JPS60164496A - 低分子ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ド組成物の製造方法に関するものである。

一般にプロテアーゼを用いて蛋白質を加水分解すること
は食品加工分野で広〈実施烙れているが、目的は例えば
肉の軟化、蛋白の可溶化等葉材として良好な性質を得る
ために行われたシ、不要な蛋白部分を除去するための処
理などが多い。又醤油製造に於いては出来るだけアミノ
酸にまで分解する条件が研究され応用されている。最近
、アミノ酸とベグチドのＷｂ管における消化吸収に関す
る研究が進み、アミノ酸よシも低分子ペグチドの方が腸
管吸収が良いとの結果が得られつつある。すなわち、ジ
ペプチド、トリペプチドの吸収速度は遊離アミノ酸よシ
も速い。またこれらの低分子ペプチドは、アミノ酸吸収
疾患の処置に有用であるという証明もある。

本発明者等はこの様な低分子ペプチドを主成分とする加
水分解物を得る条件ｖｉ一種々検討した結果アルカリ側
に至適ｔｌを有するプロテアーゼをアルカリ性の水性媒
体中で、蛋白質に作用させるとすみやかに蛋白質が加水
分解場れ、平均アミノ酸鎖長６〜１０のペグチドが生成
されるが、その後の長時間の作用にもかかわらず、これ
以上低分子の一″ｅｆチドを生成することはない。従り
て、目的とする平均アミノ酸鎖長２〜５のペグチドを高
収率で得ることはできない。しかし、該プロテアーゼを
酸性から中性範囲の水性媒体中で蛋白質に作用させると
、平均アミノ酸鎖長６〜１０のペプチドでとどまらず、
さらに低分子化されて目的とする平均アミノ酸鎖長２〜
５のペプチドまでに加水分解され、かつ遊離アミノ酸生
成量は極めて少ないため〆高収率でアミノ酸鎖長２〜５
のペプチドが生成されることを見い出した。

刈 本発祐はこの知見に基づいて完成されたものである。即
ち本発明はアルカリ側で至適ｔＩヲ有するプロテアーゼ
ｔ−ｆｆ性から中性の水性媒体中で蛋白質に作用させ平
均アミノ酸鎖長２〜５の一２７°チドを主成分とする低
分子ペプチド組成物を製造することを特徴とする低分子
ペプチド組成物の製造方法に関する。

本発明に用いることのできるアルカリ性側に至適ｐＨ２
有するプロテアーゼは主として細菌及び真菌由来のもの
である。

これらのアルカリ性側に至適ｐＨ’ｔ’有するプロテア
ーゼは蛋白質の加水分解活性においてはｐｌ（Ｂ〜１１
に至適ｐＨｔ−有するプロテアーゼであシ、一般にアル
カリ性プロテアーゼと呼ばれている。このよう人アルカ
リ性ゾロテアー賃としては例えばバチルス嗜ズブチリス
（Ｂａｃｌｌｌｕａ　ｓｕｂｔｌｌｉｍ）由来のアルカ
リ性プロテアーゼである「ゾロリシン」（上田化、成）
があｐ、該アルカリ性プロテアーゼはｐＨｇ〜１０に最
適ｐ）１ｔ−有する。又特公昭５０−７１５７記載のバ
チルス属のアルカリ性プロテアーゼ（Ｓ、　Ｔｏｂ＠＃
　Ｔ、Ｔａｋａｍｉ　ｙＹ、Ｈｌｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｋ
、　ＭｌｔｓｕｇｌｓＡｇｒ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、、
　３９　ｅ　１７４９　ｅ　１９７５　）はｐ）（ｔｉ
に最適ＰＨヲ有する。さらに、バチ手ス・リケニホルミ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈａｎｌｆｏｒｍｉｓ　
）のアルカリゾロテア−Ｖであるアルカラーゼ（Ａｌｃ
ａｌａｓｅ　Ｏ，６Ｌ　）（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕａｔｒ
ｉ　Ｉｙ’Ｓ　Ｂａｇｓｔａｅｒｄ　Ｄｅｎｍａｒｋ　
）はｐＨ８，０に最適−１を有する。本発明で使用する
アルカリ性プロテアーゼは上記のプロテアーゼに限ラス
、他のアルカリ性プロテアーゼも使用できる。

本発明において使用する蛋白質は一般に入手可能な蛋白
質であればどのような蛋白質でも使用できる。例えばミ
ルクカゼイン、ラクトアルブミン又は卵白アルブミンな
どの動物性蛋白質、ないし大豆蛋白又は小麦グルテンな
どの植物性蛋白などがある・ 本発明で使用する蛋白質の濃度は２〜３０％であるが、
使用する蛋白質の種類及びプロテアーゼ添加量によシそ
の濃度は異なる。また反応液の、ＨはＮａ０）Ｉ又はｎ
ｃｚ　１用いて調整し、酸性側でＶ；電点沈澱を起す場
合は中性（ｐｌｉ　６．８〜７．０）で反応を開始し、
蛋白質がある程度加水分解させた後であればＰＨヲ酸性
側に低下させることができる。

反応温度は使用するプロテアーゼの至適反応温度が好ま
しい。通常使用されているゾロテア・−ゼでは３０℃〜
７０℃、好ましくは４０℃〜６０℃で行なう。

反応時間は使用する蛋白質及びプロテアーゼの量及び性
質によって異なるが８時間から４８時間、好ましくは１
６時間から２４時間である。

本発明の方法で反応を行うと蛋白質はアミノ酸鎖長が２
〜５のペプチドに加水分解され、それ以上に加水分解さ
れないために反応を停止する目的のためにプロテアーゼ
を失活させる操作は必要とせ尤工程管理は極めて容易で
ある。目的とする（グチドを水溶性媒体中から取上げる
工程でプロプの温度で５分以上の熱処理を行うか酸又は
アルカリなどを添加する等の通常の酵素失活処理を施せ
ば良い。目的とするペプチドを水溶性媒体中から取上げ
る工程でプロテアーゼを失活させない場合には限外濾過
等によシ除去させることができる。

反応は静置又は攪拌のどちらの条件でも良いが、水浴性
媒体に溶けにくい蛋白質上使用する場合には悄拌を行う
ことにより、反応が著しく促進嘔れるので攪拌すること
が好ましい。但し、高速度で、１１拌すると水溶性媒体
中に微生物が存在する場合には、該微生物の増殖が活発
になり目的とするペプチドの生成量を低下させる恐れが
あるので蛋白質が均一に懸濁できる程度の低速攪拌が望
ましい。

本発明において水性媒体中に生成した目的とするペプチ
ドを取り上げる方法は下記によれば良い。

即ち、水性媒体中に不溶物が混在する場合は還心分離又
は濾過等の不溶物除去処理を施した後に、目的とする一
２ｆチドを取シ上げれば良い。水性媒体中に不溶物質が
混在しない場合はそのまま目的とするペプチドを取上げ
ることが可能である。目的とするペプチドの取上げ法は
凍結乾燥法又はスゲレードライ法などの通常の乾燥法が
使用される。

上記の方法で得られた生成物の分析方法は次の通りであ
る。

（１）生成物の収率（Ｙ） 全窒素はケールプール法によって分析した。

（２）生成物の平均Ｒｆチド鎖長（Ｌ）アミノ基の定量
はＴＮＢＳ（Ｔｒｌｎ口ｒｏｂｅ、ｄ’ｚｅｎｅ　ａｕ
ｌｆｏｎｉａａｃｌｄ　）法によシ、完全加水分解は６
Ｎ組ｌＣ６中で１１０℃、２４時間加水分解によって行
った。遊離アミノ酸の定量はアミノ酸自動分析機で行っ
た。

（３）分子量分布 ペプチド組成物の分子量分布は次の３手段によりて測定
した。■５ｅｐｈａｄｔｘ　Ｇ　−５０カラム（１５Ｘ
４５ｆｉ）？使用し、０．０１　Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４を
平衡・溶出液として用いてｒルｐ遇した。■Ｓｈｏｗｄ
ｅｘ　−■■Ｂ−８０４カラム８ｗＩＩＩφＸ５００ｍ
ｍを使用し、０．０２ＭＮａ２１（ＰＯ４ｆ溶出液とし
て用い高速液体クロマトグラフィーを行った。検出は高
感度示差屈折計５ｈｏｄｅｘＲ１、Ｍｏｄｅｌ　Ｓ　Ｅ
　−１１を用いた。■ＴＳＫＧｇＬ　Ｇ−２０００！ｌ
１ｗカラム、８慎φＸ５００ｍ溶出液０．ＯＩＭリン酸
バッファー（ｐｔ１６．８）？用いて高速液体クロマト
グラフィーを行った。検出は示差屈折又はＵＶ２１０ｎ
ｍで行った。

本発明の方法は一般にバチルス属等の細菌よりであシ、
また反応のＰＨを酸性〜中性に調整することは容易であ
り、更にこれらの酵素は比較的高温に耐え５０℃以上で
も使用出来、短時間で目的とするペプチドを得ることが
出来るので工業的に大変有利なアミノ酸鎖長２〜５のペ
プチドを得る方法と云える。

次に本発明の詳細全実施例を挙げて説明する。

実施例１ カゼインオーストラリアソジウムカゼイネート（Ａｕｓ
ｔｒａｌｉａｎ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃａ５ｅｉｎａｔｅ　
）５１１　ｆ水又は必要があれば熱水に溶解させた後、
５０℃でＮａＯＨ又はＨＣＬによってＰＩ（−ｉ５〜１
１ＶＣ１全容量ｔ−１００ｍＪに調整し、「ゾロリシン
」（上田化成）０．２１９を添加しｐｉ（をスタートの
ｐＨに維持しつつ５０℃で低速で攪拌しながら２４時間
反応させた。反応後、反応液を１００℃で１０分間加熱
して反応を停止させた後、１２．００Ｏｒｐｍ　（１５
，０ＯＯＧ）で１５分間遠心分離し不溶物を除去し上清
画分を凍結乾燥した。この標品の遊離アミノ酸含量と平
均ペプチド鎖長（構成するアミノ酸の数）の結果を第１
表に示した。

第１表 １０　４．３　９．８　８９ ９　３．９　７．６　９０ ６”　２．８　ム　９２ ５”　２．６　４４　９２ ｗＪ１表が示す如く、反応のＰＨを５〜７に維持するこ
とにより、平均ペプチド鎖長はアルカリ側での反応の場
合よりも短かくなシ、平均ペプチド鎖長が３．６〜４．
８個の一！ゾチドが４．５Ｎ得られた。

実施例２ 実施例１の條件のうちゾロリシンの代ルにアルカラーゼ
（Ａｌｅａｌａｓｅ　Ｏ，６Ｌ　、　Ｎｏｖａ社）０．
４ＩＩｔ５ｇのカゼインにｐＨ６，９，５０℃で、４８
時間作用させ、実施例１に従って４．４１１のペプチド
を得た・この標品の平均ペプチド鎖長は２．４、遊離ア
ミノｉ！（支）含量は６．５チであった。

実施例３ 実施例１の條件でゾロリシンの代シに長瀬産業製のアル
カリ性プロテアーゼである「ビオゾラーゼコンクＪ０．
ＩＩｌを５ｇのカゼインにｆｌ　６．０で１６時間作用
させた結果４．３．９のペプチド組成物が得られた。こ
の標品の平均ペプチド鎖長は３，５、遊離アミノ酸含量
は６．５チであった。

実施例４ カゼインの代りにラクトアルブミン（オーストラリア製
）、卵白アルブミン（東京化成）及び大豆蛋白（アジゾ
ロンＥ２当社製）にゾロリシンをｐＩ（６，０で作用し
実施例１に従ってペプチド組成物を調製した。これらの
ペプチド標品の平均鎖長、遊離アミノ酸含量及び収率の
値を第２表に示した。

第２表 ラクトアルブミン　６．１　４謔２，９　８５卵白アル
グミン　７．２　２．７　８８得られ、ラクトアルブミ
ン、卵白アルブミン、大２．２ 豆蛋白質の平均鎖長はそれぞれ鱈、　２．７　＃　４．
５であシ、遊離アミノ酸含量は、それぞれ６．１　＝　
７．２＃３．５％でありた。

出願人　味の素株式会社 手続補正書 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２０４０７２ ２６発明の名称 低分子ペプチドの製造方法 ３、補正をづる者 事件との関係　特許出願人

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ｐＨ９ないしｐＨ１１，０のアルカリ側に至適Ｐｌ（を
   有するプロテアーゼｔ″ｐＨ５，６ないしｐＨ７，０の
   酸性から中性の水性媒体中で蛋白質に作用させ平均アミ
   分子ペグテドを製造すること全特徴とする低分子ペプチ
   ドの製造方法。