JPS60172995A - 改良γ−ヒトインタ−フエロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えＤＮＡ操作の分野に属し、このような操
作を用いてヒトγ−インターフェロンの合成をコードす
る好ましいＤＮＡ配列を発見する手段および方法に関す
る。

さらに詳しくは、本発明は、ヒトγ−インターフエロン
および改良ヒトγ−インターフェロンのアミノ酸配列を
特定する両情報乞コーｒするＤＮＡ配列の設計および構
築、これらのγ−インターフェロンＤＮＡ配列を含有す
るシラスミドによる微生物の形質転換、ならびにこれら
の形質転換プラスミドのγ−インターフェロン製造への
利用に関する。

従来技術 インターフェロン（工ＦＮ　）は、ウィルス、ミドダン
および他の各種物質による刺激に応じて、哺乳類動物の
細胞内に合成される一群の蛋白質である。インターフェ
ロンに関する初期の研究は、イ、つばら、標的細胞に抗
ウイルス状態を誘導するその能力に集中されていたが、
最近になって、インターフェロンには細胞増殖阻止作用
および免疫応答調節作用のあることが明らかにされてぎ
た（１）・。

インターフェロン類はウィルス感染や悪性腫瘍の治療に
使用できる可能性が考えられるが、利用できる量がわず
かであったり、不純物を営んでいたりするために、その
研究は進んでいない。

ヒト免疫（γ）インターフェロンの天然のアミノ酸配列
およびＤＮＡ配列は英国特許出願ＧＢ２　１０７　７１
８Ａおよび欧州特許出願第００８８５４ＯＡ２号に開示
されている。

ヒトインターフェロンはその抗原性および生物学的、化
学的性質によって６種に分類されている。

ＩＦＮ−α（白血球）、工ＦＮ−β（線維芽細胞）およ
びＩＦＮ−γ（免疫）である。ウィルス誘導性の酸に安
定なインターフェロン（工ＦＮ−αおよび工ＦＮ−β）
については最も詳細に研究されている。

組換えＤＮＡ操作の利用によって工Ｉｉ″Ｎ−βや数種
の工ＦＮ−αのアミノ酸配列の推定が可能になり、さら
に、工ＦＮ−αと工ＦＮ−βは大腸菌内での合成にも成
功している。その結果、生物学的活性のための大量のイ
ンターフェロンの精製もできるようになった。

これに反し、工ＦＮ−γの性質については、それ程知ら
れていない。工ＦＮ−γは酸に不安定で、工ＦＮ−αお
よび工ＦＮ−γに対する抗血清と交叉反応しない。ＩＦ
Ｎ−γは広範囲の生物学的活性な有する（２）　、　（
３）　、　（４）。工ＦＮ−γは工ＦＮ−αおよびＩＦ
Ｎ−βの抗ウィルス活性を増強するが、そのウィ〜ルス
および標的細胞特異性において液安定性インターフェロ
ンとは異なっている（２）。しかしながら、不純なＩＦ
Ｎ−γによるｉｎ　ｖｉｔｒｏの研究では、ＩＦＮ、−
γの重要な活性のひとつは、免疫応答の調整であること
がわかっている（３）。形質転換細胞に対する工ＦＩＪ
−γの抗増殖作用は、工ＦＮ−αや工ＦＮ−βの１００
倍はどであって（４）、工ＦＮ−γには悪性腫瘍の治療
に応用できる可能性がある。マウスの工ＦＮ−γはマウ
ス肉腫に対して著明な抗腫瘍作用乞示す（５）。

最近、ヒトエＦＮ−γをコードするｃＤＩＩＡが大腸菌
内にクローニングされたｆ６）ｉ７）。工ＦＮ−γのア
ミノ酸配列が推測され、成熟ポリベゾチドは１４６個の
アミノ酸長を有することがわかった。工ＦＮ　−γは大
腸菌内および真核生物システム内で発現されている（６
）。その発現レベルは、同一発現システム内では、１Ｆ
Ｎ−αや工ＦＮ−βの場合に比べてはるかに低い。大腸
菌内での工ＦＮ−γの発現レベルが比較的に低いのは、
原核生物システム内でのコドン用法がヒト遺伝子の場合
とかなり相違することによるものと思われる（８）。原
核生物において至適表現が可能なように溝築された合成
γ−インターフェロン遺伝子が得られれば、より多量の
インターフェロンが合成され、回収されるようになるも
のと考えられる、 発明の要約 本発明は、組換えＤＮＡ操作の分野に属し、このような
操作を用いて、ヒトγ−インターフェロンの合成をコー
ドする好筐しいＤＮＡ配列を発見する手段および方法に
関する。

本発明は、天然のγ−インターフェロンアミノ酸配列を
コードする改良ヌクレオチド配列を提供する。この新規
なヌクレオチド配列は優れた性・直ヲ有し、ヒトインタ
ーフェロンボリペゾチドを製造するための発酵過程に使
用できる。また本発明は、改良γ−インターフェロンに
関するアミノ設配列、ＤＮＡヌクレオチド配列およびプ
ラスミドを開示する。

さらに詳しくは、本発明は、ヒトγ−インターフェロン
のアミノ酸配列を特定する情報をコードするＤＮＡ配列
の設計および構築、γ−インターフェロンＤＮＡ配列を
含むプラスミドの設計および構築、γ−インターフェロ
ン遺伝子を含むシラスミげによる畝生物の形質転換、な
らびにγ−インターフェロンな゛製造するだめの形質転
換微生物の利用に関するものである。

改良ヒトγ−インターフェロンはＬ７ｅｌｌｌがＧ１ｎ
１１１によって置換されていて、そのアミノ酸配列は第
１２図に示すとおりである。

本発明の背景を明瞭にするため、また実施例中でさらに
詳細の参考となるように、文献、特許等を明細書中に引
用したが、引例には引用個所に引用順の番号で示し、そ
の文献名等は明細書の末尾に表示した。

本発明の好ましい態様 ＩＦＮ−γの合成を改良するための方向は、特定の宿主
における発現に至適のコーンを導入した合成遺伝子を組
立てることであった。デオキシオリゴヌクレオチドの合
成における最近の進歩（９）は、工ＦＮ−αをローＰτ
る遺伝子のような大きいＤＮＡ二本鎖の合成を可能にし
た。コドンの利用の至適化に加えて、遺伝子の化学的合
成圧よりいくつかの強力な利点が得られたのである。丁
なわち、遺伝子は各種発現ベクターに挿入できるように
設計され、適当な制限部位が導入されることにより、修
飾またはハイブリッドインターフェロン形成時のＤＮＡ
の挿入または欠失が容易になったのである。

ヒトエＦＮ　−ｒをロー１する合成遺伝子が設計され、
構築された。４４６　ｂｐ二本鎖を最初にｐＡＴ１５６
にクローニングし、ついで発現ベクターにクローニング
した。

ヒトγ−インターフェロンのアミノ酸配列をコードする
遺伝子を、完全遺伝子の構築のために用いた４６個のオ
リゴヌクレオチドとともに第１図に示す。発現ベクター
を形成させるための遺伝子操作過程で、２個所のヌクレ
オチド変化が生じた。

これを第６図に示す。これらの２個所のヌクレオチＰの
変化により、１）　Ｈ１８２２の無影響または保存的コ
Ｐン変化（ＯＡＴ　−＋　ＯＡＯ）、および２）　（Ａ
ＡＡ−＋　ＯＡＡ　）によるＬ７Ｓ１１１のＧ１ｎ１１
１への変化により表現型の変化を生じた。

例１にはγ−インターフェロン遺伝子をローｒする遺伝
子の構築を記載する。例２には、工ＦＮ　−γ（Ｇｌｎ
□０、）をコードするシラスミドと、工ＦＮ−γ（Ｌｙ
Ｂｌｌｌ）をコードする矯正プラスミドの構築を記載す
る。例６には、工ＦＮ−γ（Ｌｙｓｌｌｌ）および工Ｆ
Ｎ−γ（Ｇｌｎよ０、）の生物学的性質を記載する。

以下のプラスミド一覧表には、使用したシラスミドの性
質と、その由来または構築方法をまとめる。ＩＦＮ　ｒ
　（ＬＹＥｌｘｘ、）および工ＦＮｒ　（Ｇｌｎ、□）
の両者の製造に用いたシラスミＰはいずれも、Ｈ１θ２
２についてはＯＡＯコドンをもっている。製造したシラ
スミドはすべて、アンピシリン抵抗性、テトラサイクリ
ン感受性である。ｐＸＹ　２プラスミドは、転写と発現
を改良するために、ｆロモーターとリポソーム結合部位
を挿入した。「成熟」の語は、融合ポリペプチドの不存
在およびＮ−末端メチオニンの存在を示すために使用し
た。

シラスミド一覧表 プラスミド　性　質　由来または構築法ｐＸＹ　１　工
ＦＮ　ｒ　（Ｇｌｎ　Ｉｌｌ　）　第２図含有 ｐＷＴ２３＋１　発現ベクター　〃 （（＋Ｂ　２０５２５１３　Ａ　） ｐ、ＴＢ　１　ローコピーＴｒｐ　Ｆｉ　ｔｔ融合 工ＦＮγ（Ｇ１ｎ１□、） ｐＷＴ　１１１００ｐ　発現ベクターの　第４図ハイコ
ビーミュータント （ＧＢ２０５２５１３　Ａ　） ＰＪＢ　２　ハイコピーＴｒｐ　Ｈｔｔ融合 工ＦＮ　ｒ　（Ｇｌｎｘ、ｘ） ｐ１２４ｃ　よりｙ−β　第５図 発現ベクター （ＧＢ８１０２０５１　） ｐＸＹ　２　ローコピーＮ末端Ｍｅｔ　’　ｔｔ工ＦＮ
　ｒ　（Ｇｌｎ　ｘ　ｌ　□） ｐＸＹ１０３　工ＦＮγ（Ｌ７’１ｌｌ）含有　第６図
ｐＪＢ２ｆ３５　ハイコピーＴｒｐ　ｎ融合　第７図工
ＦＮγ（Ｌｙｅよ０、） ｐＣＣｌ　ハイコピーＮ末端Ｍｅｔ　第８図工ＦＮγ（
Ｌ３”ｌ１ｌ） ｐａｃ１０３　ハイコピーＮ末端Ｍθｔ　第９図ＩＦＮ
γ（Ｉ、ｙｓ工１１） ｐｏｏ　２　ハイコピーＮ末端ＩＦＮｒ　第１０図（”
ｎ１１１）高頻度発現 ｐａｃ２［］３　ハイコピーＮ末端工ｒＮｉ　〃（Ｌ７
θ１１１）高頻度発現 使用したＦｉ、ｃｏｌｉ菌株はＦｉ、Ｃ，０１１５ｔｏ
ｃｋ　ｃｅｎｔｅｒ（Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅａｉｃｉｎｅ　、　５Ｑ［
１３３Ｂｅｄａｒ　５ｔｒｅｅｔ　、Ｎｅｗ　Ｈａｖｅ
ｎ　ｌＩ　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　、ＵＳＡ）から入
手できる。

シラスミドＩ）Ｃｏ　２およびｐｏｏ　２０３は、それ
をもツＥ＋ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株ＨＢ１０．１がＡｍ
ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ　（１２６０１ＰａｒｌｃｌａｗｎＤｒｉｖｅ
　、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　％　Ｍａｒｙｌａｎａ　２
Ｑ８５２　、ＵＳＡ）に寄託されている。ｐａｃ２を含
有するものはＡＴｅａ／Ｉｇ３　（Ｌ４９３、ｐａｃ　
２０３を含有するもの　゛はＡＴＯＯｙｔ６３９Ａ’９
４である。

ひとつの合成遺伝子はＬ７’ｌｌｌがＧ１ｎ１１１で置
換された修飾ヒトγ−インターフェロンポリペプチドの
合成をコードした。この遺伝子は、のちにＬ３’８１１
１含有ヒトγ−インターフェロンの合成をコードするよ
うに改変された。

合成りＮＡ二本鎖の配列は′？Ａ１Ｍに示す。この遺伝
子の設計にはいくつかの基準を設けた。コドンの利用は
に、　ｃｏｌｉでの発現に至適となるようにした（８）
。たがいにアニールする可能性や以後のりグージョンで
問題を生じる可能性がある配列をコンピューターで精査
した。これらの配列は、遺伝子コードに必須でない限り
除去した、最初、合成遺伝子はｐＡＴ　１５５のＨｌｎ
ｄ　ｌｌおよびＳａ’ｌ　Ｉ部位にクローニングするよ
うに設計した。ｐＡＴ　１５３に宮まれていないいくつ
かの他の制限部位も合成遺伝子の配列に挿入した。これ
らの独特の制限部位はクローン化遺伝子の解析ならびに
ハイデリッＰまたは修飾配列の形成を容易にする。

遺伝子のｐＷＴ　２３１への挿入により、ｔｒｐｆｆｉ
ポリペプチドから１２個のアミノ酸を含む融合ポリペプ
チドとして工ＦＮ−γの発現を可能にする。成熟工ＦＮ
−γポリペプチドの発現のためには、この合成遺伝子を
ＢａｍＨ１部位で開裂し、合成リンカ−にＯｌａ　工お
よびＢａｍ　Ｈ工末端でリゾートし、ついでｘｘ２　に
挿入して発現させた（第６図、第５図）。

要約すると、インターフェロン遺伝子およびシラスミド
は、一部、以下の目標で設計した。

１）ヒトγ−インターフェロンのアミノ酸配列を与える
限り、ヌクレオチド配列は以下の至適化が可能なように
設計した。

ａ）操作が容易になるように多数の制限部位を設ける ｂ）合成遺伝子に規則的な間隔で重複した制限部位を導
入し、ハイブリッドインターフェロン遺伝子の形成を容
易にする ｃ）　Ｌｃｏｌｉでの発現を最大にするようにアミノ酸
コーンを選択する ｄ）好ましくないパリンドロームルニゾ形成がない ２）合成インターフェロンはインターフェロンタンパク
質の合成を至適化するため、シラスミドおよび調整ＤＮ
Ａと合した。

３）、シラスミドはγ−インターフェロン遺伝子用量が
増加するように高頻度コピー数が容易になるように構築
された。

４）　Ｌｙｓ工０、がＧ１ｎ工０、で置換された修飾ヒ
トγ−インターフェロンの発現をローｒした中間体遺伝
子を構築させた。

合成配列は、平均長１９ヌクレオチドをもっ４６のオリ
ゴヌクレオチげに分割した。すべてのＩＪ　ｒ−ジョン
点のいずれかの側に少なくとも６個の塩基の重複を設け
た。

例　１ インターフェロン遺伝子の化学合成 オリゴヌクレオチドは、ダイマーブロックを用い、ポリ
スチレン樹脂上リン酸トリエステル法によって合成した
（９）（Ｍ’１ｙｏｓｈｉら）。

このポリヌクレオチドの構築方法はよく知られている。

Ｍｉｙｏθｈ１らの方法を参照されたい。

ポリヌクレオチド生成物は固体として保存し、オリゴヌ
クレオチド合成への使用に際しその一部をとってピリジ
ンに溶解した。

ヌクレオチド樹脂（１００〜）は順次、（１１ジクロロ
メタン／ブタノール（７：５Ｖ／Ｖ）（５ｍｌ）中２％
ベンゼンスルホン酸、５分間、（２）ジクロロメタン／
ブタノール（７：３Ｖ／ｖ）５　Ｘ　５　＋Ｉ＋７！ （３）　無水ビリシン　５　Ｘ　５　ｒｎｌ（４）　ジ
ヌクレオチドｉＱＱ＋ｙとメシチレンスルホニルニトロ
トリアゾールを無水ビリシン（０，５ゴ）中で４５分 （５）無水ピリシン２×５ｍ１ （６）　ビリシン（５＃ｕ）中１０係無水酢酸で１０分
間 （７）　無水ビリシン２　Ｘ　５　ｎｔ（８）ジクロロ
メタン／ブタノール（７：　３　ｖ／ｖ）５×５ＩｒＬ
ｌ で処理した。

適当なジヌクレオチドを用い、オリゴヌクレオチドが完
成するまで、上記サイクルをくり返した。

各工程のカップリング効率は、遊離ジメトキシトリチル
アルコールの５０４　ｎｍにおける吸収により分光光度
法でモニターした。

合成完了後、オリゴヌクレオチドポリマーをポリマー支
持体から分離し、順次、ジオキサン／水（１：　Ｉ　Ｖ
／Ｖ　）中Ｑ、５ＭＮ１．　ＢＴｌ、　Ｎ２．　Ｎ２−
テトラメチルグアニジミラム４−ニトロベンズアルｒキ
シメートと室温で６０時間、（農アンモニア水により７
０℃で４時間、８０係酢酸により室温で６０分処理して
すべての保護基を除去した。保護基が除去されたオリゴ
ヌクレオチドをＰａｒｔｉｓｉ１１９ＳＡＸカラム上、
５０℃、ｐＨ４，９で、１Ｍ〜４Ｍ酢酸トリエチルアン
モニウム塩勾配を用いるＨＰＬＯで精製した。

オリゴヌクレオチにブロックのりｒ−ジョン（第１図） オリゴヌクレオチｒのサンプル（５ｏｏｐｍｏｌｅ）を
、２Ｑ　＃Ｍ　−スペルミジン、２　Ｑ　ｍＭ　−ＤＴ
Ｔ　。

１Ｑ　ｍＭ　−ＭｇＣ４２，５０ｍＭ　−Ｔｒｉｓ　−
Ｈｃｉ　（ｐＨ９，０）および０．１　ｍＭ　−１１＋
ＤＴＡ中、６７℃で６０分間、Ｔ４誘導ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（ＥＯ２，７，１，７８）６単位でホスホリ
ル化した。各オリゴヌクレオチＰをエタノールで沈殿さ
せ、変性１５％ポリアクリルアミドデル（ｐｉ（８，３
）上で解析した。

デルから溶出後、回収量なＯｅｒθｎｋＯＶカウンティ
ングによって測定した。第１図に示した完全遺伝子を形
成するために用いられた計４６のオリゴヌクレオチドが
存在した。

すｒ−ジョンの手順は、−木調ブロックを形成するオリ
ゴヌクレオチド群乞たがいにり’７”−）する。次忙こ
れらの一木調ブロックを４個の二重鎖ブロック、すなわ
ちそれぞれがγ−インターフェロン遺伝子の４分の１を
形成するように組立てる。

最後に二重鎖ブロックをリゾートして、完全遺伝子を形
成させるというものである。

４個の二重鎖ブロック（各［］、４　ｐｍｏｌｅ）を、
水５０μｍ中４５℃に５分間おき、ついで室温まで徐冷
するアニーリングによって、合成遺伝子を組立てた。混
合物を凍結乾燥し、Ｔ４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ（１０６
，５，１，１）５０単位を含有するりガーゼ混合物２０
μｍ中にとった。室温で１８時間反応させたのち、反応
を終結させ、生成物を５係天然ポリアクリルアミドｒル
上で精製した。生成物はφＸ１７４ＤＮＡのＨａθ■消
化で得られたサイズマーカーにより同定した。生成物を
Ｄ　Ｋ　８．ｌろ紙上電気溶出によって回収し、Ｔ４誘
導ポリヌクレオチドキナーゼでホスホリル化した。

例　２ シラスミドの構築（第２図） ング シラスミドｐＡＴ　１５６（ＢＲＬ　、Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ。

ＭＤ）をＨｌｎｄＩｌｌおよびｓａｌ　Ｉ　Ｌ　７ドヌ
クレアーゼで分解し、生成した３　０３６　ｂｐフラグ
メントをアがロースダル上電気泳動で単離した。合成工
ＦＮ−γ遺伝子（２０μｇ）およびベクターＤＮＡ（１
６００μｇ）をＤＫ８ｉディスク上にス？ットシ、つい
で１Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ、　１　ｍＭ　−Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７，５）中で洗浄した。次に、ろ液を１．
５Ｎ−ＮａＣ１，Ｉ　Ｑ　ｍＭ　−Ｔｒｉｓ　−Ｈ（Ｊ
、１　ｍＭ　−ＦｉＤＴＡｐ）（７，５（２００μｍ）
中、６７°Ｃでインキュベートした。ろ液を遠心分離に
よって除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿によって回収し
た。ＤＮＡ１７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥した
。すｒ−ジョン緩衝液（Ｉ　Ｑ　μｍ、６６　ｍＭ　Ｔ
ｒｉθ−Ｈ（Ｊ　ＰＩ−１７，５゜６．６ｍＭ　−Ｍｇ
（Ｊ２、Ｉ　ＱｍＭ　ＤＴＴ、　Ｑ、４ｍＭ　ＡＴＰ。

１ｍＭスペルミジン、Ｔ４りが−ゼ１単位）を加え、混
合物を１５°Ｃで１８時間インキュベートした。

標準形質転換案件を用いるコンビテン）　Ｋ、ｃｏ１ｉ
Ｋ１２株ＤＨ１の形質転換には、リゾ−ジョン混合物の
一部（２，５μｍ）を使用した。−夜、アンピシリン１
００μｇ／ｍｌ含有Ｌ−アが−ル平板上で培養したのち
、コロニーをアンピシリンおよびテトラサイクリン（２
０μｇ／ｍＪ）平板上に移した。１個のコロニーが、テ
トラサイクリン感受性、３２ｐ標識オリゴヌクレオチド
とのコロニーハイブリダイゼーション、および制限酵素
地図により、ｐＡ’ｒ　ｔ　５３のＨｊｎｄ［１および
Ｅｌａｌ　Ｉ部位に完全γ−インターフェロン配列の挿
入されていることを同定できた。この操作を第２図に要
約する。この方法でｐＸＹ　１が構築された。

ｐＸＹ　ｉ中の工ＦＮ−γ遺伝子は変換ヌクレオチド配
列（ＡＡＡ　４　ＣＡＡ　）を含み、これはＩ＋７１１
１１、（ＡＡＡ）に代わってＧ１ｎ１１１をもつγ−イ
ンターフェロンの合成をコードする。υＦ＋−ジョンに
制限酵素開裂後のりｒ−ジョンを用いた新しいヌクレオ
チ１配列の挿入により、ヌクレオチドトリデレットコｒ
ン（ＣＡＡ　）をＡＡＡに変化させた（第５図〜第１０
図参照）。

ｒ−インターフェロン（””ｚｚｚ　）　’ｌコードす
る遺伝子を用いて、工ＦＮ−γｍＲＮＡおよびタンパク
質を発現できる数種のシラスミドを作成した。

シラスミドｐＸＹ　１０３の構築 ＧＡＡ　（Ｇｌｎ　）のＡＡＡ　（Ｉ、ｙｓ　）　ヘの
矯正は、ｐＸＭ　１へのヌクレオチドの挿入によって行
われた（第６図）。

ｐＸＹ　Ｉ中の合成遺伝チェＦＮ７”　（Ｇ１ｎ１１１
）　ノ変換ニヨ’）　、工ＩＦＭ　−ｒ　（Ｌｙｓｌｌ
ｌ）　（ｙ）合成’？ココ−する合成遺伝子を含むシラ
スミｔ’ｐＸＹ１０５が生成した。

ａ）ベクターの調製 プラスミドｐｘｙ　Ｉ　ＤＭＡ　（５ｔｔｇ）を６ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬＰＨ７，５，６ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２．
６ｍＭ２−メルカゾトエタノールおよび１００μｇ、　
／ｍＡ！　ＢＳＡ含有稀衝１１００μｍ中、エンドヌク
レアーゼＳａｃ　Ｉ（４０単位）により、６７℃で２時
間分解した。

５　Ｍ　ＮａＣＬ（１／４１、最終Ｎａ　ＣＬ　ｒｉｊ
度ｔ５　Ｑ　ｍＭ　）を添加後、Ｆ！ａｔ　１８Ｎ　（
１３単位）を加え、混合物を３７℃で２時間さらにイン
キュベートシタ。５’ＯＯｆｆ１Ｍ−ＫＤＴＡ　６μｍ
を添加したのち、分解液をフェノール−クロロホルム（
１：１．１００μｍ）で１回、クロロホルム（１００μ
ｍ）で２回抽出し、ＮａＣＬ濃度を０．３　Ｍにしたの
ち２．５倍容量のエタノールで沈殿させた。ＤＮＡを遠
心分離して回収し、沈殿を８０％エタノール（０’０）
で２回洗浄し、真空中で乾燥させた。ｐＸＹ　１のＳａ
Ｃ，ｌおよびＢｓｔＥＪＩによる完全分解は）ｆ／Ｉ／
電気泳動（１チアガロース、ＴＢＩＣ緩衝液）によって
確認された。ＤＮＡ７．５．０μｍノ２　ＱｍＭＮａ（
Ｊ、Ｉ　ＱｍＭＴｒｉｓ　−Ｈ（Ｗ　ＰＨ８，０、Ｑ、
１　ｍＭ　ＥＤＴＡ中、６５℃において、細菌アルカリ
ホスファターゼ（７，５単位、２．５単位ずつ６回）に
より１時間分解した。酵素（２，５単位）は１０分、２
０分および６０分後に添加した。分解液をフェノール−
クロロホルム（１：１．５０μｍ）で２回、クロロホル
ム（５０μｍ）で２回抽出したのち、エタノールで沈殿
させた。−２０′Ｃに１８時間おいたのち、遠心分離に
よってＤＮＡ　ｒ１回収し、７０’ｌエタノールで２回
洗浄し、真空中で乾燥した。コノＤＮＡを１０　ｍＭＴ
ｒｌｅ　−Ｈ（Ｊ　Ｐ＋（７，５、Ｑｊ　ｍＭ　ＢＤＴ
Ａに０．５μｇ／μｍになるように溶解した。

オリゴマーγ３２−γ３７からなる二本鎖（第１図）（
１５０ｎｇ）を、緩ＫＭ液（前項におけると１司じ、１
５０μｍ）中、６７℃において、５ａｃＩ：　（８０単
位）で２時間分解した。Ｈａ（Ｊ　Ｙ　５０　ｍＭにな
るように加えたのち、Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ（８単位）を加
え、分解を６７′Ｇで２時間続けた。分解液をフェノー
ル−クロロホルム（１５０μｍ）、クロロホルム（１５
０μｍ）で２回抽出し、ＮａＣ１ｋ　Ｏ−３Ｍ　ｌｃな
るように、およびｔＲＮＡ　Ｙ加えたのち、エタノール
で沈殿させた。分解した二重鎖を遠心分離によって回収
し、７０％エタノールで２回洗浄し、真空中で乾燥した
。二重鎖を水１０μｍに溶解し、２μｍの５×負荷緩衝
液（５ＸＴＢＥ、２係Ｆｉｃｏｌ、ｏ、ｉ　幅ブロモフ
ェノールブルーおよび０．１％キシレンシアツール）を
加えたのち、６５℃に２分間加熱し、ＴＢＦ！緩衝液中
７．５チポリアクリルアミドデルに負荷した。電気泳動
後、ピルを−７０”Ｏで１８時間、あらかじめ感光させ
たＫＯｄａＸ　Ｘ線フィルムでオートラゾーオグラフを
行った。フラグメントは痕跡量の（３２ｐ　）ラベルを
含汀した。オートラジオグラフ上に可視化された主バン
ドｆ　ピルから切り出し、ＤＥ８’１ろ紙上で電気溶出
した。

ＤＥ８１ろ紙から回収し、エタノールで沈殿させたのち
、このフラグメントをＴＥ緩４’ｆｔ夜２５μｍに溶解
した。その一部（５μｍ）を等容の２×負荷緩衝液（９
０係ホルムアミド、２係ＦｉＣＯ１，０，１％ブロモフ
ェノールデル−１０，１４キシレンシアツール）に卯λ
、６０”０に２分間加熱し、ＴＢ丹、７Ｍ尿素中１５条
ポリアクリルアミドｒルに適用した。電気泳動後、ピル
のオートラジオグラフィーにより、分解二本鎖の各鎖が
期待の大きさく６０および４１ヌクレオチドの長さ）を
もつことが明らかにされた。

ｐＸＹ　１へのりｒ−ジョン（第６図）フラグメント（
１００ｎｇ）とベクター（１μｇ）を、６６ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ　−ＨＣＪ　ｐＨ７，５，６−６ｍＭ−ＭｇＣＬｚ
、Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＤＴＴ　、Ｑ、４　ｍＭ　ＡＴＰ、１
ｍＭ、ｃベルミソｙ含有緩ｉｏ、ｌ　Ｄ　ｔｎ　中、１
５　’ＯＫ　オイｉｃ、Ｔ４ＤＮＡりが−ゼ（ＮＥＮ　
）　１Ｑ単位と１８時間インキュベートシた。

リゾ−ジョン混合物の一部（５μｍ）を用い、標線形質
転換条件でのコンビテン）　Ｋ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株Ｈ
Ｂ１０１の形質転換を行った。１００μｇ／ゴアンビシ
リン含有Ｌ−アガール平板上で二夜培養したところ、４
，５００個のコロニーが得られ、その２００個をニトロ
セルロースろ斗上にとった。コロニーハイプリダイぜ−
ジョンにより、大多数のコローンがオリゴヌクレオチド
γ１１およびγ３５に強くハイブリダイズしていること
が示された（Ｂｓｔ　Ｆ；ＩＩ　−ＳａＣＩ　フラグメ
ント中に含有）。これらの組換え体、８個からのシラス
ミドＤＮＡは、理論的に合成１ＦＮ−γ遺伝子内に含ま
れるエンドヌクレアーゼ制限部位をぎ有した。ｆラスミ
ＦｐＸＹ１［１５中の矯正遺伝子の底鎖の配列をＭａｘ
ａｍとＧｉ’１ｂｅｒｔの方法に従って決定した。これ
によれば、コドン１１１　はＡＡＡであった。遺伝子の
５′末端における保存的変化はまだｐＸＹ１０３中に存
在した。

会ＪＪＸ、ＩＦＮ　−１遺伝子（Ｇｌｚ１４１１　）の
ｐＷＴ　２６１１ＦＮ　−遺伝子含有Ｈｉｎｄ　ＩＩ　
−Ｓａｄ　ｌフラグメントのｐｗ’ｒ　２５１ベクター
への挿入により、ＴｒｐＥ−融合ＩＦＮ−γタンパク＊
：　Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、−Ｇ４ｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ａｌａ−成熟ＩＦＮ−γの表現を生じる。

ｐＷＴ　２６１からのプラスミドＤＮＡを、制限エンド
ヌクレアーゼ緩衝液２５０μｍ中、６７°Ｃにおいて、
Ｓａｌ工（４単位）およびＨｉｎｄｉ　（１０単位）に
よって１６時間分解した。フェノールで抽出し、エタノ
ール沈殿で回収したのち、ベクターを前述のように細１
アルカリホスファターゼで処理しち合成ＩＦＮ−γ遺伝
子（”ｎ１１１）を含有するｐＸＹ　１のＨｉｎｄ　ｌ
−Ｓａｌ　ｌフラグメントは前述のように、デル電気体
動で率離し、ＤＥ８１ろ舐上低気溶出した。ベクター（
４μｇ１１）ＷＴ　２６１Ｓａｌ　Ｉ　−Ｈｉｎｄｌｌ
）およびＩＦＮ−γ遺伝子（４０ｎｇ　）をリゾージョ
ン緩−敢（２０μｍ）に浴解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
５１＃位）を加えたのち、１５℃で１８時間インキュベ
ートした。リテージョン混合物の半分（１０，５μｍ）
をコンピテントＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株ＨＢ１０１
の形負転侠に用いた。１００！！／−のアンピシリンを
含ＭするＬ−アガール平板上で一佼培誉して得Ｉ−）れ
た２２個のコロニーをアンピシリン富有平板上に取った
。コロニーノ・イブリダイゼージョンにより、これらの
２０個のコロニーはオリゴヌクレオチドγ１１およびγ
４６の両者にハイブリダイズしていることが示された。

これらのコロニーの制限分解かり、これらがＴｒｐＥ遺
伝子の５′末端に融合したヒ）　工ＦＮ−γ遺伝子を含
むことが明らかにされた。

遺伝予検作法の詳細な例示として、以下にｐＷＴ　１１
１　ｃｏｐおよびｐＪＢｉからのシラスミドｐＪＢ　２
（第４図）の形成を示す。

ｐＷＴ　１１１　ｃｏｐＤＮＡ　（１０，４／ｊｇ　）
を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＪ　ＰＩ１７．５．１０　
ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２．５　Ｑｕ＋Ｍ（ＮＨ４）２３０４　
＋　１　００μｇ／−ＢＳＡ　（２５０μｍ　）中、６
７℃において、エンドヌクレアーゼＰｓｔ工（１１−２
羊位）により１０時間分解した。分Ｉｓ仮、５００［Ｉ
Ｍ　ＥＤＴＡ　７．５　μｌおよび５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ　
Ｑ　５μｍを加え、反応液ナフェノールークロロホルム
で抽出した。

ＤＮＡ　ｙｇエタノール沈殿で回収した。この反応の生
〕ａｍ　を、１　５　０　ｍＭ　Ｎａ（Ｊ　、６　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪｐ）（７，５，６ｍＭ　ＭｇＣ１，
２，６ｍＭ　２−メルカゾトエタノール、１００μｇ／
ｍＢｓＡ　（２５０μｍ）中、６７℃において、さらに
エンドヌクレアーゼ５ａｌＩ（１０単位）によって１６
時間分解した。５　ｘ　ＴＢＥ負荷緩倫液５０μｍを添
加したのち、サンプルを６５℃に２分間加熱し、ＴＢＥ
緩衝液中０．８　％アガロースデル上電気体励に１すし
た。Ｓａｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ　ｌフラグメント（２２２７
ｂｐ　）をＤＥＣＩろ紙上−気溶出によって回収し、エ
タノールで沈殿させた。

ｐＪＢ　Ｉ　ＤＮＡ　（１０μｇ）を軌）と同様にして
、エンドヌクレアーゼＰｓｔ　Ｉ　（１１，２単位）お
よびＳａｌ　［（１（１位）で分１１６　した。Ｐｓｔ
　Ｉ　−Ｓａｌ　ｌフラグメント（１６４９ｂｐ　）は
ＤＥ８１上酸気溶出およびエタノール沈殿によって回収
した。

ｐＷＴｌｌｉｃｏｐ、５ａｌＩ−ＰｓｔＩフラグメント
（６μｇ　）およびｐＪＢ　ｉ　、　Ｐｓｔ　−Ｓａｌ
　ｌフラグメント（２μｇ）をリガーゼ緩衝液（２０μ
ｍ）中１５°Ｃにおいて、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（１
０単位、ＮＥＷ　）を用い、１８時間たがいにリゾート
させた。この混合物の一部（５μｍ）をコンピテントＥ
、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２株ａＢ１０１の形質転侯に用い
た。アンピシリン１００μｇ／−含有Ｌ−アガール平板
上−夜培誉したところ、２１９個のコロニーが得られた
。コロニーハイブリダイゼーションにより、大多数がオ
リゴマーγ１１およびγ４６に強くハイブリダイズして
いることが明らかにされた。１個のコロニー１）ＪＢ２
を表現の研死に選択した。ｐＪＨＢ　２の制限酵素地図
は期待と一致した。

この操作は第７図にまとめる。

戟）ベクターの調製 １）ＪＢ　２　ＤＮＡ　（１０μｇ）を１００　ｍＭ　
ＮａＣＪ、、　５　［］ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｇ−ＨＣＪ、
　ＰＨ７−５、１０ｍＭ　Ｍｇ　（Ｊ２、　ｉｍＭＤＴ
Ｔ。

１００μｇ／−ＢｓＡ（５００μｌ）中、６７℃におい
てエンドヌクレアーゼＢａｕ＋ＨＩ（２０単位）により
１６時間分解した。等容の５　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣＬ、　
１　Ｃ１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ＪｐＨ７，５，１Ｑ’　
ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２、ｌ　ｍＭ　ＤＴＴを砒加したのち、
ＤＮＡをろ７°℃において、エンドヌクレアーゼＳａｌ
　Ｉ　（２０単位）によりさらに５時間分解した。ベク
ターフラグメント（６４７４ｂｐ）ヲＴＢＥ緩衝液中０
．８％アガｐ−スピル上゛畦気泳動によって分離し、Ｄ
８１ろ紙上で′心気溶出し、エタノール沈殿で回収した
。このＤＮＡフラグメントをウシ小ｊ助ホスファｌ−ゼ
（１０４位×２、ＮＥＮ　）により、５　Ｑ　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（Ｊｐｌ（９，０、ｉ　ｍＭ　ＭｇＣｊ２、
Ｑ、１ｍＭ　ＺｎＳＯ４、ｉ　ｍＭスペルミジン（５０
μｌ）中、６７℃において１５分間処理した。酵素の２
回目（１０単位）を添加したのち、反応をさらに１５分
間耽けた。酵素を７０℃に１０分間加熱して失活すせ、
ＤＮＡフラグメントをフェノール−クロロホルムで数回
抽出し、工ｌノール沈殿で回収した。

（ｂＬｒＦＮ−γ遺伝子含有フラグメント１３ａｍ　Ｈ
Ｉ−８ａｌ　Ｉの調製 ｐＣＣ１０６ＤＮＡ　（２０ｐｇ）を（ａ）の場合と同
様にしてエンドヌクレアーゼＢａｎｎ　ＩＩ　（４０単
位）および５ａｌＩ（２０単位）で分解し、回収した。

ＢａｍＨＩ−８ａｌ　Ｉフラグメント（４６０ｂｐ　）
をデル眠気泳動によって分離し、ＤＢＳ’ｌろ紙上で電
気浴出し、エタノールで沈殿させた。以上、（ハ））の
場合と同僚に処理した。このフラグメントはウシ小１助
ホスファターゼで処理しなかった。

（Ｃ）　’）デージョンおよび形質転換Ｂａｎ　ｌ（Ｉ
　−Ｓａｌ　Ｉ矯正遺伝子フラグメント（６μｇ）およ
びＳａｌ　Ｉ　−Ｂａｍ、Ｈ工ｐＪＢ　２ベクターＤＮ
Ａ　（７μｇ）をサケ９−シフン緩価液中、１５°Ｃに
おいて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１０年位、ＮＥＮ　）に
より１８時間分解した。す）１％−ジョン混付物の一部
（１０μｌ）をコンピテントＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２
株ＨＢ１０１の形質転換に用いた。−夜培誉したところ
、約６００個のコロニーがアンビシリｙ１００μｇ／−
含有り一アガール平板上に得られた。以後の表現実験に
は１個のコロニーｐＪＢ　２　Ｄ　５な用いた。

プラスミドＩ）ｌ　２４　ＣＤＮＡを、１Ｑ　Ｑ　ｍＭ
Ｎａ（Ｊ。

６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｐＥ（８，６ｍＭ　ＭｇＣ
Ｌ、、、ＢＳＡ　ｉ　Ｑ　［１μｇ／−含有緩１１ｉｌ
Ｊ液１００μｌ中、６７℃において、エンドヌクレアー
ゼＣ１ａ工（２５単位）およびＳａｌ　工（２５単位）
により、４時間分解し１こ。

５　ｘ　ＴＢＥ負荷緩衝液（前述と同じ）２０μｍを加
え、６０′Ｃに５分間加熱し、２５°ＯＫ　Ｎ却したの
ち、分屏欧を直接１％アガロースデルに通用した。゛電
気泳動で分離したのち、ゲルを０．５μｇ／ｌｄエチジ
ウムブロマイドで染色して長波長Ｕ■照射でバンドを可
視化した。ベタ。ターＤＮＡ　（５１１４ｂｐ　）をデ
ルからＤＥ８１ろ紙上に電気ｍ出した。

ろ紙を１．５Ｍ　ＮａＣＪ　、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
Ｈ（ＪｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ　（２００ｐｌ）中
、６７℃において１２時間インキュベートしてＤＮＡを
回収し、遠心分離してろ紙を除き、エタノール沈殿させ
た。沈殿を運心分融によって呆め、７０％エタノールで
２回洗抄し、真空中でＩｌｉ、燥した。ベクターＤＮＡ
　（６，７μｇ）を１０μｍの水に一部した。

（ｂ）　ｐＸＹ　１のＢｈｍ　ＨＩ−８ａｌ　Ｉフラグ
メントのｗｓｍプラスミドｐＸＹ、、、Ｉ　ＤＮＡ　（
４０μｇ　）を、１５０　ｍＭＮａＣｊ！、、　６　ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＪｐＨ８、ｔ５　ｍＭ　２−メルカプ
トエタノール、６　ｍＭ　ＭｇＣｊ、２および１００　
ｆｉｇ、／ｍｌ　ＢＳＡ含鳴綾衝液（５００μｌ）中、
６７℃において、エンドヌクレアーゼＢａｍ１ＨＩ　（
５０単位）および５ａｌＩ（２５単位）により１６時間
分解したｃＢａｒｎ　ＨＩ−８ａｌ　Ｉ　ＩＦＮ−γ遺
伝子フラグメント（４２，５ｂｐ）はＴＢＥ緩偵ｊ液中
１％アガロースデル上電気体動によって分離し、ＤＥ８
１ろ紙上への蹴込溶出Ｚよびエタノール沈殿によって回
収した。ついでフラグメント（４μｇ）を水５０μｍに
溶解した。

（Ｃ）　オリゴヌクレオチドリンカー（第５図下部）前
述の方法により、２個のオリゴヌクレオチドを化学的に
合成した。

Ｉ　Ａ　ＣＧＡＴＣＧＡＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴＧＴＣＡ
Ｇ　２２塩基１Ｂ　ＴＡＧＣＴＴＡＣＡＣ：ＡＡＴＡＡ
ＣＡＧＴＣＣＴＡＧ　２４塩基オリゴマｒｌＡ（４，２
５μｌ、６６　ｎｇ　）およびｒＩＢ（２，５μｍ、６
６　ｎｇ　）を６６１１１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｐ）１
７．５．１Ｑ　ＩｎＭＭｇＣｆ２．１０　ｍＭ　２−メ
ルカプトエ：ｆＪ−ｈ中、２０　ｐ　Ｃｉ　（ｒ−３″
ｐ　）　ＡＴＰ　（５，０００Ｃｉ／＋ｎ　ｎ＋０１＋
　１０　ｍＣｉ／鴫Ａｍｅｒｓｈａｍ　）を加えて、６
７℃において、ポリヌクレオチドキナーゼ（ｏ、８単位
、ＮＥＷ）により１０分間処理した。反応混合物に１０
　ｍＭ　ＡＴＰ　（５μｍ）、１０Ｘ緩衝液（１μｍ）
、水（６μｍ）およびポリヌクレオチドキナーゼ（１μ
ｍ、８単位）を加えて、６７℃でさらに６０分間インキ
ュベートした。反応終了後、混合物を７０°Ｃに５分間
加熱して酵素を不活化し、２５℃に冷却した。

この反応は第５図の左上部に例示されている。

キナーゼ反応混合物（２５μｌ）を、Ｂａｎ　ＨＩ−’
５ａｌＩ　ＤＮＡ　７ラグメント（１μｍ、５．０ｍｇ
）と０°Ｃで屁曾した。Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（１μ
ｍ、１０単位、ＮＥＮ）の添加後、反応液を１５℃で１
６時間インキュベートした。この混合物を７０°０に２
分間加熱して、ＤＮＡリガーゼを変性させた。Ｎａ　Ｃ
ｊ、を１５０鮨になるように〃口え、エンドヌクレアー
ゼＣ１ａＩ（１０単位）およびＳａｌ　Ｉ　（１０単位
）を加えたのち、反応混合物をさらに６７°Ｃで９０分
間インキュベートした。５　ｘ　ＴＢｌｉｉ貝荷緩爾欧
１０μｍを加えたのち、反応液を７０℃に２分間加熱し
、２５℃に冷却し、直接、ＴＢＥ緩＃欲中７．５％ポリ
アクリルアミドケゞルに適用した。′電気泳動後、ゲル
を、あらかじめ感光させたＫｏｄａｋ　Ｘ線フィルムを
用いて、１８時間オートラジオグラフに付した。

Ｃ１ａ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉフラグメント（４４６ｂｐｓ
　）を含むバンドなデルから取り、ＤＮＡはＤＥ８１ろ
紙上への電気溶出によって回収した。抽出、エタノール
沈殿、遠心分離による回収、７０％エタノールによる抗
伊後、ＤＮＡペレットを真壁中で乾燥した。

Ｃ１ａ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉフラグメント（５０μｇｚ回
収率は６０％と推定された）を水１２μｍに俗解した。

この反応は第５図の中央部に例示する。Ｃ１ａ’、１−
　Ｓａｌ　Ｉｆフラグメント（５０μｇ、１２μｍ）お
よびベクターＤＮＡ　（２ａｇｚ　５μｍ）をリゾージ
ョン緩＃液（２０μｍ）中１５′Ｃにおいて、Ｔ　４　
ＤＮＡリガーゼ（１０単位、ＮＢＮ　）と１８時間リグ
ートした。このリゾ−ジョン混合物の一部（１０μｍ）
を用いて、コンピテントＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２株Ｈ
Ｂ１０１の形質転挾を行った。アンぎシ゛す７１００ａ
ｇ／−含有Ｌ−アガール平板上で一伎培嘗したところ、
２５０個のコロニーが得られた。コロニー・・イブリダ
イゼージョンにより、１個のコロニー′ＩＪ）オリゴマ
ーγ１１およびγ４６に強くノ１イプリダイズしている
ことが示された。このコロニー、ｐｘｙ２は制限酵素地
図により、所望の４成を示した。これはＩＦＮ　−ｒ　
（Ｇ１ｎ４コｌ）　Ｍ伝子を含有し、ｐｘｙ２と命名す
る。

ｐｅａｌ　（Ｇｌｎ］１ｘ）の構築 シラスミドｐＣＣｉの構築には第８図に例示し、以下に
呼込するように、シラスミドｐＸＹ　２およびｐＷＴ　
１１１　ｃｏｐを用いた。

Ｌａ）　ベクターおよび遺伝子フラグメントの調装ｐＷ
Ｔｉ　ｉ　Ｉｃｏｐ　ＤＮＡ　（１０ａｇ）およびｐｘ
ｙ　２　ＤＮＡ（１０μｇ　）を２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＪｐＨ７，５、ｉＱｍＭＭｇＣＪ−ｚ　、５０　
ｍＭ　（ＮＨ４）、ＳＯ２，１００ｐｇ／ｍｌ　ＢＳＡ
（１００μｌ）中５７℃において、エンドヌクレアーゼ
Ｐｓｔ　ｒ　（’ｉ　Ｑ単位）により４時間分解した。

ｉ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ｌＪｐＨ７，５，１０ｍ
ｙ　ＫＤＴＡ　（２００μｍ）を醗加したのち、分解Ｄ
ＮＡヲ、フェノール−クロロホルムで１回、クロロホル
ムで２回抽出した。エタノール沈殿で回収したのち、Ｄ
ＮＡ分解物を水５０μｌに再懸濁し、緩衝液（１００μ
１１前述に同じ）中６７℃において、エンドヌクレアー
ゼＳａｌ　ｒ　（２０単位）によりさらに４時間分解し
た。ＤＮＡフラグメントをフェノール−クロロホルム抽
出し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡフラグメントな
水４０μｍに再懸濁し、５ＸＴＢＥ負荷緩衝ｇ、１０μ
ｍを加えたのち、６５’０に２分間加熱し、ＴＢＥ′緩
慟敢中１チアガロ−スゲルー気泳動によって分離した。

フラグメントＰｓｔ　Ｉ　−Ｓａｌ　ＩＩＦＮ　７．　
ｇ遺伝子（１６１４ｂｐ　）およびＳａｌ　Ｉ　、−Ｐ
ｓｔＩベクター（２９６２ｂｐ　）をＤＥ８１ろ紙上に
電気溶出し、抽出し、エタノール沈殿によって回収した
。

Ｐｓｔ　ｌ−８ａｌＩ　ＩＦＮ　−ｇ遺伝子フラグメン
ト（１μｇ）とＳａｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ　ｐＷＴ　１
１ｃｏｐフラグメント（１μｇ）をリゾージョン緩備液
２５μｍに再懸濁した。Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（２０
年位、ＮＥＷ、）添加後、反応液を１５”Ｃ！で１８時
間インキュベートした。リダージョン混付物５μｌをコ
ンピテントＥ。

ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株ＨＢ１０１の形寅転侠に用いた。

１００μｇ／−のアンピシリンを含むＬ−アガール上で
一夜培養したところ１．４６（Ｎｍｌのコロニーが得ら
れた。制限酵素地図およびコロニーハイブリダイゼーシ
ョンにより、１個のコロニーを以後の表現実験に用いた
。

第２図に例示し、以下に詳述するように、プラスミドｐ
ｅａ　１およびｐＸＹ　ｉ　０６をプラスミドｐｃ１０
５の４条に用いた。

ｐＣＣＩ　ＤＮＡ　（５μｇ　）を１５０　ｍＭＮａ（
Ｊ、　１０　ｍ１ｖｉＴｒｉｓ−ＨＣｆｐＨａ、ｏ、ｉ
　Ｑ　ｕｘＭ　Ｍｇ（４２，１Ｑ　ｍＭ　ＤＴＴ　。

１００μｇ／ｍＢｓＡ　（１００μｍ）中、６７℃にお
いて、エンドヌクレアーゼＢａｍ　ＨＩ　（２５単位）
およびＳａｌ　Ｉ　（７，５’Ｉ’位）により２時間分
解した。

５μｌの５００　ｍＭ　ＥＤＴＡ添加後、分解液をフェ
ノール−クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、エ
タ／　−ｋ　沈殿で回収した。ウシ小）揚ホスファター
ゼで処理後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノー
ル沈殿を行い、回収されたＤＮＡフラグメントをＴＢＥ
　威衝液中１％アガロースデル上電気泳動で分離した。

ｐｅａ　ｉのＳａｌ　■−Ｂａｍ　ＨＩフラグメント（
６５４４ｂｐ　）をＤＥ８１ろ紙上に電気溶出し、ろ紙
から抽出し、エタノールで沈殿すせて回収した。

（ｂ）　Ｍ正遺伝子ＢａｍＨＩ　−８ａｌエフラグメン
トの１ＡＩ−Ａ ｐＸＹ１０５　ＤＮＡ　（１０μｇ　）を（ａ）と同様
にしてエンドヌクレアーぜＢａｍ　Ｅ、Ｉ　（５０単位
）および５ａｌＩ（２ｔＪｊ＝ｔ１位）で分解した。こ
のＢａａ＋　ｊｉＩ−８ａｌ＋Ｉ遺伝子フラグメント（
ａ　５０　ｂｐ　）をホスファターゼ処理をし７エいは
かは上述したと同様にして早離した。

（Ｃ）リゲーショ／および形質私侠 ｐＣＣ１かりのＳａｌ　Ｉ　−Ｂａｍ　ＨＩフラグメン
ト（０，４μｇ）およびＩ）ＸＹ　１０５からのＰ、ａ
ｍＩ（Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉフラグメントを２０μｌのリゾ
−ジョンｙ＊＆に＋１）＝濁した。Ｔ　４　ＤＮＡリガ
ーゼ（９０単位、ＮＥＷ　）を加えたのち、屁台物を１
５℃で１８時間インキユベートシた。このりヶゞ−ジョ
ンン昆合物１ｏμｌを用いて、コンピテントＥ、’ｃｏ
ｌｉ　Ｋ　１．２株ＨＢ１０１を形寅私換した。アンピ
シリン１００１　／ｍｌ含有Ｌ−アガール上で一夜培養
したところ、約２−Ｄ。

個のコロニーρ・観＠された。制限酵素地図を作成した
とこつ、１個のコロニー、ｐｃｃ１ｏ６か正しい４４坑
を・ばし、この組侠え体な表現に用いた。

１）ＣＣ２およυ：ｐＣＣ２０６の栴柴ゾフスミドｐＣ
Ｃ１０５（ｐＣＣ１から誘４）およびｐＷＴ　１１１を
、第１０図に例示し、以下に詳述するように、プラスミ
ドｐＣＣ２、ｐＣＣ２０６の偵乗に用いた。

ｐＷＴｉｌｌｃｏｐＤＮＡ（２５μｇ　）を１００　ｍ
Ｍ　ＮａＣｊ。

５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊｐ）１７．５、　ｉ　
Ｑ　ｍＭＭｇ（Ｊ２　（２００μｍ）中、６７℃におい
て、エンドヌクレアーゼＢａｍ　ＨＩ　（２５単位）に
より６時間分解した。

ＤＮＡフラグメントはフェノール抽出およびエタノール
沈殿により回収した。

（ｂ）　フラグメントの調製 ｐｅａ　ｉ　ＤＮＡ　（２０μｇ）を上記ｔｉ倶工液（
２００μｍ）中、６７℃において、エンドヌクレアーゼ
５ａｌＩ（４０単位）により４時間分解した。ＤＮＡフ
ラグメントはフェノール抽出およびエタノール沈殿によ
り回収した。ｐＣＣ１０５ＤＮＡ　（２９μｇ）も同僚
の反応で処理した。

（ｃ）　Ｔ　４　ＤＮＡポリメラーゼによる反応ｐＷＴ
　１１１　Ｃ０１）　ＤＮＡのＢａｍ　ＨＩ　ｌｌｒ片
（２５μｇ）を６６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ＪｐＨ７，
９，６６ｍＡ　ＫＯＡＣ、１［］　ｒｎＭＭｇ０ＡＣ，
０，５ｍＭ　ＤＴＴ、１００　、ｌ＋ｇ／−ＢＳＡ、ｏ
、ｉｔｕＭｔｉＡＴＰ、０．１　ｍＭｔ、１ｃＴＰ、０
．１　ｍＭｔｉＧＴＰ、０．１　ｍＭｄＴＴＰ（２００
μｍ）甲、６７℃においてＴ４ＤＮＡポリ／９−−１！
′ｃ４０単位、ＥＲＬ　）と１時間反応させた。又応混
台物をフェノールで抽出し、ＤＮ、ＡはエタノールＩｆ
ｈＮで回収した。Ｓａｌ　Ｉによるｐｅａ　ｉ−「片（
２０ｐｇ）とＳａｌ　Ｉによるｐｃｃ　１０５　ｍ「片
（２０μｇ）も同様に処理した。

（ψ　Ｐｓｔ工分解 Ｂａｍ　ＨＩで切シ「ｌ、　Ｔ　４　ＤＮＡポリメラー
ゼで充填したｐＷＴＩ　１１　ｃａｐ　ＤＮＡ　（２５
μｇ　）　’ｉ板ｍ１（２００μｍ、前述に同じ）中、
６７℃において、エンドヌクレアーゼＰｓｔｌｌ（４０
率位）により４時間分解した。フェノール抽出俊、ＤＮ
Ａフラグメントをエタノール沈殿で回収した。Ｓａｌ　
Ｉ切困「、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ光ＪＪ４ｐＣＣ１お
よびｐＣＣｉ　０５　（，１８μｇ）を同様に処理した
。ｐｗ’［’　１１１　ｃｏｐ　Ｂａｍ　Ｈｌ−Ｐｓｔ
ＨＩ−Ｐｓｔ工（５２６７ｂｐ　）ならびにｐ’ｃｃ１
およびｐＣＣ１０６Ｐｓｔニー　Ｓａｌ工（１６１４ｂ
ｐ　）フラグメントをＴＢＥ　緩割敵中１％アガロース
ゲル上′喝気ｖＫ動によって単離した。ＤＮＡをＤＲ８
１６戯土に電気浴出し、ろ４氏かり抽出し、エタノール
で沈殿させて回収した。

ｐＷＴ　１１１．ｃ、ｏｐ　、　Ｂａｍ　ＨＩ−Ｐｓｔ
　Ｉフラグメント（１，６μｇ）をｐＣＣｌもしくはｐ
ｅａ　１０３のＰｓｔニーＳａｌ　Ｉフラグメントのい
ずれかと、リゾージョン級ｉａ液（２５μｍ）中、１５
°Ｃにおいて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２０羊位、ＮＥＷ
　）を用いて１８時間リグートさせた。

その一部（５μ、１）をコンピテントＥ、　ｃｏｌｉ　
Ｋ１２株ＨＢ１０１の形質転挨に用いた。１００μｇ／
ｍ！アンピシリン宮有Ｌ−アガール上で一夜培誉したと
ころ、４００個（ｐＣＣ２）および２０００個（ｐｃｃ
２０５　）のコロニーが得られた。制限酵素地図によっ
て特性づけられた谷組侠え体１個ずつを以下の次男実験
に用いた。

プラスミド−寛表に掲げた出発シラスミドは、第１１図
に′例示したような匍」限ｍ系地図をＭしている。シラ
スミＰｐＣＣ２およびｐｅａ　２０５はそれぞれ、ＡＴ
ＣＣＡ　およびＡＴＣＣＡ　として寄託されて（・る。

例　６ インターフェロン遺伝子の表現と生物学的活性プラスミ
ドの一夜培養液を、トリシト７アン（４０μｇ／ｍＡ’
）を補給し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｊりを含有
するＭ９メジウム中で生育させた。接種（０，５ｍ１）
はＭ９メジウム（２５１１Ａ’、アンピシリン１００μ
ｇ／ｍｌりに行った。生育は６７０　ｎｍにおける光学
密度が０．４に達するまで続げた。この時点で培養液の
β−インドールアクリ”　酸（１０ｍ？　／　ｍＡ！　
ｘタノール中）は２０　μｇ／＋＋＋Ｊとなった。激し
く攪拌しながら６７℃での生育を続け、定量および電気
泳動分析用のサンプルは１時間間隔で採取した。

サンプルのインターフェロン活性の定量方法Ａ、：６７
０ｎｍの光学密度１．５〜２．０の培養液（１０〜２０
ＴＬｌ）（対数期の中期〜後期）を取シ、遠心分離して
細胞を回収した。０℃で５０ｍＴｒｉｓ−１１０１ｐＨ
７，５、ろＱ　ｍＭ　Ｎａ０Ａｌ　（１ｍｌ　）に懸濁
したのち、リゾチーム（５７Ｗ／ｄ）を最終濃度が５０
　ｎｇ／ｍＡ！になるように加え、この懸濁液を０００
で１時間インキュベートした。ＲＰＭ工１６４０メジウ
ム（ＩＩＡ’）、１０％ウシ胎仔血清を加えたのち、懸
濁液を２４秒間超音波処理した。細胞層を−遠心分離で
除去し、上清を定量した。

方法Ｂ：この方法は、細胞を遠心分離で回収し、直ちに
０．１５　Ｍ　Ｎａ０Ｊ、１％　Ｆｅ２．１Ｑ　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−Ｈｅａ　ｐＨ８，０（１ｍｌ　）に再懸濁し
、３Ｘ２０秒間超音波処理するほかは方法Ａと同じであ
る。上溝は同様にして回収した。

６７０　ｎｍにおいて０．５元学密度単位に相当する容
量の細胞を培養液から取シ、細胞を遠心分離によって回
収した。細胞を直ちに、６　ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ　−Ｈｃ
ｚｐＨ６，８，０，０５チプロモフエノールデルー、５
チグリセロール、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．５
チ２−メルカプトエタノールに再懸濁し、６分間１００
℃に加熱して、急速にドライアイス上で凍結させた。こ
の煮沸−凍結サイクルを２〜３回くり返してサンプルの
粘度を低下させたのち、最後に５分間煮沸し、Ｌａｅｍ
ｍｌｉの方法で調製した１５チポリアクリルアミドデル
上に５μｍ負荷した。タンパク質の評価は、これらのゲ
ル上の工ＦＮ−γのバンドの大きさを総タンパク質と比
較して行った。

定量 細胞抽出液について、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏのミクロプレー
ト定量システムでのＥＭＯ（転心筋炎）ウィルス感染の
細胞変性効果に対する保護作用を、’ＶｅｎＯ（アフリ
カミドリザ／Ｉ／）細・胞でモニターして、抗ウィルス
活性を定量した。

結果 第１表および第２表に、合成工ＦＮ−γ遺伝子を含む発
現シラスミドを用いた場合の発現結果をまとめる。工Ｆ
Ｈの国際単位は、使用したＩＦｌｉ−β標準を２．６２
単位／ｄとしてめた。培養はすべて２５ゴ振盪フラスコ
で行い、その１０〜２０ゴを定量の目的に使用した。第
１表および第２表の抗ウィルス活性は、細菌培養液１１
あたシの細胞の６７０　ｎｍにおける光学密度１につい
てのＩＦＮウィルス活性を国際単位で示したものである
。

合成１ＦＮ−γ遺伝子の性質を比較する対照としては、
天然の工ＦＮ−γ遺伝子をｐＥｏ　２５２中で用いた。

υ　水　寧 υ　ロ　水　０　０ 寸　セ　の　ｖ−（’％１ 冨１１ＩＩ へＬＯ寸℃０ 医薬組成物 なわち、本発明のヒト免疫インターフェロン生成物を医
薬的に許容される担体ビークルと混合する。

適当なビークルおよびその処方についてはＲｅｍｉｎｇ
ｔＯｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃ
ｅｓ　（Ｌ　Ｗ。

Ｍａｒｔｉｎ著）に記載されている。この組成物は、本
発明のインターフェロンタンパク質の有効量を適当量の
ビークルと合し、宿主への効果的な投与に適した医薬用
組成物としたものである。

非経口投与 本発明のヒト免疫インターフェロンは、抗腫瘍または抗
ウイルス処置を必要とする対象、および免疫抑制状態に
ある対象に非経口投与することができる。投与量および
投与回数は現在、他のヒトインターフェロンの臨床試験
に用いられたものと同じである。たとえば、１日に約（
１〜１０）×１０６単位、純度が１チ以上の場合には５
０Ｘ１０単位／日が投与される。

ト、米局）に溶解する。この溶液を細菌フィルターに通
し、ろ液を無菌的に１００個のバイアルに分包すれば、
非経口投与に適したインターフェロンを１バイアル中に
＜５Ｘ１０’単位含有する製剤が得られる。このバイア
ルは使用時まで、冷所（−２０℃）に保存することが好
ましい。

文献 １）スチュワード（Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｗ、Ｌ　）　（
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ｒｔｏｎ、　Ｅ、、　Ｎａｊａｒｉａｎ。

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ｏｕｔｒｅ、　Ｈ，。

Ｔａｙａ、Ｙ、、Ｄｅｇｒａｖｅ、Ｗ、、Ｖａｎ　Ｈｅ
ｕｖｅｒｓｗｙｎ、Ｈ，＆Ｆｉｅｒｓ、　Ｗ、（１９８
２）　：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

８：２４８７−２５０１゜ ８）グランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ、　Ｒ，）＋　Ｇａ
ｕｔｉｅｒ−、ｃ。

＆　Ｇｕｏｙ、Ｎ、　（１９８Ｑ　）　：　１Ｊｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　。

８　：　１　８９３−１　９１　２゜ ９）ミヨシ（Ｎ１ｙｏｓｈｉ、　Ｋ、）、　Ａｒｅｎｔ
ｚｅｎ、　Ｒ，。

Ｈｕａｒｌｇ、Ｔ、　＆　工ｔａｋｕｒａ、に、（１９
８Ｑ　）：　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾　′ａｓ　Ｒｅｓ、、８
：　５５０７　５５　１　７゜１０）エツジ（ＫＪｇｅ
、　Ｎ、Ｄ、）＋　Ｇｒｅｅｎｅ、　Ａ、Ｒ，。

Ｈｅａｔｈｃｌｉｆｆｅ、Ｇ、Ｒ，、Ｍｅａｃｏｃｋ、
Ｐ、Ａ、、５ｃｈｕｃｈ。

Ｗ、、５ｃａｎｌｏｎ、Ｄ、Ｂ、、Ａｔｋｉｎｓｏｎ、
Ｔ、Ｏ，、Ｎｅｗｔｏｎ。

０、Ｒ，＆　Ｍａｒｋｈａｍ、Ａ、Ｆ、（１９８１）　
：　Ｎａｔｕｒｅ　。

２９２ニア”５６−７６２゜ １１）ミツチェｌ　（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、　Ａ、Ｒ，）
、　５ｔｅｐｈｅｎ。

Ｂ、Ｈ，、Ｅｒ１ｃｋｅｏｎ、Ｂ、Ｗ、＆　Ｍｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄ、Ｂ、Ｂ。

（１９７６）　：　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ
、　、３７９５−３７９８゜ １２）　リース（Ｒｅｅｓｅ、　ｃ、Ｂ、）、′Ｔｉｔ
ｍａＳ、　Ｒ，Ｏ，＆Ｙａｕ、Ｌ、（１９７８）：　Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、。

２７２７−２７３０゜ １３）タナ力（Ｔａｎａｋａ、　Ｓ、）他：　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｄ、、１　１　（１９８３）：
６゜ヌクレオチド配列と制限部位を示す。遺伝子の上お
よび下に示した１〜４６の数字は、合成され、最後に完
全遺伝子の組立てに用いたオリゴヌクレオチドセグメン
トである。

第２図は、合成γ−インターフェロン遺伝子二重鎖のプ
ラスミド１）ＡＴ　１５３へのクローニング、およびｐ
ＸＹ　ｉからの表現シラスミドｐＪＢ　１の構築を示す
。

第６図は、合成γ−インターフェロン遺伝子について、
天然アミノ酸配列をコードする遺伝子のヌクレオチド配
列、およびＬｙｓユ、ｌがＧ１ｎ４□、のアミノ酸変化
を生じたヌクレオチド配列（Ｔ−＋Ｇ）を示している。

第４図は、プラスミド１）、ＴＢ　２０３の構築を示す
。

Ｌｙｅ□、１のヒトエＦＮ−γをコードする工ＦＮ−γ
遺伝子を含むハイコピーＴｒｐ　１５ベクターである。

第５図は、ｐＸＹ　ｉおよびｐｌ、２４ｃからのシラス
ミドｐＸＹ　２の構築を示す。

第６図は、Ｇ１ｎ１１１のヒトγ−インターフェロンを
コードするＩＦＮ−γ遺伝子を含むプラスミドｐＸＹ　
１０３の構築を示す。

第７図は、ハイコピーＴｒｐ　Ｅベクター、シラスミド
ｐＪＢ　２０３の構築を示す。

第８図は、Ｇ１ｎ１１□のヒトエＦＮ−γを：ｙ−ドす
るハイコピー成熟工ＦＮ−γベクター、プラスミドｐｃ
！０１の構築を示す。

第９図は、Ｌ７ＳｌｌｌのヒトエＦＮ−γをコードする
ハイコピー成Ｒ工ＦＮ−γベクター、プラスミドｐｏ０
１０３の構築を示す。

第１０図は、ＢａｍＨニーＳａｌエフラグメントで置換
されたハイコピーベクター、シラスミドｐａｃ　２０３
の構築を示す。

第１１図は、出発ＤＮＡとした表現プラスミドの制限酵
素地図である。

第１２図は、１１１位がＧｌｎであるγ−インターフェ
ロンのアミノ酸配列を示す。

代理人　浅　村　皓 図面の浄書（内容に＊更なし） くヒ　＜ト＜ド　＜Ｈ（ｐ。

（り　Ｕ　（）　（）　（り○　ＣＺＯ＜）−く　工＜
ＩＪ（り　＜ト　○Ｑ　■ＯＱ＜Ｈｃ、＋０ｒ−Ｑｏ　
）−＜ ｏｏ　Ｃり（−）　Ｈ＜　○■ ）−り＜ｈ　ＣＤ　（Ｊ　＜）− ○（り　＜ｈ　＜ｈ　Ｈり ＜Ｈ＜ｓ　トク１−（１： ○（り　＜ｈ　（［）−（［）− ト＜＜ヒ　＜トド＜ （）　＜）　（！：Ｉ　Ｑ　＜ｈ−０（Ｊ〜ＯＯり）−
（［）−（［１−（［）−＜）−＜ｈ　＋−（（Ｈ＜、
−＜ｓ ■ｏ　＜ｌ−（りｏ　（Ｊ（り　＜ト ０（り　ＯＬ）　ｌ−（［ｌ−＜ ｏ（［）−○■　００　■○ Ｑ○　ト＜ト＜ 〆〕 くヒ　ｃｑｏ　寸トく Ｑ　（！：ｌ　Ｑ　（り　（！：ｌ　ＯＵＯ＜）−＋＜ ＳＪ トく　くＨ寸　００ 区　ト＜　（り　Ｏ（り　Ｑ ６　０（り　）−（［＜）− −４１−’　Ｕ　（Ｄ　リ０ 緘　＜）−＜）−）−（［ ■○　＜　）−ｏ　（！：１ ＜ト＜ヒ　トく Ｑ Ｈく ○０の ０ ）−（［Ｏ Ｈく 寸ＯＱ 〇Ｑ の　ト＜＜ト 図　工 ψ 寸 工　− ！　に と　○−Ｊ（Ｊ−’ｕ上　リ？　り山　Ｕ上−〇　−Ｑ
　〜＜ｒｑ）−寸」　０の　■ｌ第１頁の続き Ｑｌｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整一＠発明者　ポ
ール　ガビン　ボー　イギリススリイ　フィール 国パックス、ハイ　ウイコウム、サンズ、ヒースド　ロ
ード、タッチウッド　（番地なし）手続補正書（方式） 昭和６ｏ年　３月　９日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和〃年特許願第二ｘｒｂ＜ｔ、ｉ号 ２、発明の名称 ｇズｌ艷ｒ−レ←インダーフルＱン ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日イ］ 昭和６０年上　８１６日 ６、補Ｉｌミにより増加する発明の数 ７、補正の対象 図　面 ′す）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）図６で表されるＤＮＡヌクレオチド配列からなる
   組成物 （２、特許請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド配列
   におけるＴ３３１がＧで置換された特許請求の範囲第１
   項記載のＤＮＡヌクレオチド配列（３）　ヒトγ−イン
   ターフェロンの合成を調整できるＤＮＡ配列を操作可能
   に連結した特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡヌクレオ
   チド配列 （４）　ヒトγ−インターフェロンの合成を調整できる
   ＤＮＡ配列を操作可能に連結した特許請求の範囲第２項
   記載のＤＮＡヌクレオチド配列 （５）　図１２で表されるアミノ酸配列からなり、ヒト
   γ−インターフェロンのアミノ酸配列のＬ７ｓ１１１が
   Ｇ１ｎ１１１で置擬すれた改良γ−インターフェロン ｉ６１　ｐｃｃ　２　（ＡＴＣＯ＠　６９，４９６号）
   およびｐｃｏ　２０３　（ＡＴＯＯ第３９，４９４号）
   よりなる群から選ばれるシラスミげ （７）特許請求の範囲第６項記載のプラスミドで形質転
   換されたｉ救主物 （８）特許請求の範囲第５項記載のポリペプチドの治療
   有効量からなる医薬としての投与に適した組成物 （９）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡヌクレオチド
   配列を含有する微生物を発酵させることを特徴トスルヒ
   トγ−インターフェロンの製造方法（１１）　特許請求
   の範囲第６項記載のシラスミＰで形質転換した微生物を
   発酵させることを特徴とするヒトγ−インターフェロン
   の製造方法