JPS60185726A - 免疫調整医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用可能性〕 本発明は人のイムノグロブリンＧＱ、Ｆ（７９グメント
を主成分とする免疫調整ないし免疫変更医薬に関する。

この医薬は自己免疫疾患の処置を含む免疫機能障害の処
置において、また移殖免疫禁止剤として、また臓器移殖
を既に受けているかもしくはこれから受けるべき疾患の
処置において特に使用されることができる。

〔従来の技術〕

臓器特に腎臓及び髄の移殖は広く行なわれている。主要
な組織適合性についても研究は進んでいるといっても、
移殖された臓器の外部的細胞を生体が破壊する反応即ち
拒絶反応をさけるために免疫禁止を人為的に惹起させる
ことが必要とされている。

このような免疫防衛を禁止するために、特に完全な照射
、化学療法（アルキル化剤、グリ／塩基の類縁物）、成
る種の抗生物質及び抗リン・９球血清の使用に基づいた
種々の方法が知られている。

これらの免疫禁止法には、周知のように、これらが移殖
に対する生体の自然の防衛だけでなくウィルスや微生物
のような感染性病源体に対する自然の防ｌ＃ヲも麻ひさ
せるという不具合がある。患者はこれらの感染に対して
無防備にな夛、これを防ぐための強制的な対策が講じら
れなけｉｔばならない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、移殖された臓器に対する免疫防衛反応
を禁止し、感染に対する防衛において重要な役目をする
ことがわかっている体液性免疫の防衛反応は禁止せずに
むしろ増進させる薬剤を提供することにある。

本発明による医薬の活性成分は人のイムノグログリンＧ
のＦｃ　ｙラグメント又はその類縁物によって形成され
る。

〔問題点を解決するための手段〕

周九のように、イムノグログリン（Ｉｇと略記される）
は、いろいろの規準に従って複数のクラス（ＩｇＧ　、
　ＩｇＭ　Ｎ　ＩｇＡ　％　ＩｇＤ及び署ｇＥ）に分類
されている蛋白質である。

血清の主要なイムノグロブリンであル１ｇＧｔｊ：、池
のイムノグロブリンと同様に、長鎖構造をもち、いろい
ろの脱離反応（特に酵素化学的脱離反応）によって、こ
の蛋白質のいろいろの７２グメントが単離されている。

即ち、ＩｇＤ分子は、ｔ’　７４′イ／又はグラスミン
で加水分解した場合、３つの７２グメント即ち抗体の場
所を各々有する２つの７２グメン）　（Ｆｅｂフラグメ
ントと呼ばれる）と、抗体の場所は有しないがいろいろ
のエフェクター機能を有する７つの７ラグメント（Ｆｃ
　）２グメントと呼ばれル）とを生ずる。

・や・ｅイン、グラスミンなどによる酵素化学的脱離に
よってＦｃ７？グメント又は類縁の７２グメントを取得
する方法は周知であり例えばＲ，Ｒ。

ＰＯＲＴＥＲ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　Ｊ、−乙３　、　
ｐ／／’／Ｃ１９Ｊり）に記載されている。

本明細書において特に反対の表示がなければＦｃフ２グ
メントとは人のＩｇＧの７ラグメントＦｃを表わすもの
とする。

ＦＣ７？グメントの薬理学的特性と、種々の免疫防衛機
構においてのその種々の役割とについては現在まで多く
のことが未だ解明されていない。

動物モデルについての研究は、池の種においての活性に
ついて結論を導出させえない。それは周知のようにイム
ノグロブリン特にＩｇＧが種によって相違することと、
イムノグロブリンが異なる種の免疫応答に異なった作用
を示すこととのためである。

種々のイムノグリグリ／のＦｃ７？グメントがラット及
び人のリン・９球の多りローノ活性及び増殖応答に対し
刺激作用を抗原の存在又は不在において示すことは多く
の文献に記載されている。その反対に、マウスのリン・
２球に対して山羊のイムノグロブリンのＦｃフ２グメン
トは、ごくわずかな細胞分裂効果を示すにすぎないし、
ウサギ又はガチョウのイムノグログリンのＦｃ７ラグメ
ントは、用量と無関係に、いかなる刺激作用も示さない
（例えばＭ、＾、　ＢＥＲＭＡＮ　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｈ
ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａ　／　ＩＡ　６　ｐｐ、２４Ｌ／
−１５−６（／７７７）及びＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　＊　／　２２　＋ざター７
６（／り７り）参照）。

人のミニロームのＦｃ　フラグメントが混合リン・９球
反応においてマウスのす／−４球の増殖の促進ないしは
増大を誘発することも知られている（例えばＥ、　Ｌ、
　ＭＯＲＧＡＮ　ほか、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　／
！；３゜Ｉｆｐ、　／　／　ｌ、／−／／　７２　（／
　９どｌ）参照）。

人のＩｇＧ及びＦｃフラグメントが（ＩｇＧインタクト
（即ちＩｇＧそのもの）と同様に〕抗体依存細胞性細胞
毒禁止効果をもつことも知られている（例えばＷｌｓｌ
ｄｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、。

３、ｐｐ、２タ一３ｇＣ／り７ＩＡ）参照）。

成る種の免疫反応に関与する人のＮＫ（ナテユ之ル・キ
ラー）細胞はＩｇＧのＦｃフラグメントの受容体（レセ
プター）をもつが、ＮＫ細胞の細胞毒活性はこの受容体
と調和しない、ということも知られている（　Ｍ、　Ｅ
、　Ｎｅｖｌｌｌｅ　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｌｍｍ
ｕｎｏｌ、、／　２３　、ｐ、２ｂＯ’ＡＣＩ９１０）
　参照）。

免疫防衛機構の複雑さと免疫調節現象の多様性とに留意
して、免疫変更薬剤のような活性物質の使用は、免疫学
の分野の実際の知識に基づいて、体液性及び細胞性のい
ろいろの免疫反応、特に細胞毒性細胞及び抑制細胞の活
性化及び禁止に対する活性物質の活性全体を突きとめた
後にしか試みえないことを知るべきである。この突きと
めは同種のモデルについて行なうべきであシ、さもない
と前述した理由によシ医薬としての最低の活性も実用化
できなくなる。

同種のモデルに対する人のＩｇＧのＦｃフラグメントの
性質の研究にょシ、この７ラグメントを免疫変更薬剤と
して利用し、特に自己免疫疾患を処置したシ、臓器移殖
の際の拒絶反応を防ぎ、またはその効果を低減させるこ
とを可能とする有用な薬理学的性質が見出された。

リン１球の増殖応答を刺激する人のＩｇＧのＦｃフラグ
メントは１次間種反応（ｒ≦ａｃｔｉｏｎｐｒｏｌｉｆ
ｅｒａｔｉｖｅ　ｐｒｉｍａｉｒｅ　）に対しては作用
しない。その反対に、Ｆｅｂフ２グメント及びＩｇＧイ
ンタクトは／次回種反応に禁止作用を示し、増殖応答に
は作用しない。

人のＩｇＧのＦｃ　フラグメントは、Ｆａｂフッグメン
ト及びＩｇＧインタクトと同様に、抗原の存在下に、リ
ン２２球応答に刺激作用も禁止作用も示さない。

人のＩｇＧのＦｃフラグメントは／次混合リン・９球反
応（ＣＭＬ　Ｉ　）において細胞毒性細胞の発生現象を
禁止せず、また誘発もしない。しかしＦｃフラグメント
が、１８Ｇインタクト及びＦａｂ７ラグメントと同様に
、２次混合リン・４′球反応（ＣＭＬＩ［）において細
胞毒の禁止活性をもっことが見出されている。

この最後に述べた性質が見出されたことによシ、抑制細
胞の刺激ないしは増殖に対してＦｃフラグメントが有し
うる影響を研究することになった。

以下にこの明細書の実験部分に示される研究は、人のＩ
ｇＧのＦｃ　７ラグメ、ントが、抑制リン／４１球の発
達を促進する活性並びに予備抑制細胞の刺激を助長する
活性をもつことを示している。

最後に、細胞分裂型反応においての全イムノグログリン
の産生に対するＦｃフラグメントの影響の研究によシ、
全イムノグログリンの産生は増大し、Ｆａｂは不活性で
あＪＪ、１ｇＧインタクトは、逆に、全イムノグロブリ
ンの産生の禁止をもたらすことが示された（　Ａ、　Ｄ
ｕｒａｎｄｙ　ｅｔ　ａｌｌ　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、　６７　、　ｐｐ　Ｉ　６７−Ｊ’　
７７．７９ｇ７年３月）。

なお、抗体依存細胞毒活性ＣＡＤＣＣ）の禁止と抑制細
胞の分化とについて、検討中の物質の用量に比例した効
果が認められている。これはＦｃ７２グメントがＴ　Ｉ
Ｊン・ぞ球小個体群の成るものに直接作用することを考
えさせる。

従って、人のＩｇＧのＦｃ　フラグメントのこれらの特
性は体液性免疫を助長しつつ細胞性免疫を禁止し、従っ
て臓器移殖を受ける疾患、免疫機能障害を伴う疾患並び
に特に自己免疫疾患の処置に有利に使用しつる免疫調節
薬剤として、該フラグメントを用いることを可能にする
。

本発明による薬剤は、その有効成分が、ＩｇＧインタク
トのＦｃ　フラグメント及び／又はＦａｂフラグメント
により形成され、これらを （Ｆｃ　＋Ｆａｂ＋　ＩｇＧ　）全重量に対し２重積チ
よシ、特に７重量％よシ、多くは含まないこととを特徴
とする。

なお、本明細書において「人のＩｇＧのＦｃフラグメン
トの類縁物」とはＦｃフラグメントもしくはザブフラグ
メントであシ、またＦｃフラグメント上に存在するペノ
チド連鎖を含む合成又は半合成イグチドであシ、またこ
れらの７２グメント１サブフラグメント又は被グテドの
誘導体であり、ただしこれらのフラグメント、サブフラ
グメント、ベグチド又は誘導体は次の条件、即ち （イ）　抑制細胞の分化の活性化特性をもつこと、（ロ
）　抗体依存細ｊ抱毒の禁止特性をもつこと、並びに、 （ハ）　ＮＫ細；抱の活性化特性をもたないことを満た
すものとする。

本発明による薬剤はこれを経口的にまたは静脈内に又は
筋肉内に投学することができる。本発明による薬剤はそ
のためにカプセル、ゼラチン袋、糖衣錠、注射液又は注
射用凍結乾燥粉末の形態とされてよい。

経口投与の場合、胃の障害を通過しつるように耐酸性の
錠皮に包んだ薬剤形式とする。

臓器移殖の場合、本発明による医薬の投与は移殖の前後
に医薬によシ使用される免疫低減技術に従って種々の形
態で行なわれることができる。

本発明による医薬は、移殖の免疫低減を惹起さけるため
に、臓器移殖前に、又はその後に、池の免疫抑制医薬に
続いて、又はそれと共に投与されてよいが、本発明によ
る医薬の免疫変更効果は一般に６〜７０日後にしか生じ
ないことに配慮すべきである。

用量は特に投与形態と処置相とに依存し、一般に成人の
場合に有効成分は７日／ｍ９〜１０ｇの範囲にある。例
えば静注の場合Ｆｃフラグメントの用量は成人／日当１
）／１１〜１０９である。

本発明は、特に自己免疫疾患を処置し、臓器移殖を受け
たか又受けるべき疾患において拒絶反応を抑制するか又
はその効果を少くすることのできる免疫変更医薬を製造
するために、人のＩｇＧの７ラグメン）　Ｆｃ又はその
類縁物を使用することをも対象とする。この使用は特に
通常の方法に従って医薬としての適切な形態とすること
に関係している。

本発明による医薬はもちろん池の免疫低減剤又はコルチ
コイドと併用して差支えない。

以下の例はもちろん本発明を限定するものではない。

本明細書に使用する略記法の意味は次の通シである。

ＡＤＣＣ・・・抗体依存性細胞性細胞毒。

ＢＡＳ・・・ウシの血清アルブミン。

ＣＭ　Ｌ　・−リンノソ球性細胞毒（Ｃｙｔｏｔｏｘｌ
ｃｌｔｅ’ａ　ｍｅｄｉａｔｉｏｎ　Ｉｙｍｐｈｏｃｙ
ｔａｌｒｅ　）　。

Ｆ（ａｂ’）”・・・イプシ／でＩｇＧを脱離して得た
フラグメント。

ＧＲＰ・・・ヒナ烏の赤血球。

Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ　ＤＲ・”　ＨＬＡ糸の１Ｄ−関連
１決定要因。

ＨＬＡ　Ｄｒ、　ＨＬＡ　Ａ、Ｂ、　ＨＬＡ　Ｄ　＝・
人の白血球の組織適合系の抗体決定要因。

１ｇ　・・・イムノグロブリン。

ＭＬＲ・・・混合リン・ぞ球反応。

ＰＢＳ　・・・リン酸塩緩衝液。

ＰＨＡ−Ｍ・・・植物性血球凝集素。

ＰＷＭ　”・−ｐｏｋｅＷｅｅｄｍｉｔｏｇｅｎ（’ｖ
−’ｚ−ｒ”Ｍつの細胞分裂誘発因子）。

ＳＶＦ　・・・ウシ胎児血清。

５ｒＡＢ　・・・ＡＢ血清。

以下の実施例においてＦｃとＦａｂのフラグメントの分
離は（硫酸アンモニウムによる）塩析、次いでコラムに
よる分子フルイ（ｒル濾過）とによって遂行された。

実施例　／ 人のイムノグロブリンのＦｃ　フラグメントの薬理学的
性質の研究。

■・・・リン・９球増殖の研究 ＩｇＧのＦＣ及びＦａｂフ２グメント及びＩｇＧのリン
・ぐ球増殖活性の研究。

原材料及び方法 ｓｏｙｕｍ　Ａ、（５ｃａｎｄ、　Ｊｅ　Ｃ１１ｎ、　
Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　５ｕｐｐｌ。７７、／り６ｆ、、２／
、ｐｉ）の技術に従って、フイコールーラジオセレクタ
ンの勾配（ｄ　：　１０７７）で、ｌ、ｏ人の自発的な
血液供与者の末梢静脈のリン・ぐ球を採取した。

前記のようにして得たリン・ぞ球個体群からウルマー及
びフラッドの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　、　／　？　７９　、３０　ｐ、　／
　）に従って、ペルコールの勾配（ｄ：１０ＡＩＡ）で
、単核白血球を分離した。

Ｃ０粘着細胞のなくなったリン・ぐ球の取得前項（ａ）
に従って取得したリン・ぐ球個体群を（ファルコ／型）
の７シスコ内で７時間３７℃で培養した。非粘着細胞は
回収した。

これらの３形式（ａ、　ｂ、　ｃ　）の細胞個体群を一
２６０℃で保存し、試験の際にばらばらにした。

ｄ、ペルオキシダーゼ反応 各個体について／塗抹標本当シ全≠ＯＯ細胞の数で、Ｓ
　Ａ　Ｔ　Ｏ（Ｔｒａｉｔｅ　ｄｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｅ
ａｐｐｌ　ｌｑｕ　ｅｅ　、　／り６ｔ／Ｌ、ｖｏ　ｌ
　＊　３ｕ　ｐ　９　Ｋ　）によって組合されたペルオ
キシダーゼ反応に従って、各々のリン・ぐ球個体群内の
単核白血球の百分比を定めた。

２、Ｆｃ−Ｆａｂ及びＩｇＧ７ラグメントグラスミンで
処置した人の血漿１ｇＧを出発物質として、既知の方法
に従って、いろいろのサブフ２グメノトを作製した。Ｉ
ｇＧ（ＰＲＧ）は「１型（３０％）と「２型（７０俤）
とである。

ｐａｂはＦｃ４４／％で汚染されているがＦｃは純粋で
ある。

３、培　養 ａ、脱補体自己類縁血清（Ｓｅｒｕｍ　ａｕｔｏｌｏｇ
ｕｅｄｅｃｏｍｐｌｅ’ｍｅｎｔｅ　）　、２０　％　
ｋ加え九ＰＰＭ　ｌで、丸底のマイクロプレート（微小
板）上（板７枚当り７６カノブ）で、リン・ぐ球の変性
試験を行なった。

各々のカップに、ＲＰＭＩで希釈したＦｃ５Ｆａｂ、Ｉ
ｇｃ又はＰ　Ｗ　Ｍ　（Ｇｉｂｃｏ　）　、ｆ　Ｏｐｉ
と自己類縁血清ＲＭＰ　ｌ　（２０％）／ｊＯμ慴ｌと
の下に、細胞、２ｏｏ　、ｏｏｏ　個を分散させた。

各７ラグメントの各々の希釈物を３組作成して試験した
。

ｂ、培養。空気りｊチについてＣ０２ｊチの雰囲気中に
おいて、水分を飽和させた３７℃の培養（Ｋ内で微小ｔ
ｌ１ｇ、を６日間培養した。

Ｃ０トリチウム処理されたチミゾンによる標識。

トリチウム処理されたチミジン／マイクロキュリーを／
／１．≠１時間目に各々のピントに加えた。＋ψ℃に冷
却することにより、／乙〜／に時間後に、合併を中止し
た。

ｄ、ヘータ計叙器によす、シ／チレーション醇液の助り
を借りて、スカトＬＩ／上に沈殿さげて回収した細胞を
計数した。

結　果 試験した６０個の個体のうち≠３．≠係は高応答（≧１
０，００．９ｃｐｍ　）、７ｇ、３％は低応答（＜１０
，０００ｃｐｍ　）、３　ｇ、　３　％は無応答（＜、
２，０００ｃｐｒｎ　）であった。

高応答又は低応答の基準は、フラグメン）Ｆｃ（表１）
の場合、細胞培養についての増殖応答に従って設定され
た。

正のベルオキシダー−ＰＫ４Ｂ　１１１の百分比は３つ
の群Ｖこついて３．２チであり、粘４に田胞のなくなっ
たリン・９球個体率の場合は、／〜、２係であった。

Ｆｃ　％　Ｆａｂ及びＩｇＧのフラグメントについては
／培地当り乙、／！μｌ及び−≠μｇにおいて試験した
。５０及び７００μｇの場合には先行する群（Ｄ−Ｎ−
３）について目立った差異を与−えない。

結果は表／に示す通りである。

結　論 Ｆａｂ又は全１ｇＧに比べてリン・ぐ球増殖応答、・こ
おいてフラグメントＦｃ、が刺激作用を示すことと、こ
の活性にとって必要なマクロファージの存在することと
がこの試験によシ明らかになった。この結果は、最大増
殖応答が／培地当Ｆ）１０ｐｇ、３日間であるマウスの
リンノｆ球についてのウェイグル（Ｗｅｉｇｌｅ　）　
の研究に近い乙のである。同様に、粘着細胞がなくなる
ことは、マウスのリン・９球の増殖応答の不在を惹起さ
ぜる（　Ｊ、　Ｅｘｐ、〜ｉｅｄ。

／９７９．／３０．ｐ、２；ｌｙ）。

「　同鍾リン・ぞ球増殖の（ｄｆ究 ／次次回増殖応答においでのＩｇＧのＦｃ及びＦａｂフ
ラグメント並びにＩｇＧインタクトの助長又は禁止活匪
のωｆ究。

原材料及び方法 鍾々の７２グメントの取得と単核白血球及びリン・９球
の分離技術については以上に説明した。

■リン・９球の取得 Ｍ、ユリウスはかの方法（Ｅｕｒａ　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ。

ｌり７３，３．ｐ、乙＋５）に従って、ナイロンクール
の力２ム上で■リン・９球の分離を行なった。

ＩＯ艷の注射器（シリ／））中において、ナイロンウー
ル０．６ｇと共に、３７℃で３０分間リンノ４球’ＡＸ
１０’　個を培養した。

非粘着細胞を回収した。ベルオキシグーゼ及び口上ツ）
Ｈの発色の制御を、リン・ぞ球富化をイ商めるために行
なった。

これらの細胞を混合培地の応答細胞として利用した。

ｐ３″９０） 単核白血球富化（／Ｘ１０６／−）されたリン・臂球を
トーマ／・マリリンの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　
＋／りｇ、２）に従って、Ｆｃ　、　Ｆａｂ又は１ｇ６
０μｙと共にＲＰＭＩ　／６４Ｌθ−、２０　’ｉｓ　
５ｒＡＢ媒質中で２μ時間３７℃で培養した。、２μ時
間後に上清を遠心分離によつ−Ｃ回収した。

リン・９球の混合培養 応答細胞（非粘着細胞）ｆ、計数し、／×／θ６／−の
ａ度に調節した。刺激細胞（全リン・や球又は単核白血
球富化リン・ぐ球の全個体）をｌ−及び細胞ｆＸｌｘ１
０６個当シマイトマイシ／Ｃ，２ｊｐ１１で（ＢＡＣＨ
，５ｃｉｅｎｃｅ、　／９１１６４　ｖｏｌ、　／ｊ３
゜ｐ　５ｔｉ−ｓの方法により）３０分間３７℃で処理
した。

処理後に細胞をＲＰＭＩ１０％Ｓｒ　ＡＢで２回洗浄２
した。細胞の懸濁体を／Ｘ１０６／ｌｒｉ。

１２×１０’／ｍ１Ｓｌｐ×１０’／ｍｌ及び３×１０
’／ｖｔｔの異なった濃度に調節した。

−・ミルトン注射器を用いて、円錐底の微小板内で、応
答細胞０．　Ｏｊｄ、刺激細胞０．０　！ｉ　ｗｔ／、
ＲＰＭＩ　Ｏ，０５４１２０％５ｒＡ８の割合で刺激細
胞及び応答細胞を分布させた。

３７℃−Ｊ：チＣＯ２の培養室で５日間微小板を用いて
培養した。り乙時間目に／カップ当カλμＣｕのトリチ
ウム処理されたチミジンを１ｇ時間かけて加えた。スカ
トロノ型マイクロ沈殿器を用いてフロー濾過器上で沈殿
させることによシ培養物を回収した。各々の濾過器を乾
燥後にゲラステック管に入れた。シンチレーション溶１
ｆＬ３．ｄ’ｌｃ各管に加えた後、液体シンチレーショ
ンカウンターで計数を行なった。結果を１分間打点数（
ｃｐｍ）で表わす。

結　果 いろいろの濃度のＭＬＲとＦｃ　１Ｆａｂ及び１ｇいろ
いろの濃度のいろいろのフラグメントＦｃ。

Ｆａｂ及び１ｇをＭＬＲＩに添加した。

いろいろの濃度（／２．２３．！０及びｉｏ。

ｐｌ／　／培地）の７２グメントＦｃは、ＲＰＭｒＫ比
べて、ＭＬＲＩの助長作用又は禁止作用を示さなかった
。

その゛反対に、１００μｇ／培地の濃度のＦａｂフラグ
メントはＭＬＲＩの禁止を示した。ｊｏ及び／θθμｌ
の濃度のＩｇＧはＭＬＲＩの禁止を起した。

この方法は増殖応答の準最適条件において種々の７ラグ
メントの作用を発現させるために行なわれた。ＲＰＭＩ
に比べて顕著な差異はみられなかった。ｊＯμｇの濃度
までの＋ｇＧのみはＭＬＲ１の禁止を与えた。

単核白血球富化刺激細胞の使用下のＭＬＲに対フラグメ
ントＦｃの誘発によるＴリンｔ４球の活性化が、マクロ
ファージを介して行なわれるため、準最適培養条件を保
って、最も好都合の培養条件にあるように努めて培養を
行なった。試験されたいかなる用量においても、補助な
いし助長効果は認められなかった。禁止効果はｌ培養物
当り、２１Ｉ−μｙのＩｇＧについて認められた。

Ｆｃ　ｓ　Ｆａｂ　又は１ｇを用いて培養した細胞の上
清及びＭＬＲ 増殖応答は刺激細胞と応答細胞との間の接触後何時間か
して開始され、マクロファージに対するサブフラグメン
）Ｆｃの産生は最初の！≠時間内に行なわれるので、種
々の７２グメントト共に２≠時間３７℃で培養した単核
白血球富化リン・（球由来上浦をＭＬＲに添加した。

これらの上清は応答細胞の自己類縁性細胞から調製され
、最適及び準最適の増殖条件の下にＭ　’Ｌ　ＲＩ内に
おいて試験された。

Ｆｃ　、　Ｆａｂ　７′ｙｆｌ　７　）　５１ｆｉ　Ｉ
ｇ　ｔｌｃツイテ、いかなる禁止効果も助長効果も認め
られなかった。

結　論 ／次回種リン・９球反応において、細胞ｊ　Ｘ　／　０
’個当シロ、／２．２≠、ｊＯ及び１００μｙの濃度で
、人のリンパ球に対゛して、７ツグメン）　Ｆｃではい
かなる顕著な助長又は禁止活性も認められなかった。使
用した用量の選定は、７１Ｊ　７　ｔＪ？　球に対する
プラスミン）Ｆｃの増殖作用が発現された時に定められ
た（前掲グロトコール　Ｉ）。

その反対に、全イムノグログリンと７−）グメン）　Ｆ
ａｂとは、試験された全部のモデルにおいて、／欠同種
応答の抑制を与える。

細、胞毒性のいろいろの形式に対するＦＣ１Ｆａｂ各７
ラグメント及びＩｇＧの活性の研究。

原材料及び方法 ざう／ティアの供与者の末梢血管リンパ球の分離及び種
々のフラグメントの取得については前述した通りである
。

ＦＣＳＦａｂ及びＩｇＧ　。

プラスミンで消化されたガムマ胎盤 ＩｇＧサブクラス：　ＩｇＧ　１　＝！；　７チＩＢＧ
　２　＝３７チ ＩｇＧ　３　＝０．２チ ＩｇＧ　４　＝３．７チ 抗体依存性細胞性＃Ｉ胞毒（ＡＤＣＣ）使用される方法
はＦ、　Ｖ／Ｉ　５ＬＯＦＦ　、　Ｔ、　Ｅ　。

ＭＩＣＨＡＥＬＳＯＮ　、　Ｓ、　Ｓ、　ＥＲφＬＡＮ
Ｄ　ｏ　５ｃａｎｄ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ　＋ｊ　３　＋　ｐｐ　２７−３ｇ、／
り７≠）に記載されている。

標的細胞は、ウサギの抗−ＧＲＰのＩｇＧで感作されク
ロム５／で標識されたＧＲＰである。

試験ＡＤＣＣ エフェクター細胞（末梢血管のリンパ球）は計数され１
．ｆＸ１０／ｍｌ　ＲＰＭＩ１０％ＳＶＦのｍｆｆｌ１
ｃ調節された。

ハミルト／注射器を用いて３組の異なる濃度の被検生成
物５ｏｐｔエフエクター細胞／　００　ｐｔ金丸底微小
板内に分布させた。

２０分間３７℃で培養した後、感作され標識されたＧ　
ＲＰ　ｊ　Ｏｐｔを分布させ、／標的細胞に対するエフ
ェクター細胞５０個の最終比Ｃ；Ｏ”、／）とした。

自然塩析（ｌａｒｇａｚｅ　ｐｐｏｎｔａｎ；　）は、
ＲＰＭＩｌｏチＳＶＦの媒質の使用下にＧＲＰを培養し
てこれを定め、最大塩析は、／Ｎ＃ｉ酸をＧＲＰに添加
してこれを定めた。抗血清活性の参照として、正常なウ
サギの血清で予め＠養したＧＲＰと向い合いにエフェク
ター細胞をおいた。

湿めった雰囲気中でｊ％ｃｏ２下に１１時間３７゜Ｃで
培養した後、微小板を♂００ｒｐｍで７０分間遠心分離
にかけ、バッファフィルター（ｐｌｏｗ。

ｒｅｆ、７Ｊ’−２７−００５）上に上清を回収した。

細胞毒性「ナチュラル・キラーＪ（ＮＫ）使用された方
法はＢ、　Ｍ、　ＶＯ３Ｅ　、Ｆ、　ＷＡＮＫＹ。

Ｓ、ＡＲＧＯＶ及びＥ、にＬＥＩＮ　Ｎ　Ｅｕｒ、Ｊ−
Ｉｍｍｕｎｏｌ、／り７７．ヱ、ｐｐ７ｊ３−７３７に
記載されている 標的細胞は、クロムｊ／で標識された細胞Ｋｊ６．２（
人のリニエ・ミニロイド〔骨髄菌株〕）である。

Ｎ　Ｋ試験 エフェクター細胞（末梢血管のリン・９球）をｓ’ｘ、
１ｏ７ｔｔ、之！；×１０／ｖｎｌ、／、　２　Ｘ　／
　０６／ｍｔ及びｌ、Ｘ１０　／−の濃１（に調節した
。

これらの分布及び処理はＡＤＣＣの場合と同じ方法に従
って行なわれた。標的細胞をｊＯＰｔ中に分散させ、／
標的細胞に対するエフェクター細胞数ＳＯの最終比とし
た（！；０：／、２６：／。

／、２：／及び乙：／）。自然塩析と最大塩析並びに上
清の回収はＡＤＣＣ試験の場合と同一の条件下に行なわ
れた。

この研究はＬＩＧＨＴＢＯＤＹ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎ
＝Ｂａｃｔ。

Ｖｉｒｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、／　９７／　、　Ｖ
ｏｌ、　Ａ≠。

ｐ、２≠３ＶＣ従って行なわれる。

エフェクター細胞 同質感作相は、前述したものと同様の混合培養に対応す
る（前記（ＩＩ）参照）。

２つの試験において感作は、応答細胞と刺激細胞とのＨ
ＬＡ　ＡＳＨＬＡ　ｅの間の差を勘案して、単−Ｈａｐ
ｌｏｔｙｐｅ　Ｄｒ　Ｋ対して行なわれた。

標的細胞 ２つの試験において、それぞれのＭＬＲの感作に用いた
刺激細胞を標的細胞として使用した。

ＰＨＡ−Ｍ（Ｇｉｂｃｏ　）に、）：Ｄ７２時間ｒｅｈ
されたこれらの細胞は、１０・７０６個の細胞について
、２００ｐＬの割合で、試験の前に／に時間クロムｊ／
で標識された。

連続洗浄後に細胞をブルートリ・クン（ｂｌｅｕｔｒｙ
ｐａｎ　）を用いて計数し、ｌθ０−１０３／ａｔに調
節する。次にＣＭＬ試験を丸底微小板内において行なう
。前述したように処理した／　００　ｐｔ中エフェクタ
ー細胞を、湿めった雰囲気内で、５％　Ｃｏ２の下に３
７℃で≠時間標的細胞５　ｏ　ｐｔと共に培養し、ＣＭ
Ｌ　Ｉの場合にはｓｏ”、ｉ、ＣＭＬＩＩの場合には６
０　：　／１．２．５’　：　／、／、２：／及び６：
／の比とする。自然塩析、最大塩析及び上清の回収を前
記の条件の下に行なう。≠つの細胞毒性試験において、
クロム５１の塩析を２分間ガンマ計数器によシ測定した
。測定結果は次式に従って、細胞毒の百分比として表わ
した。

／θチよシも高い細餓毒性はこれを全て正値とした。

結　果 抗体依存細胞毒 抗体依存細胞毒のｌ”ｃ　７ラグメ／ト及び１ｇにおい
ての禁止は全部の被検個体について認められた。この禁
止はＦｃ　フラグメント又はＩｇＧの濃度に比例して増
大する（表２）。

キラー活性の禁止は、ＦＣフラグメントの場合、ＩｇＧ
に比べて常により強く現出される。即ちＦｅ２ＰｇはＩ
ｇ！；Ｏｐｉと同等の禁止を示す。

その反対にＦａｂ　フラグメントについては、用量を非
常に高くしても、いかなる抑制効果も発現されない。

Ｆｃ　−Ｆａｔ）　フラグメント又は１ｇ　においては
、用量を非常に高くしてもＮＫ活性の抑制は全く認めら
れなかった。この結果を確かめるために３つの極限用量
（６μｌと７００μｇ）を用いて、エフェクター細胞−
標的細胞の異なった比においてＮＫ浩性を試験した。ど
んな用量及び比においてもいかなる顕著な差異を認めら
れなかった（表３）。

７次及び２次細胞性細胞毒 ＣＭＬ　Ｉは、いろいろの用量において試験されたＩｇ
Ｇ及びＦｃ　ｓ　Ｆａｂ　７７グメントの作用によシ変
更されなかった。

その反対にＣＭＬＩＩは、２３．Ｊθ、／θ０μｇの用
量でＦｃ及びＥａｂの各７２グメントによって禁止され
た。ＩｇＧは使用した全部の用量において顕著な禁止を
示した（表≠）。

■　７次同質応答の抑制細胞及び予備抑制細胞の目　的 予備抑制細胞の分化における同質増殖応答の抑制Ｔ細胞
に対するＦｃ５Ｆａｂ　フラグメント及び１ｇの活性の
研究。

原材料及び方法 自発的な供与者の末梢血管のリン・ぐ球の分離法及びい
ろいろのフラグメントの取得については前述した通りで
ある。

ゾラスミンで消化されたガムマ胎盤：　ＡＧＡ≠≠ｒル
濾過において利用されたフラグメントの純度：Ｆｃ　：
１０（７％、Ｆａｂ：りｌＡ６％、（、，５：４’−％
７Ｓ　）　。

＋ｇ（ＰＲＧ　）７Ｓ　：　９よ≠％　／θｓ：、２．
．ｒ％／　Ｏ５：　／、ｇ　％　、　ＩｇＧ１　：　！
；７％　、　ＩｇＧ２：３５？ｑｌ）、　ＩｇＧ　３：
　０．．２チ、　ＩｇＧ　４　：　３−７％。

従来の、または変更された血清学的方法及びり／・ぞ毒
性によって、ＨＬＡ−Ｄｒ複合体の主な決定因について
、血液の自発供与者を研究した（８細胞富化リン・１１
濁体）。

同種感作　Ｍ、Ｊ、　５ＨＥＥＮＹ、Ｆ、　Ｈ，ＢＡＣ
Ｈ。

Ｔ４ｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　＋　／り７６．Ｉ、
ｐｐ／！；７−／７／ 試験管内の四［感作のために、刺激剤として用いられた
ＡｇＨＬＡ−Ｄｒ’（，２５Ｐｇ／／　０６細胞／　ｍ
ｌ　）に対して不調和のマイトマイシン処置同種細胞ｌ
Ｏ・１０１６個と、応答体として用いたリン・３球１０
・７０１６個とを共存させる。７０日間ｊ係Ｃ０２の存
在下に３７℃で加湿培養室内で血清ＡＢグール１０チ全
添加したＲＰＭＦ　／乙≠Ｏの媒質２０−と共に、フア
シヨンびん（ＣＡ　３０／３）内において培養を行なう
。

抑制試験　（Ｊ、　ＤＡＵＳＳＥＴ　、　Ｎａｔｕｒｅ
、　／７７ｇ。

、２６７　ｐｐ’、ｊＯｊ） ３つの細胞個体群、即ち応答リン・ぐ球、マイトマイシ
ン処Ｕ刺激細胞及びマイトマイシン処ｔｍ種感作化細胞
（−これらの細胞は応答細胞に対し自己類縁性である）
を存在させて、ＭＬＲＩ内において、同種感作化リン・
９球の抑制活性を試験管内で評価する。

液体シンチレーションカラ／ターを用いテ計数を行なう
。

抑制率は次式によって評価する。

予備抑制細胞の刺激作用を証明するために２つの異なる
モデルについて試験を行なった。

第１のモデルは、別々のＦｃ　％　Ｆａｂフラグメント
又はＩｇＧについて末梢血液の全リン・臂球を１時間予
備培養することである。これらの細胞を数回洗浄した後
にマイトマイシン処置し、第３の細胞として前記条件の
下にＭＬＲＩ中においた。参照群はＲＰＭＩで予備培養
したものであった。

第一のプロトコールによシ、抑制細胞の発達に対し時に
助長作用が晃られることが実証された。

同種感作期において、０日（試駆当初）に、いろいろの
用量でＦＣ１１”ａｂフラグメント及びＩｇＧを添加し
た。１０日間の感作後にこれらの細胞を前記の条件の下
にＭＬＲＩＫ第３細胞として添加する。

最後に、抑制細胞に対するこれらのフラグメントの活性
を記述するために、３種類の細胞に対する試験にＦｃ　
、　Ｆａｂ、　ｌ＠をいろいろの用量で添加した。

結　果（表ｊ） び１Ｂの活性 抑制試験の際に洗浄及びマイトマイシン処置前に、いろ
いろの用量のＦｃ、Ｆａｂフラグメント又は１ｇを感作
細胞と共に７時間培養した。

Ｆｃ　フラグメントと共に予め培養した細胞は、使用し
たＦｃの用量に比例したＭＬＲＩの禁止の増大を与える
。この増大は／　！；　ｐ！　／−及び３０ＩＩ／ｌｉ
ｔの用量について顕著である。／、ｆｐｇの用量で１ｇ
の存在下に予備培養した細胞についてはＭＬＲの顕著な
禁止が見られる。

その反対に、Ｆａｂフラグメントと共に予備培養した細
胞は同種応答の顕著な禁止を示さない。

よ　同種感作中のＦｃ　ｓ　Ｆａｂ　ｓ　ＩｇＧの活性
同種感作の第０日に、異った用量のＦｃ　１Ｆａｂ７ラ
グメント及びＩｇＧインタクトを添加した。

７ラグメントＦｃの存在下に感作した抑制細胞は、／培
地当シｉ、ｓｐｇにおいても、７００μｙにおいても、
対照細胞に比べて非常に顕著なＭＬＲＩ禁止活性を示す
。地方では、Ｉｇインタクトと共に培養した細胞は、３
μｓよりも高い用量において、ＭＬＲＩの禁止の顕著な
増大を示す。

その反対に７ラグメン）　Ｆａｂの存在下に感作した細
胞はいかなる顕著な差異も示さない。

抑制比が非常に高くなった場合には、それにより増大の
評価が困難になる。補助的な実験を行なった。応答細胞
／抑制細胞比が／：／、２：／。

４Ｌ：／になるように、異なるＩＩＩ度で、同種感作さ
れマイトマイシフ処理された細胞を添加した。この場合
に、ＦＣフラグメントの存在下に１叱作された細胞に対
するＩＩＩの希釈において抑制活性の顕著な増大が見ら
れる。

試験に際して３種類の細胞のＭＬＲＩＫ異なる用量の７
２グメン）ＦＣ，１Ｆａｂ及び１ｇを導入した。助長活
性も禁止活性も認められなかった。

結　論 、２次応答の間に発達した抑制細胞の存在の最初の表示
は、同一の同種抗原に対し！同感作された細胞が、１同
感作の場合よシも少い増殖応答を与えることの観察に由
来し、活性過程の証明は照射同種感作細胞を従来の／次
ＭＬＲに添加することによってもたらされた。

抑制細胞は、刺激細胞により供与されたＨＬＡ−Ｄ「抗
原に対し特異性を示す。ｌＯ日日間培養の後に、同種感
作細胞のりｊチがロセツ）Ｅを形成し、３％以下が表面
ＩｇＧを有し、２％以下が単核白血球を有するので、抑
制細胞はＴ　ＩＪン・９球として現出される。試験管内
の同種過多免疫（ｈｙｐｅｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏ
ｎ　ａｌｌｏｌｅｎｉｑｕｅ　）によシ惹起される抑制
機構は、腎臓移殖前に行なわれる多重輸液過程に非常に
近いように思われ、これは０ｐｅｌｚ　ｅｔ　Ｔｅｒｏ
ｓｋｉ　（Ｔｒａｎｓ　ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、　／り
ｇｏ。

２９、ｐ／３３）に示されるように、移殖腎臓の生存率
を改善させる。

以上に述べた実験の目的は抑制細胞に対する直接活性と
予備抑制リンパ球の発達においてのＦＣ１Ｆａｂフ２グ
メント及びＩｇＧの活性とを証明することにあった。

自発的供与者の末梢血液のリン・ぐ球分離方法及びいろ
いろの小個体群の取得、例えばいろいろの７２グメント
の取得。上記参照。プラスミノで消化されたガンマ胎盤
：（純度及び特性については上記参照）。

２、抗血清のヨード／、２ｊによる標識山羊のＦ　（ａ
ｂ”）　、２から人の抗全１ｇ（カッペル・うｄ？ラド
リーズ）をヨード／２Ｓ；　５ＩＩ−で標識する。

次に、過剰なヨードと標識Ｆ　（ａｂ’）、２との混合
物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　３０カラムの中に入れる。

リン酸塩緩衝液０．６Ｍ　ｐＨ７，５の標識の結果によ
れば、第１のピークはＦ　（ａｂ’　）　２　（分子’
ｌｓｏ、θ００）に対応し、第１のピークはｇ〜ＩＯ−
の容積に対応する。プロティン支持としてガムマグログ
リンのない馬の血清／チ（最終）を添加する。

標識効率を次式により計算する。

比活性を次式によシ計算する。

ｐｍ ｎ　ｇ　Ｆ　（ａｂ’）、２標識 ３、　人のＩｇＧの滴定：ＲＩＡ試験 試験互換ツカツノの抗１ｇ山羊Ｆ　（ａｂ’）２を＋≠
０Ｃで一夜中吸収させた後に１時間３７℃でＰＢＳ十Ｊ
［ＢＳＡをこれらのカップに吸入し飽和させる。

Ａ、被検体の培養 標準ガムマグロブリンの希釈： ａｔｌｔ６０ｐｇ／−の胎盤ガムマグロブリンヲ用いた
。ｐＢｓ、０．ｊ％ＢＳＡ及び０．０３　ＴＷｅｅｎ２
０でこの溶液の／／２、／／２を続けて７０回希釈する
。

被検物の希釈： ６０ｐｇ／−の割合で、Ｆｃ　％　Ｆａｂ　％　Ｉｇ又
はＲＰＭＩの存在下に、１０％５ＶＦ７’＞ｘＲＰＭＩ
ｌ−７Ｏ６／−と共に、末梢血液の細胞、非粘着細胞及
びマクロ７アーノ富化細胞を６日間培養し、遠心分離後
に上清を集収する。

次にこれらを／／３．／／２５．／／／２３としてＰＢ
Ｓ、ｏ、ｊｌ　ＢＳＡ及び０．０　ｊ　％　Ｔｗｅｅｎ
２θ中において別に使用する。

生成物の各々の希釈の分配は、３コピーで／カッグ当９
１０θμｔの割合とする。

これらを２時間３７℃で培養し、何回か洗滌する。

Ｂ、抗原接触−山羊Ｆ　（ａｂ’）、２　、人の抗Ｉｇ
　Ｎ標識、ヨード１２３ 各々のタッグに標識希釈Ｆ　（ａｂ’）　、２　（／　
００１１ｔ）を分配する。２時間３７℃で培養した後に
ＰＢＳＴｗｅｅｎで何回か洗浄する。これに続いて各カ
ップを完全に吸引する。ガムマカウ／ターで計数する。

Ｃ６上清中の１ｇ量の決定 ｃｐｍ真＝　ｃｐｍ　（ＦＣ＊＋す７’４＋ＲＭＰＩ血
清）−ｃｐｍ　（Ｆｃ　＋　ＰＰＭＩ血清）＊Ｆｃ、Ｆ
ａｂ又は１ｇ 次に標準のｇ４数として曲線の回帰（ｒ≦ｇｒｅｓｓ　
ｔｏｎ　）の研究によりこれらのｃｐｍを分析する。

結果及び結ａｉｌｌ（表６） Ｆｃ７９グメントの存在下のいろいろのリン・ぐ球小個
体群からの全イムノグログリンの産生はＦａｂフラグメ
ントを用いる場合よシも相当に太きくなることが示され
ている。

その反対に、ＩｇＧは、ＩｇＧの自然産生の場合に比べ
て、全１ｇＧの産生を刺激するというよシもむしろ禁止
するようである。

ＲＩＡｒｊＨｒｌｆＫイムノダａプリン及びサブ７ラグ
メントを導入することは、比較可能な結果を得るために
細胞なしにｊ日間上清について並行チェックを？テなう
必要をもたらす。

この方法は、ＦＣで刺激されたリン・９球からＩｇＧが
試験管内で産生されることを証明する助けになる。

実施例１二医薬組成物の製造 ０ＮＣＬＥＹ　Ｊ、　Ｌ、及びｃｏｌｔ、　Ｊ　、　Ａ
ｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、　／　９’ｌ−９、７／　、　ｐｊ１１ｔ／
の技術に従って精製され、ＰＬＡＮＲ，及びＭＡＫＵＬ
Ａ　Ｍ、　Ｆ、　。

Ｖｏｘ　Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ　、　／り７５　、　Ｖｏ
ｌ、−２ａ’　ｅｐｐ／Ｊ−７−／７３　の技術に従っ
て人の白漿で処理した人のＩｇＧから７ラグメン）Ｆｃ
を作製する。

これらのＩｇＧは、胎盤から抽出又は静脈から採取した
血液に由来する。ＦＣａｐｙｒｏｇｅｎｅフラグメント
溶液を無菌に濾過し、７つのフラスコにつイテ活性成分
ないし有効成分２５ｇの割合に分散させ、凍結乾燥する
。

使用時には溶液を注射可能な調製物のために用いる水で
再構成する。

手続補正書 昭和　年　月　日 特許庁長官　志　賀　学　殿 ］、＊４’ｌ′ｌｌ＋、）。　ｌ＠１Ｊ５９“０１”２
　、ｊ、；？ｊ）０“°９２、発明の名称　免疫調整医
薬 ３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 氏　名（名称）アンスティテユリュー ４、代理人 ５、補正命令の日付　自　発 明　細　考 １、発明の名称　免疫調整医薬 ２、特許請求の範囲 ｆｌｌ　その有効成分が人のＩ’ｇＧのＦｃフラグメン
ト又はこのフラグメントの類縁物により形成され、該有
効成分がＩｇＧインタクト及び／又はＦａｂフラグメン
トを含まないか、或いは、（Ｆｃ＋Ｆａｂ＋ＩｇＧ　）
全重量に対し２重量％より多くは含まれないことを特徴
とすると共に、人のＩｇＧのＦｃフラグメントの該類縁
物は全部のＦｃフラグメントもしくはザブフラグメント
であり、またＦｃフラグメント上に存在するペプチド連
鎖を含む全部の合成又は半合成ペプチドであり、またこ
れらのフラグメント、サブフラグメント又はペプチドの
全部の誘導体であり、ただしこれらのフラグメント、サ
ブフラグメント、ペプチド又は誘導体は次の諸条件即ち
（イ）抑制細胞の分化の活性化特性をもつこと、（ＩＩ
）抗体依存細胞毒の禁止特性をもつこと、並び（ハ）Ｎ
Ｋ細胞の活性化特性をもたないことの各条件を満たすこ
とを特徴とする免疫調整医薬。

（２）　Ｆａｂフラグメント及び／又はＩｇＧインタク
トを１重量％よりも多くなく含有することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の免疫調整医薬。

（３）　Ｆａ’ｂフラグメント及び／又はＩｇＧインタ
ク１−を含まないことを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の免疫調整医薬。

（４）有効成分がＦｃフラグメントにより形成されたこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１
項記載の免疫調整医薬。

（５）特に自己免疫疾患を処置し、臓器移植を受り、ま
たか又は受けるべき疾患において拒絶反応を抑制するか
もしくはその効果を少なくすることのできる免疫調整医
薬の製造への、特許請求の範囲第１項記載の人のＩｇＧ
のＦｃフラグメント又はその類縁物の使用。

３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用可能性〕 本発明は人のイムノグロブリンＧのＦｃフラグメントを
主成分とする免疫調整ないし免疫変更医薬に関する。こ
の医薬は自己免疫疾患の処置を含む免疫機能障害の処置
において、また移植免疫禁止剤として、また臓器移植を
既に受けているかもしくはこれから受けるべき疾患の処
置において特に使用されることができる。

〔従来の技術〕

臓器特に腎臓及び髄の移植は広く行なわれている。主要
な組織適合性についての研究は進んでいるといっても、
移植された臓器の外部的細胞を生体が破壊する反応即ち
拒絶反応をさけるために免疫禁止を人為的に惹起させる
ことが必要とされている。

このような免疫防衛を禁止するために、特に完全な照射
、化学療法（アルキル化剤、プリン塩基の類縁物）、成
る種の抗生物質及び抗リンパ球血清の使用に基づいた種
々の方法が知られている。

これらの免疫禁止法には、周知のように、これらが移植
に対する生体の自然の防衛だけでなくウィルスや微生物
のような感染性病原体に対する自然の防衛をも麻ひさせ
るという不具合がある。患者はこれらの感染に対して無
防備になり、これを防ぐための強制的な対策が講じられ
なければならない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、移植された臓器に対する免疫防衛反応
を禁止し、感染に対する防衛において重要な役目をする
ことがわかっている体液性免疫の防衛反応は禁止せずに
むしろ増進させる薬剤を提供することにある。

本発明による医薬の活性成分は人のイムノグロブリンＧ
のＦｃフラグメント又はその類縁物によって形成される
。

〔問題点を解決するための手段〕

周知のように、イムノグロブリン（Ｉｇと略記される）
は、いろいろの規準に従って複数のクラス（ＩｇＧ　、
　ＩｇＭ　、Ｉｇ八、ＩｇＤ及びＩｇＥ　）に分類され
ている蛋白質である。

血清の主要なイムノグロブリンであるＩｇＧは、他のイ
ムノグロブリンと同様に、多額構造をもち、いろいろの
脱離反応（特に酵素化学的脱離反応）によって、この蛋
白質のいろいろのフラグメントが単離されている。

即ち、ＩｇＧ分子は、パパイン又はプラスミンで加水分
解した場合、３つのフラグメント即ち抗体の場所を各々
有する２つのフラグメント（Ｆａｂフラグメンｉ・と呼
ばれる）と、抗体の場所は有しないがいろいろのエフェ
クター機能を有する１つのフラグメント　（Ｆｃフラグ
メントと呼ばれる）とを生ずる。

パパイン、プラスミンなどによる酵素化学的脱離によっ
てＦｃフラグメント又は類縁のフラグメントを取得する
方法は周知であり例えばＲ，ｍ、ｐｏＲｒＥＲ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　７３．　ｐ　ｌ　１９　（１９
５９）に記載されている。

本明細書において特に反応の表示がなければＦｃフラグ
メントとは人のＩｇＧのフラグメントＦｃを表すものと
する。

Ｆｃフラグメントの薬理学的特性と、種々の免疫防衛機
構においてのその種々の役割とについては現在まで多く
のことが未だ解明されていない。動物モデルについての
研究は、他の種においての活性について結論を導出させ
えない。それは周知のようにイムノグロブリン特にＩｇ
Ｇが種によって相違することと、イムノグロブリンが異
なる種の免疫応答に異なった作用を示すこととのためで
ある。

種々のイムノグロブリンのＦｃフラグメントがラット及
び人のリンパ球の多クローン活性及び増殖応答に対し刺
激作用を抗原の存在又は不在において示すことは多くの
文献に記載されている。その反対に、マウスのリンパ球
に対して山羊のイムノグロブリンのＦｃフラグメントは
、ごくわずかな細胞分裂効果を示すにすぎないし、ウザ
ギ又はガチョウのイムノグロブリンのＦｃフラグメント
は、用量と無関係に、いかなる刺激作用も示さない（例
えば門、八、ＢＥＲＭＡＮ　ｅｔ　ａｌ＋Ｔｈｅ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏ’ｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ−ｎｔａｌ　Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ、　１４６　ｐｐ、　２４１−２５６（
１９７７）及びＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ＋１２２．８９−９６　（１９７９）参
照）。

人のミニロームのＦｃフラグメントが混合リンパ球反応
においてマウスのリンパ球の増殖の促進ないしは増大を
誘発することも知られている（例えばＥ、　Ｌ、　ＭＯ
ＲＧＡＮほか、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１５３　、　ｐ
ｐ１１６１−１１７２　（１９８１）参照）。

人のＩｇＧ及びＦｃフラグメントが（ＩｇＧインタクト
（即ちＩｇＧそのもの）と同様に〕抗体依存細胞性細胞
毒禁止効果をもつことも知られている（例えばＷｉｓｌ
ｎｆｆ　ｅｔ　ａｌ、５ｃａｎｄ、Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、＋　３　、　ｐｐ２９−３８　（１９７４）参
照）。

成る種の免疫反応に関与する人のＮＫ（ナチュラル・キ
ラー）細胞はＩｇＧのＦｃフラグメントの受容体（レセ
プター）をもつが、ＮＫ細胞の細胞毒活性はこの受容体
と調和しない、ということも知られている（Ｍ、Ｅ、Ｎ
ｅｖｉｌｌｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、＋１２５’、ｐ、２６０４　（，１９８０）参照）。

免疫防衛機構の複雑さと免疫調節現象の多様性とに留意
して、免疫変更薬剤のような活性物質の使用は、免疫学
の分野の実際の知識に基づいて、体液性及び細胞性のい
ろいろの免疫反応、特に細胞毒性細胞及び抑制細胞の活
性化及び禁止に対する活性物質の活性全体を突きとめた
後にしか試みえないことを知るべきである。この突きと
めは同種のモデルについて行なうべきであり、さもない
と前述した理由により医薬としての最低の活性も実用化
できなくなる。

同種のモデルに対する人のＩｇＧのＦｃフラグメントの
性質の研究により、このフラグメントを免疫変更薬剤と
して利用し、特に自己免疫疾患を処置したり、臓器移植
の際の拒絶反応を防ぎ、またはその効果を低減させるこ
とを可能とする有用な薬理学的性質が見出された。

リンパ球の増殖応答を刺激する人のＩｇＧのＦｃフラグ
メントは１次同種反応（ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａ−ｔｉｖｅ　ｐｒｉｍａｉｒｅ　）に対しては
作用しない。その反対に、Ｆａｂフラグメント及びＩｇ
Ｇインタクトは１次同種反応に禁止作用を示し、増殖応
答には作用しない。

人のＩｇＧのＦｃフラグメントは、Ｆａｂフラグメント
及びＩｇＧインタクトと同様に、抗原の存在下に、リン
パ球応答に刺激作用も禁止作用も示さない。

人のＩｇＧのＦｃフラグメントは１次混合リンパ球反応
（ＣＭＬＩ）において細胞毒性細胞の発生現象を禁止せ
ず、また誘発もしない。しかしＦｃフラグメントが、Ｉ
ｇＧインタクト及びＦａｂフラグメントと同様に、２次
混合リンパ球反応（ＣＭＬＩＩ）において細胞毒の禁止
活性をもつことが見出されている。

この最後に述べた性質が見出されたことにより、抑制細
胞の刺激ないしは増殖に対してＰｃフラグメントが有し
うる影響を研究することになった。以下にこの明細書の
実験部分に示される研究は、人のＩｇＧのＰｃフラグメ
ントが、抑制リンパ球の発達を促進する活性並びに予備
抑制細胞の刺激を助長する活性をもつことを示している
。

最後に、細胞分裂型反応においての全イムノグロブリン
の産生に対するＦｃフラグメントの影響の研究により、
全イムノグロブリンの産生は増大し、Ｆａｂは不活性で
あり、ＩｇＧインタクトは、逆に、全イムノグロブリン
の産生の禁止をもたらすことが示された（八、Ｄｕｒａ
ｎｄｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、＋
６７、ｐｐ８６７−８７７．１９８１年３月）。

なお、抗体依存細胞毒活性（ＡＤＣＣ）の禁止と抑制細
胞の分化とについて、検討中の物質の用量に比例した効
果が認められている。これはＦｃフラグメントがＴリン
パ球小個体群の成るものに直接作用することを考えさせ
る。

従って、人のＩｇＧのＦｃフラグメントのこれらの特性
は体液性免疫を助長しつつ細胞性免疫を禁止し、従って
臓器移植を受ける疾患、免疫機能障害を伴う疾患並びに
特に自己免疫疾患の処置に有利に使用しうる免疫調節薬
剤として、該フラグメントを用いることを可能にする。

本発明による薬剤は、その有効成分が、ＩｇＧインタク
トのＦｃフラグメント及び／又はＦａｂフラグメントに
より形成され、これらを（Ｆｃ＋Ｆａｂ＋ＩｇＧ）全重
量に対し２重量％より、特に１重量％より、多くは含ま
ないこととを特徴とする特 なお、本明細書において「人のＩｇＧのＦｃフラグメン
トの類縁物」とはＰｃフラグメントもしくはサブフラグ
メントであり、またＦｃフラグメント上に存在するペプ
チド連鎖を含む合成又は半合成ペプチドであり、またこ
れらのフラグメント、サブフラグメント又はペプチドの
誘導体であり、ただしこれらのフラグメント、サブフラ
グメント、ペプチド又は誘導体は次の条件、即ち （イ）抑制細胞の分化の活性化特性をもつこと、（ＩＩ
）抗体依存細胞毒の禁止特性をもつこと、並びに （ハ）ＮＫ細胞の活性化特性をもたないことを満たすも
のとする。

本発明による薬剤はこれを経口的にまたは静脈内に又は
筋肉内に投与することができる。本発明による薬剤はそ
のためにカプセル、ゼラチン袋、糖衣錠、注射液又は注
射用凍結乾燥粉末の形態とされてよい。

経口投与の場合、胃の障害を通過しうるように耐酸性の
錠皮に包んだ薬剤形式とする。

臓器移植の場合、本発明による医薬の投与は移植の前後
に医療により使用される免疫低減技術に従って種々の形
態で行なわれることができる。

本発明による医薬は、移植の免疫低減を惹起させるため
に、臓器移植前に、又はその後に、他の免疫抑制医薬に
続いて、又はそれと共に投与されてよいが、本発明によ
る医薬の免疫変更効果は一般に６〜１０日後にしか生じ
ないことに配慮すべきである。

用量は特に投与形態と処置相とに依存し、一般に成人の
場合に有効成分は１日ＩＴｎｇ〜１ｏｇの範囲にある。

例えば静注の場合Ｆｃフラグメントの用量は成人１日当
りＩｇ”ｌＯｇである。

を抑制するか又はその効果を少くすることのできる免疫
変更医薬を製造するために、人のＩｇＧのフラグメント
Ｆｃ又はその類縁物を使用することをも対象とする。こ
の使用は特に通常の方法に従って医薬としての適切な形
態とすることに関係している。

本発明による医薬はもちろん他の免疫低減剤又はコルチ
コイドと併用して差支えない。

以下の例はもちろん本発明を限定するものではない。

本明細書に使用する略記法の意味は次の通りである。

ＡＤＣＣ・・・抗体依存性細胞性細胞毒。

ＢＡＳ　・・・ウシの血清アルブミン。

ＣＭＬ　、、、リンパ球性細胞毒（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
ｉ　ｔｅ’ａ　ｍｊｄｉａｔｉｏｎ　Ｉｙｍｐｈｏｃｙ
ｔａｉｒｅ　）。

Ｆ（ａｂ’）ｚ・・・ペプシンでＩｇＧを脱離して得た
フラグメント。

ＧＲＰ　・・・ヒナ鳥の赤血球。

Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ　ＤＲ−・・ＨＬ　Ａ系の”Ｄ−関
連”決定要因。

肛Ａ　Ｄｒ、ＩＩＬＡ　Ａ、Ｂ、ＩＩＬＡ　Ｄ・・・人
の白血球の組織適合系の抗体決定要因。

Ｉｇ　・・・　イムノグロブリン。

ＭＬＲ・・・混合リンパ球反応。

ＰＢＳ・・・　リン酸塩緩衝液。

ＰＨＡ−Ｍ・・・植物性血球凝集素。

ＰＷＭ　１・ｐｏｋｅ　１ｙｅｅｄ　ｍｉｔｏｇｅｎ　
（ヤマゴボウの細胞分裂誘発因子。

ＳＶＦ　・・・ウシ胎児血清。

５ｒＡＢ　・・・ＡＢ血清。

以下の実施例においてＦｃとＦａｂのフラグメントの分
離は（硫酸アンモニウムによる）塩析、次いでコラムに
よる分子フルイ　（ゲル濾過）とによって遂行された。

大施桝土 人のイムノグロブリンのＦｃフラグメントの薬理学的性
質の研究。

■・・・リンパ球増殖の　究 ＩｇＧのＦｃ及びＦａｂフラグメント及びＩｇＧのリン
パ球増殖活性の研究。

Ｂ１５ｙｕｍ　Ａ、（Ｓｃａｎｄ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａ
ｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、５ｕｐｐｌ。

９７、　１９６８．　２１．　ｐ　１）の技術に従って
、フイコールーラジオセレクタンの勾配（ｄ：１０７７
）で、６０人の自発的な血液供与者の末梢静脈のリンパ
球を採取した。

ｂ、マクロファージ富化リンパ球個体群の取得前記のよ
うにして得たリンパ球個体群からウルマー及びフラッド
の方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓロ９７９．３０　ｐ、１）に従って、ベ
ルコールの勾配（ｄ：１０６４’）で、単核白血球を分
離した。

Ｃ０粘着細胞のなくなったリンパ球の取得前項（ａｌに
従って取得したリンパ球個体群を（ファルコン型）のフ
ラスコ内で１時間３７℃で培養した。非粘着細胞は回収
した。

これらの３形式（ａ’、ｂ、ｃ）の細胞個体群を一２６
０℃で保存し、試験の際にばらばらにした。

ｄ、ペルオキシダーゼ反応 各個体についてＩ塗抹標本当り全４００細胞の数で、Ｓ
　Ａ　Ｔ　Ｏ（Ｔｒａｆｔｅ　ｄｅ　ｂｉｏＩｏｇｉｅ
ａｐｐｌｉｑｕ４ｅ　、　１９６４．　ｖｏｌ、　３．
　ｐ　９５）によって組合されたペルオキシダーゼ反応
に従って、各々のリンパ球個体群内の単核白血球の百分
比を定めた。

２、Ｆｃ−Ｆａｂ　びｆＧフラグメントプラスミンで処
置した人の血簗Ｉ　ｇ　Ｇを出発物質として、既知の方
法に従って、いろいろのザブフラグメントを作製した。

ＩｇＧ（ＰＲＧ　）はｒ１型（３０％）とｒｚ型（７０
％）とである。

ＦａｂはＦｃ４．１％で汚染されているがＦｃは純粋で
ある。

３、培養 ａ、脱補体自己類縁血清（ｓｅｒｕｍ　ａｕｔｏｌｏｇ
ｕｅｄ４ｃｏｍｐ１４ｍｅｎｔｅ′）　２０％を加えた
ＲＰＭＩで、丸底のマイクロプレート（微小板ン上（板
１枚当り９６カフプ）で、リンパ球の変性試験を行なっ
た。

各々のカンプに、ＲＰＭＪで希釈したＦｃ、Ｆａｂ　、
　ＩｇＧ又はＰ　ＷＭ　（Ｇｉｂｃｏ　）　５０　ＩＩ
　Ａと自己類縁血清ＲＰＭＩ　（２０％）１５０．Ｚｊ
ｍＡとの下に、細胞２００，０００個を分散させた。

各フラグメントの各々の希釈物を３　Ｍｉ作成して試験
した。

ｂ、培養。空気９５％についてＣＯ□　５％の雰囲気中
において、水分を飽和させた３７℃の培養器内で漱小板
を６日間培養した。

ｃ、）リチウム処理されたチミジンによる標識。

トリチウム処理されたチミジン１マイクロキユリーを１
４４時間目に各々のビットに加えた。＋４°Ｃに冷却す
ることにより、１６〜」８時間後に、合併を中止した。

ｄ、ヘータ計数器により、シンチレーション溶液の助け
を借りて、ヌカ１〜ロン上に沈殿させて回収した細胞を
計数した。

結果 試験した６０個の個体のうち４３．４％は高応答（≧１
０．０００ｃｐｍ　）　、１８．３％は低応答（＜　１
０．　ＯＯＯｃｐｍ　）　、３８．３％は無応答（−≦
−２，ＯＯＯｃｐｍ　）であった。

高応答又は低応答の基準ば、フラグメントＦｃ（表Ｉ）
の場合、細胞培養についての増殖応答に従って設定され
た。

正のペルオキシダーゼ細胞の百分比は３つの群について
３２％であり、粘着細胞のなくなったリンパ球個体率の
場合は、１〜２％であった。

Ｆｃ、　Ｆａｂ　及びＩｇＧのフラグメントについては
、１培地当り６．１２μｇ及び２４μｇにおいて試験し
た。５０及び１００μｇの場合には先行する群（Ｄ、−
Ｎ−３）について目立った差異を与えない。

結果は表１に示す通りである。

耀−翰 Ｆａｂ又は全ＩｇＧに比べてリンパ球増殖応答において
フラグメントＦｃが刺激作用を示すことと、この活性に
とって必要なマクロファージの存在することとがこの試
験により明らかになった。この結果は、最大増殖応答が
１培地当り１０μｇ、５日間であるマウスのリンパ球に
ついてウェイグル（１＋Ｉｅｉｇｌｅ）の研究に近いも
のである。同様に、粘着細胞がなくなることは、マウス
のリンパ球の増殖応答の不在を惹起させる（Ｊ、Ｅｘｐ
、Ｍｅｄ、　１９７９　。

１５０、ｐ、２５６）。

■　同種リンパ球　の研究 １次同種増殖応答においてのＩｇＧのＦｃ及びＦａｂフ
ラグメント並びにＩｇＧインタクトの助長又は禁止活性
の研究。

凰礼料及び力抜 種々のフラグメントの取得と単核白血球及びリンパ球の
分離技術については以上に説明した。

Ｔリンパ球の取得 Ｍ、ユリウスはかの方法（Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ。

１９７３、　３．　ｐ、６４５）に従って、ナイロンウ
ールのカラム上でＴリンパ球の分離を行なった。

１０ｍ１の注射器（シリンジ）中において、ナイロンウ
ール０．６ｇと共に、３７℃で３０分間リンパ球４Ｘ１
０７個を培養した。

非粘着細胞を回収した。ペルオキシダーゼ及びロセソト
Ｅの発色の制御を、リンパ球審化を確めるために行なっ
た。

これらの細胞を混合培地の応答細胞として利用した。

種々の１ｇフラグメントの子在下においてのリン乙生ｑ
穐ｌへヒト附旧しバ蛙」」」−工」興）単核白血球富化
（Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ６／ｍＡ）されたリンパ球をトーマン
・マリリンの方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　。

１９８２）に従って、Ｆｃ、、　Ｐａｂ又はＩｇ６０μ
ｇと共にＲＰＭＩ　１６４０−２０％　５ｒＡＢ媒質中
で２４時間３７°Ｃで培養した。２４時間後に上清を遠
心分離によって回収した。

リンパ球の混合培養 応答細胞（非粘着細胞）を計数し、ｌＸｌ０６／ｍ７！
の濃度に調節した。！ｌＩ激細胞（全リンパ球又は単核
白血球富化リンパ球の全個体）を１ｍβ及び細胞数ｌＸ
ｌ０’個当りマイトマイシン０２５μｇで（ＢＡＣＨ，
５ｃｉｅｎｃｅ　、　１９６６．ｖｏｌ。

１５３、ｐ５４５の方法により）３０分間３７℃で処理
した。

処理後に細胞をＲＰＭＩ　１０％　５ｒＡＢで２回洗浄
した。細胞の懸濁体をｌＸｌ０６／ｍＡ、１２Ｘ１０’
　／ｍＥ、６ｘｌ　Ｏ’　／ｍβ及び３Ｘ１０’／ｍＩ
ｌの異なった濃度に調節した。

ハミルトン注射器を用いて、円錐底の微小坂内で、応答
細胞０．０５ｍ！、刺激細胞０．０５ｍｊ！、ＲＰＭＩ
　０．０５ｍＡ、２０％　５ｒＡＢの割合で刺激細胞及
び応答細胞を分布させた。

３７℃−５％ＣＯ□の培養室で５日間微小板を用いて培
養した。９６時間目に１カップ当り２μＣｕのトリチウ
ム処理されたチミジンを１８時間かけて加えた。スカト
ロン型マイクロ沈殿器を用いてフロー濾過器上で沈殿さ
せることにより培養物を回収した。各々の濾過器を乾燥
後にプラスチック管に入れた。シンチレーション溶液３
ｍ７！を容管に加えた後、液体シンチレーションカウン
ターで計数を行なった。結果を１分間打点数（ｃｐｍ　
）で表わす。

結果 いろいろの濃度のＭＬＲとＦｃ、　Ｆａｂ及びＩｇいろ
いろの濃度のいろいろのフラグメント１？Ｃ３Ｆａｂ及
びＩｇをＭＬＲＩに添加した。

いろいろの濃度（１２，２５，５０及び１００μｇ／培
地）のフラグメントＦｃは、ＲＰＭＩに比べて、ＭＬＲ
Ｉの助長作用又は禁止作用を示さなかった。

その反対に、１００μｇ／培地の濃度のＦａｂフラグメ
ントはＭＬＲＩの禁止を示した。５０及び１００μｇの
濃度のＩｇＧはＭＬＲＴの禁止を起した。

この方法は増殖応答の準最適条件において種々のフラグ
メントの作用を発現させるために行なわれた。ＲＰＭＩ
に比べて顕著な差異はみられなかった。５０μｇの濃度
までのＩｇＧのみはＭＬＲＩの禁止を与えた。

フラグメントＦｃの誘発によるＴリンパ球の活性化が、
マクロファージを介して行なわれるため、準最適培養条
件を保って、最も好都合の培養条件にあるように努めて
培養を行なった。試験されたいかなる用量においても、
補助ないし助長効果は認められなかった。禁止効果は１
培養物当り２４μｇのＩｇＧについて認められた。

増殖応答は刺激細胞と応答細胞との間の接触後何時間か
して開始され、マクロファージに対するサブフラグメン
トＰｃの産生は最初の２４時間内に行なわれるので、種
々のフラグメントと共に２４時間３７℃で培養した単核
白血球富化リンパ球由来上清をＭＬＲに添加した。

これらの上清は応答細胞の自己類縁性細胞から調製され
、最適及び準最適の増殖条件の下にＭＬＲＩ内において
試験された。

Ｆｃ、　Ｐａｂフラグメント又はｆｇについて、いかな
る禁止効果も助長効果も認められなかった。

葭」龜 １次回種リンパ球反応において、細胞５Ｘ１０’個当り
６、Ｉ２．２４．５０及び１００μｇの濃度で、人のリ
ンパ球に対して、フラグメントＦｃではいかなる顕著な
助長又は禁止活性も認められなかった。使用した用量の
選定は、Ｔリンパ球に対するフラグメントＦｃの増殖作
用が発現された時に定められた（前掲プロトコールＩ）
。

その反対に、全イムノグロブリンとフラグメントＦａｂ
とは、試験された全部のモデルにおいて、１次回種応答
の抑制を与える。

細胞毒性のいろいろの形式に対するＦｃ、　Ｆａｂ各フ
ラグメント及びＩｇＧの活性の研究。

凰拝料及び方迭 ボランティアの供与者の末梢血管リンパ球の分離及び種
々のフラグメントの取得については前述した通りである
。

匙エエ畦」Ｃε１辷 プラスミンで消化されたガンマ胎ｍ ＩｇＧザブクラス：ＩｇＧ１＝５７％ ＩｇＧ２＝３９％ ＩｇＧ３＝０．２％ ＩｇＧ　４＝　３．７％ 抗　依存性細胞性細胞毒（Ａ　Ｄ　ＣＣ）使用される方
法はＦ、ＷＩ　ＳＬｇＦＦ、Ｔ、Ｅ。

ＭＩＣＨＡＥＬＳＯＮ、Ｓ、Ｓ、ＥＲｍＬＡＮＤ。

５ｃａｎ−ｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、３．　ｐｐ
２９−３８．１９７４）に記載されている。

標的細胞は、ウサギの抗−ＧＲＰのＩｇＧで感作されク
ロム５１で標識されたＧＲＰである。

試験ＡＤＣＣ エフェクター細胞（末梢血管のリンパ球）は計数され、
５Ｘ１０６／ｍｎ　ＲＰＭＩＩＯ％ＳＶＦの濃度に調節
された。

ハミルトン注射器を用いて３組の異なる濃度の被検生成
物５０μｇエフェクター細胞１００μβを丸底倣小板内
に分布させた。

２０分間３７℃で培養した後、感作され標識されたＧＲ
Ｐ５０μｌを分布させ、ｌ標的細胞に対するエフェクタ
ー細胞５０個の最終比（５０：１）とした。

自然塩析（ｌａｒｇａｇｅ　５ｐｏｎｔａｎｅ）　Ｌよ
、ＲＰＭ１１０％ＳＶＦの媒質の使用下にＧＲＰを培養
してこれを定め、最大塩析は、ＩＮ塩酸をＧＲＰに添加
してこれを定めた。抗血清活性の参照として、正常なウ
サギの血清で予め培養したＧＲＰと向い合いにエフェク
ター細胞をおいた。

湿めった雰囲気中で５％ＣＯ□下に１８時間３７℃で培
養した後、微小板を８０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離に
かけ、バンファフィルター（Ｆｌｏｉｙ、　ｒｅｆ　。

７Ｂ−２１−００５）上に上清を回収した。

細胞毒性「ナチュラル・キラーＪ　（ＮＫ）使用された
方法はＢ、Ｍ、ＶＯ５Ｅ、ＦＪＩＡＮＫＹ、Ｓ、ＡＲＧ
ＯＶ及びＥ、ＫＬＥＩＮ　、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、’、１９７７　、　１　、　ｆｌｐ７５３−７５
７に記載されている。

標的細胞は、クロム５１で標識された細胞に５６２　（
人のリニエ・ミニロイド〔骨髄菌株〕）である。

ＮＫ試験 エフェクター細胞（末梢血管のリンパ球）を５Ｘ１０６
／ｍＡ、２．５　Ｘ　１０６／ｍｊ２．１．２　Ｘ　１
０６／ｍＪ及び６Ｘ１０ｓ／ｍｊ２の濃度に調節した。

これらの分布及び処理はＡＤＣＣの場合と回し方法に従
って行なわれた。標的細胞を５０μβ中に分散させ、■
標的細胞に対するエフェクター細胞数５０の最終比とし
た（５０：１．２５：１．１２：１及び６：１）。自然
塩析と最大塩析並びに上清の回収はＡＤＣＣ試験の場合
と同一の条件下に行なわれた。

この研究はＬ　ＩＧＨＴＢＯＤＹ　’ｅｔ　ａｌ、Ｇｅ
ｎ。

Ｂａｃｔ、Ｖｉｒｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　１９７１
　、　Ｖｏｌ、　６４　＋　ｐ２４３に従って行なわれ
る。

エフェクター細胞 同質感作相は、前述したものと同様の混合培養に対応す
る（前記（ｎ）参照）。

２つの試験において感作は、応答細胞と刺激細胞とのＨ
ＬＡ　Ａ、ＨＬＡ　Ｂの間の差を勘案して、単−Ｈａｐ
ｌｏｔｙｐｅ叶に対して行なわれた。

退負桓凶 ２つの試験において、それぞれのＭＬＲＯ感作に用いた
刺激細胞を標的細胞として使用した。

Ｐ　ＨＡ　−Ｍ　（Ｇｉｂｃｏ　）により７２時間感作
されたこれらの細胞は、１ｏ・１０６個の細胞について
２００．４Ａの割合で、試験の前に１８時間クロム５１
で標識された。

連続洗浄後に細胞をブルートリパン（ｂｌｅｕｔｒＶｐ
ａｎ　）を用いて計数し、２００−！０３／ｍβに調節
する。次にＣＭＬ試験を丸底微小板内において行なう。

前述したように処理した１００μβ中エフエククー細胞
を、湿めった雰囲気内で、５％ＣＯ□の下に３７℃で４
時間標的細胞５０μｐと共に培養し、ＣＭＬＩの場合に
は５ｏ：１、ＣＭＬＩＩ（７）場合には５ｏ：１．２５
：１、Ｉ２；１及び６：ｌの比とする。自然塩析、最大
塩析及び上清の回収を前記の条件の下に行なう。４つの
細胞毒性試験において、クロム５１の塩析を２分間ガン
マ計数器により測定した。測定結果は次式に従って、細
胞毒の百分比として表わした。

１０％より高い細胞毒性はこれを全て正価とした。

抗体依存細胞毒のＦｃフラグメント及びＩｇにおいての
禁止は全部の被検個体について認められた。

この禁止はＦｃフラグメント又はＩｇＧの濃度に比例し
て増大する１表２）。

キラー活性の禁止は、Ｆｃフラグメントの場合、ＩｇＧ
に比べて常に強く現出される。即ちＦｃ６μｇはＩｇ５
０μｇと同等の禁止を示す。

その反対にＦａｂフラグメントについては、用量を非常
に高くしても、いかなる抑制効果も発現されない。

「ナチュラル・キラー」活性 Ｆｃ　−Ｆａｂフラグメント又はｒｇにおいては、用量
を非常に高くしてもＮＫ活性の抑制は全く認められなか
った。この結果を確かめるために２つの極限用量（６μ
ｇと１００μｇ）を用いて、エフェクター細胞−標的細
胞の異なった比においてＮＫ活性を試験した。どんな用
量及び比においてもいかなる顕著な差異を認められなか
った。（表３）。

１′　び２゛　胞　細胞− ＣＭＬＩは、いろいろの用量において試験されたＩｇＧ
及びＦｃ、　Ｆａｂフラグメン１−の作用により変更さ
れなかった。

その反対にＣＭＬｌｌは２５．５ｏ、１００／Ｊｇの用
量でＦｃ及びＦａｂの各フラグメントによって禁止され
た。ＩｇＧは使用した全部の用量において顕著な禁止を
示した（表４）。

目　的 予備抑制細胞の分化における同質増殖応答の抑制Ｔ細胞
に対するＰｃ、　Ｆａｂフラグメント及びＩｇの活性の
研究。

凰財料反更方抜 自発的な供与者の末梢血管のリンパ球の分離法及びいろ
いろのフラグメントの取得については前述した通りであ
る。

プラスミンで消化されたガムマ胎盤：ＡＧＡ４４ゲル濾
過において利用されたフラグメントの純度：Ｆｃ：１０
０％、Ｆａｂ：９４．６％、（５，４％７３）　、Ｉｇ
　（ＰＲＧ）７Ｓ　：　９５．４％　ＩＯ３：２．８％
　ＩＯ３：１．８％、ＩｇＧ１：５７％、１ｇＧ２：３
９％、ＩｇＧ　３　：　０．２％、ＩｇＧ　４　：　３
．７％。

従来の、または変更された血清学的方法及びリンパ毒性
によって、ＨＬＡ−Ｄｒ複合体の主な決定因について、
血液の自発供与者を研究した（Ｂ細胞富化リンパ球懸濁
体）。

貝腫盪且’　Ｍ’、　Ｊ、　５ＨＥＩＥＮＹ　、　Ｆ、
　Ｉｌ、　ＢＡＣＩＩ　。

Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　＋　１　９　７　６
　、８　、　ｐｐ１５７−７１ 試験管内の同種感作のために、刺激剤として用いられた
ＡｇＨＬＡ−Ｄｒ　（２５＃ｇ／　１０ｂｔ＋ｔ）ｌ胞
／＋ｎ］）に対して不調和のマイトマイシン処置同種細
胞１０・１０１６個と、応答体として用いたリンパ球１
０・１０″個とを共存させる。１０日間５％ＣＯ□の存
在下に３７℃で加湿培養室内で血清ＡＢプール１０％を
添加したＲＰＭＦ１６４０の媒質２０ｍ１と共に、７７
／Ｌ／Ｊ７びん（ＣＡ３０１３）内において培養を行な
う。

抑制試験　（Ｊ、　ＤＡＵＳＳＥＴ　、　Ｎａｔｕｒｅ
　、１９７８．２６７　ｐｐ、５０２） ３つの細胞個体群、即ち応答リン７マ球、マイトマイシ
ン処置刺激細胞及びマイトマイシン処置同種感作化細胞
（これらの細胞は応答細胞に対し自己類縁性である）を
存在させて、ＭＬＲＩ内において、同種感作化リンパ球
の抑制活性を試験管内で評価する。

液体シンナレーションカウンターを用いて計数を行なう
。

抑制率は次式によって評価する。

予備抑制細胞の刺激作用を証明するために２つの異なる
モデルについて試験を行なった。

第１のモデルは、別々のＦｃ、Ｆａｂフラグメント又は
ＩｇＧについて末梢血液の全リンパ球を１時間予備培養
することである。これらの細胞を数回洗浄した後にマイ
トマイシン処置し、第３の細胞として前記条件の下にＭ
ＬＲＩ中においた。参照群はＲＰＭＩで予備培養したも
のであった。

第２のプロトコールにより、抑制細胞の発達に対し時に
助長作用が見られることが実証された。

同種感作期において、０日（試験当初）に、いろいろの
用量でＦｃ５Ｆａｂフラグメント及びＩｇＧを添加した
。１０日間の感作後にこれらの細胞を前記の条件の下に
ＭＬＲＩに第３細胞として添加する。

最後に、抑制細胞に対するこれらのフラグメントの活性
を記述するために、３種類の細胞に対する試験にＦｃ　
、Ｆａｂ、Ｉｇをいろいろの用量で添加した。

結果（表５） 抑制試験の際に洗浄及びマイトマイシン処置前に、いろ
いろの用量のＦｃ　、Ｆａｂフラグメント又はＩｇを感
作細胞と共に１時間培養した。

Ｆｃフラグメントと共に予め培養した細胞は、使用した
Ｆｃの用量に比例したＭＬＲＩの禁止の増大を与える。

この増大は１５μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌの用量に
ついて顕著である。１５μ８の用量で１ｇの存在下に予
備培養した細胞についてはＭＬＲの顕著な禁止が見られ
る。

その反対に、Ｆａｂフラグメントと共に予備培養した細
胞は同種応答の顕著な禁止を示さない。

２、　同種感作中のＦｃ　、　Ｆａｂ、Ｔ　ｇＧの活主
同種感作の第０日に、異なった用量のＦｃ、Ｆａｂフラ
グメント及びＩｇＧインタクトを添加した。

フラグメントＦｃの存在下に感作した抑制細胞は、１培
地当り１．５μｇにおいても、１００μｇにおいても、
対照細胞に比べて非常に顕著なＭＬＲＩ禁止活性を示す
。他方では、１ｇインタクトと共に培養した細胞は、３
μｇよりも高し・用量において、ＭＬＲＩの禁止の顕著
な増大を示す。

その反対にフラグメントＦａｂの存在下に感作した細胞
はいかなる顕著な差異も示さない。

抑制比が非常に高くなった場合には、それにより増大の
評価が困難になる。補助的な実験を行なった。応答細胞
／抑制細胞比が１：１．２：１．４；１になるように、
異なる濃度で、同種感作されマイトマイシン処理された
細胞を添加した。この場合に、Ｆｃフラグメントの存在
下に感作された細胞に対する８：１の希釈において抑制
活性の顕著な増大が見られる。

試験に際して３種類の細胞のＭＬＲＩに異なる用量のフ
ラグメン）Ｆｃ、Ｆａｂ及びＩｇを導入した。助長活性
も禁止活性も認められなかった。

結論 ２次応答の間に発達した抑制細胞の存在の最初の表示は
、同一の同種抗原に対し２同感作された細胞が、１同感
作の場合よりも少い増殖応答を与えることの観察に由来
し、活性過程の証明は照射同種感作細胞を従来の１次Ｍ
ＬＲに添加することによってもたらされた。

抑制細胞は、刺激細胞により供与されたＨＬＡ−Ｄｒ抗
原に対し特異性を示す。ｌＯ日日間培養の後に、同種感
作細胞の９５％がロセソトＥを形成し、３％以下が表面
■ｇＧを有し、２％以下が単核白血球を有するので、抑
制細胞はＴリン）＜球として現出される。試験管内の同
種過多免疫（ｈｙｐｅｒ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　
ａｌｌｏｇｅｎｉｑｕｅ）　Ｉｒこより惹起される抑制
機構は、腎臓移植前に行なわれる多量輸液過程に非常に
近いように思われ、これ番ま０ｐｅｌｚ　ｅｔ　Ｔｅｒ
ｏｓｋｉ　（Ｔｒａｎｓ　ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　、　
１９８０、主１、ｐ　１５３）に示されるように、移植
腎臓の生存率を改善させる。

以上に述べた実験の目的は抑制細胞に対する直接活性と
予備抑制リンパ球の発達におし）てのＦｃ。

Ｆａｂフラグメント及びＩｇＧの活性とを証明すること
にあった。

自発的供与者の末梢血液のリンパ球分離方法及びいろい
ろの小個体群の取得、例えばいろいろのフラグメントの
取得。上記参照。プラスミンで消化されたガンマ胎盤＝
　（純度及び特性については上記参照）。

２、抗血清のヨード１２５による標識 山羊のＦ（ａｂ’）２から人の抗全Ｉｇ（カッペル・ラ
ボラトリーズ）をヨード１２５　Ｓ４で標識する。

次に、過剰なヨードと標識Ｆ　（ａｂ’）　２との混合
物を５ｅｐｈａｄｅχＧ５０カラムの中に入れる。リン
酸塩緩衝液０．５　Ｍ　ｐｌ（７，５の標識の結果によ
れば、第１のピークはＦ　（ａｂ’）　２　（分子量５
０，０００）に対応し、第２のピークは８〜１０ｍ１の
容積に対応する。プロティン支持としてガムマグロブリ
ンのない馬の血清１％（最終）を添加する。

標識効率を次式により計算する。

比活性を次式によりＮ］算する。

互換性カップに人の抗１ｇ山羊Ｆ　（ａｂ’）　２を＋
４℃で一夜中吸収させた後に１時間３７℃でＰＢＳ＋５
％ＢＳＡをこれらのカップに吸入し飽和させる。

Ａ、翻遍Ｉ痕り１獲 標準ガムマグロブリンの希釈： 濃度６０μｇ／ｍｌの胎盤ガムマグロブリンを用いた。

ＰＳＢ、０．５％ＢＳＡ及び０゜０５Ｔｗｅｅｎ２０で
この溶液の’Ａｚ’Ａを続けて１０回希釈する。

被検物の希釈： ６０、ｃｏｇ／ｍｌの割合で、Ｆｃ　、Ｆａｂ、Ｉｇ又
はＲＰＭＩの存在下に、１０％ＳＶＦプラスＲＰＭ１１
・１０６／ｍｌと共に、末梢血液の細胞、非粘着細胞及
びマクロファージ富化細胞を６日間培養し、遠心分離後
に上清を年収する。

次にこれらを１１５、ｌ／２５．１／１２５としてＰＳ
Ｂ、０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に
おいて使用する。

生成物の各々の希釈の分配は、３コピーで１カップ当り
１００μβの割合とする。

これらを２時間３７℃で培養し、何回が洗浄する。

各々のカップに標識希釈Ｆ　（ａｂ’）　２　（１００
μｌ）を分配する。２時間３７℃で培養した後にＰ　Ｂ
　Ｓ　Ｔｗｅｅｎで何回が洗浄する。これに続いて各カ
ップを完全に吸引する。ガムマカウンターで計数する。

Ｃ０上清中の１ｇ量の決定 ｃｐｍ真＝ｃｐｍ（Ｆ’　Ｃ”　（司ノンパ＋ＲＭＰ　
Ｉ血清）−ｃｐｍ（Ｆ　ｃ　十ＲＭ　Ｐ　Ｉ血清）＊Ｆ
ｃ、Ｆａｂ又はＩｇ 次に標準の関数として曲線の回帰（ｒｅ’　ｇｒｅｓｓ
ｉｏｎ）の研究によりこれらのｃｐｍを分析する。

結果　び結論（表６） Ｆｃフラグメントの存在下のいろいろのリンパ球小個体
群からの全イムノグロブリンの産生はＦａｂフラグメン
トを用いる場合よりも相当に大きくなることが示されて
いる。

その反対に、ＩｇＧば、ＩｇＧの自然産生の場合に比べ
て、全１ｇＧの産生を刺激するというよりもむしろ禁止
するようである。

ＲＩＡ技術にイムノグロブリン及びサブフラグメントを
導入することは、比較可能な結果を得るために細胞なし
に５日間上清について平行チェックを行なう必要をもた
らす。

この方法は、Ｆ″Ｃで刺激されたリンパ球からＩｇＧが
試験管内で産生されることを証明する助りになる。

爽也：医薬組成物の製造 ０ＮＣＬＩＥＹ　Ｊ、　Ｌ、及びｃｏｌｌ、　Ｊ、　Ａ
ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、。

１９４９、↑上、ｐ５４１の技術に従って精製され、Ｐ
ＬＡＮ　Ｒ，及びＭＡＫＬＩＬＡ　Ｍ、　Ｆ、＋　Ｖｏ
ｘ　Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ。

１９７５、Ｖｏｌ、２Ｂ、１）Ｉ）１５７−１７５の技
術に従って人Ｑ血脩で処理した人のＩｇＧからフラグメ
ン）Ｆｃを作製する。これらのＩｇＧは、胎盤から抽出
又は静脈から採取した血液に由来する。

Ｆｃ　ａｐｙｒｏｇｉｎｅフラグメント溶液を無菌に濾
過し、１つのフラスコについて活性成分ないし存効成分
２．５ｇの割合に分散させ、凍結乾燥する。

使用時には溶液を注射可能な調製物のために用いる水で
再構成する。

手続補正帯（方式） 特許庁長官　志　賀　学　殿 ２、発明の名称　免疫ｍ整医薬 ３、　？ｉｌｉ止をする者 事件との関係　出　願　人 氏　名（名称）アンスティテユ　ノリュー４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／）その有効成分が人のＩｇＧのＦｃ　フラグメント又
   はこのフラグメントの類縁物にょ勺形成され１、該有効
   成分がＩｇＧインタクト及び／又はＦａｂフ２グメント
   を含まないか、或いは、 （Ｆｃ＋Ｆａｂ＋ＩｇＧ）全重量に対ｔ、、、：ｉｔ＊
   よシ多くは含まないことを特徴とすると共に、人のＩＩ
   ＪＧのＦｃフラグメントの該類縁物は全部のＦｃ　フラ
   グメントもしくはサブフラグメントであり、またＦｃフ
   ラグメント上に存在するベグチド連鎖を含む全部の合成
   又は半合成ペグチドであシ、またこれらの７ラグメント
   、サブフラグメント又はペグテドの全部の誘導体であシ
   、ただしこれらの７ラグメント、サブフラグメント、ペ
   グチド又は誘導体は次の諸条件即ちげ〕　抑ｉ１＃Ｊ細
   胞の分化の活性化特性をもっこと、（ロ）　抗体依存細
   胞毒の禁止特性をもっこと、並びに゛ （ハ）　ＮＫ細胞の活性化特性をもたないことの各条件
   を満たすことを特徴とする免疫調整医薬。 ２）　Ｆａｂフラグメント及び／又はＩｇＧインタクト
   を１重量饅よりも多くなく含有することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の免疫ｇ！４整医薬。 ３）　Ｆａｂ７　？グメント及び／又はＩｇＧインタク
   トを含まないことを特徴とする特ｆｆ請求の範囲第１項
   記載の免疫調整医薬。 ≠〕　有効成分がＦｃ　７ラグメントにより形成された
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１〜３項のいずれか
   ７項記載の免疫調整医薬。 ｊ）特に自己免疫疾患を処置し、臓器移殖を受けたか又
   は受けるべき疾患において拒絶反応を抑制するかもしく
   はその効果を少くすることのできる免疫調整医薬の製造
   への、特許請求の範囲第１項記載の人のＩｇＧのＦｃフ
   ラグメント又はその類縁物の使用。