの手段を適宜組合せて精製する
こともできる。

次いで、これを真空凍結乾燥手段などにより乾燥してグ
ルタミン酸脱水素酵素の精製粉末を得る。

本発明によって得られるグルタミン酸脱水素酵素は、以
下に述べる酵素化学的性質を有するものである。

（１）作用 前記反応式の如く反応し、グルタミン酸を酸化してα−
ケトゲルタール酸とアンモニアとする。

（２）力価の測定法 ０、５ Ｍグリシン−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，５）０
．２ｍｌ、０．０１ Ｍ ＮＡＤＰ＋０．１ｍＡ！、
Ｉ Ｍグルタミン酸（ＫＯＨにてｐＨ１０，５に調整
）０．２ｍｌ、および蒸留水２．Ｏｒｒｔｌよりなる反
応液２．８ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、２５°Ｃで
反応せしめ３４０ ☆々 扉μでの吸収増加ＪＥを測
定する。

酵素活性は、１分間に１μｍｏｌｅ のＮＡＤＰＨを
生成する活性を１単位とした。

また、力価の算出は次式に従う。また、逆反応について
は、０．５ ＭＫ −Ｋ３！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ９，５
） ｏ、 ３ＴＬｌ、０．２５ＭＮＨ４Ｃｌ （ｐＨ９
，５にＫＯＨで調整）０．２ｍｌ、０．０６３Ｍ α
−ケトゲルタール酸（ｐＨ９，５）０、２ ｒａｌ、
１０ ｍＭ ＮＡＤＰＨＯ，１ｍｌおよび蒸留水２．
Ｏｒｎｌよりなる反応液２．８ｍｌに酵素液０．２
ｍｌを加え、２５°Ｃで反応せしめ３４０ｍμでの吸収
減少を測定する。

（３）基質特異性 グルタミン酸に対し特異的で、グルタミン酸以外のアミ
ノ酸にはまったく作用しない。

この酵素のグルタミン酸に対するｋｍは上記活性測定条
件で２０ｍＭ、ＮＡＤＰ＋に対しては０．２６ｍＭ、又
逆反応で、α−ケトゲルタール酸に対し１．１４ｍＭ、
ＮＡＤＰＨに対し０．１４ ｍＭである。

（４）至適ｐＨ グリシン−ＫＯＨ緩衝液などを用いて本酵素のグルタミ
ン酸に対する酵素活性を測定した結果、その至適ｐＨは
正反応ではｐＨ１０，５附近、逆反応ではｐＨ９，５附
近であった。

（５） ｐＨ安定性 ｐＨ３はグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ４〜ｐＨ５は酢酸
緩衝液、ｐＨ６〜ｐＨ７はリン酸緩衝〕液、ｐＨ８〜ｐ
Ｈ９はトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ１０〜ｐＨ１２はグリ
シン−ＫＯＨ緩衝液を終濃度ＩＭとなるように用い、酵
素溶液１５ｕ／ｍｌを各ｐＨで５°Ｃ１１５時間放置し
た後の残存活性を測定した結果、ｐＨ４〜ｐＨ９で安定
であった。

（６）熱安定性 （５）と同じ緩衝液、酵素液を各温度で２０分間反応し
た後、残存活性を測定した結果、４０℃附近では安定で
あり、４０’Ｃ附近を超える温度では急速な活性の低下
が認められた。

（７）至適温度 上記力価の測定法における測定法を利用して、その温度
条件を変えて酵素反応を行ないグルタミン酸脱水素酵素
のグルタミン酸に対する酵素活性を測定した結果、その
至適温度は、正反応では４０°Ｃ附近、逆反応では５０
℃附近であった。

（８）種々の物質に対する影響 上記の力価の測定法において、種々の添加物を加えてグ
ルタミン酸脱水素酵素のグルタミン酸に対する酵素活性
を測定した結果は、表１の通りである。

但し表中の数字は残存活性率を表わしている。

本発明により得られたグルタミン酸脱水素酵素は、安定
性のよいものであり、適当な塩類、例えば食塩、硫安、
その他の中性塩、特に硫安の懸濁状態に於ける経口的安
定性は、冷室（０〜５℃）に保存すれば１ケ月の後に於
いてもその活性を１００％保持している。

本発明のグルタミン酸脱水素酵素を用いることにより、
生体試料、あるいは溶液中の微量のグルタミン酸、α−
ケトゲルタール酸、アンモニウムを測定することが本酵
素の反応機構より可能であり、臨床検査への応用が期待
される。

例えば、トランスアミナーゼの活性（ＧＯＴ、ＧＰＴ、
γＧＰＴ）を測定することが可能である。

すなわち、トランスアミナーゼ反応にまり虫取したグル
タミン酸を本酵素での酵素反応と組合せてグルタミン酸
を定量することによりこの目的が達成される。

次に実施例をあげて本発明の方法を具体的に説明するが
、これによって本発明の方法は制限されるものではない
。

実施例 グリセリン１（Ｗ／ｖ％）、グルタミン酸ソーダ１（Ｗ
／Ｖ％）、コーンステイープ・リカー０．２（Ｗ／Ｖ％
）、リン酸２カリｏ、 １（ｗ、”ｖ％）からなる培地
（ｐＨ７，５）２０Ｊをジャーノアメンタ−３０１容に
入れて高圧滅菌したものに、ニュートリエンドブロス（
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ）であらかじめ２０
時間前培養したプロティウス・イノコンスタンスＩＦＯ
１２９３０の種菌液２００１１１１を接種し、通気攪拌
深部培養を３０℃で２０時間行なった後、冷却連続遠心
機により菌体を分離し、約２００ｆの湿重量菌体を得た
。

次いでこの湿菌体を２００１ｒＬｌの０．ＯＩＭ！Ｊン
酸緩衝液ｐＨ７，０に懸濁して２０ＫＨｚ、１５０Ｗの
超音波で１０分間処理して菌体破壊を行ない粗酵素抽出
液（Ｉ）を得た。

次にこの抽出液に２０％飽和になるように硫安を添加、
更に２００ｍ１の冷アセトンを添加してから８０００ｒ
、ｐｏｍ、１５分間遠心分離し、上清を得る。

この上清に３倍容の冷アセトンを添加して８０００ｒ、
ｐ、ｍ、５分間遠心分離して沈澱を得る。

次に、この沈澱を適量の０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液にと
かし、−晩０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液に対して透析酵素
液（ＩＩ）を得た。

次に、０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０＋ ０．１
ＭＮａＣｌで緩衝化したジエチルアミノエチル・セルロ
ースに透析酵素液を吸着させ、未吸着雑物を同一緩衝液
＋０．１ＭＮａＣ１で洗い流したのち、同一緩衝液でＮ
ａＣ１濃度を０．１Ｍから０６Ｍまで段階的にあげて溶
出し、活性部を集めグルタミン酸脱水素酵素溶液叫を得
た。

次に、この酵素溶液を更に同一緩衝液＋０．１ＭＮａＣ
１で緩衝化したジエチルアミノエチル・セファデックス
に吸着させ、上記と同様に、ＮａＣ１濃度を０．１ Ｍ
から０．５ Ｍまで段階的にあげて溶出した。

酵素活性部を５５％飽和硫安で塩析して集め、０．０１
Ｍ’Ｊン酸緩衝液に対して一晩低温にて透析し、精製透
析酵素液■を得た。

この透析酵素液に乳糖２９０■添加して凍結乾燥を行な
い。

精製グルタミン酸脱水素酵素標品（７）４１０■を得た
。

以上の精製工程について各段階の酵素活性と収量を表２
に示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ プロテウス属に属するグルタミン酸脱水素酵素生産
   菌を通常の細楯培養培地で培養し、得られた菌体からグ
   ルタミン酸脱水素酵素を採取することを特徴とするグル
   タミン酸脱水素酵素の製造方法。