JPS60188087A - 酵素によるl−トリプトフアンの製造方法 - Google Patents

酵素によるl−トリプトフアンの製造方法

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JPS60188087A
JPS60188087A JP59042970A JP4297084A JPS60188087A JP S60188087 A JPS60188087 A JP S60188087A JP 59042970 A JP59042970 A JP 59042970A JP 4297084 A JP4297084 A JP 4297084A JP S60188087 A JPS60188087 A JP S60188087A
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JP
Japan
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enzyme
producing
reaction
indole
serine
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Pending
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JP59042970A
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English (en)
Inventor
Shoichiro Miyahara
宮原 匠一郎
Toru Miyahara
徹 宮原
Toshio Matsumoto
松本 俊男
Akio Sakaguchi
昭夫 坂口
Kazunari Nitta
新田 一成
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Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Original Assignee
Mitsui Toatsu Chemicals Inc
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、トリプトファンシンセターゼまたはトトブ1
へファナーゼに、その生産菌体を直接用いて、インドー
ルとL−セリンよりL−t−リプトファンを酵素反応に
より製造する方法に関する。
更に詳しくは、インドールとL−セリンより酵素を用い
てL−1〜リプトファンを製造する方法において、酵素
を生産菌体のまま使用する際に、所定温度、所定時間の
保存処理により菌体膜の自己消化を促し、菌体膜の反応
基質及び生成物の透過性を向上させた後に反応に供する
ことにより、L−1−リプトファンの生成速度を早め、
最終的にL−)−リプトファンの生成率を高める方法に
関する。
L−)リプトフアンをトリプトファンシンセターゼある
いはトリプトファナーゼなどの酵素を用いてインドール
とL−セリンより製造するに際して酵素の使用形態とし
ては、酵素生産菌の培養液をそのまま用いる方法、培養
液から遠心分離などの方法により採取した生菌体やその
乾燥菌体あるいは菌体を超音波処理などの処理により得
られた菌体処理物、更にはこれらの菌体よりの抽出物や
該抽出物より得られる酵素の粗製物を用いる方法などが
あるが、工業的見地より考えればなるべく処理工程の少
ない方法が良い。ただし、培養液のまま用いると、精製
、取り出し工程での負荷が大きく有利なプロセスとはな
らないので一般的には培養液から遠心分離により集菌し
て得られた生菌体を使うのが工業的に有利なプロセスと
いわれている。また生菌体より常法により抽出した本酵
素の粗製物は極めて不安定な事が知られており(Edi
th Wilson Miles + Adv−Enz
ymol。
49 、 P、 134) 、かかる見地からも菌体の
まま反応に使用した方が良い。
本発明者らは、インドールとL−セリンとの酵素反応に
−よるL−1−リブトファンの製造法において、培養液
から集菌した生菌体を用いる反応を数多〈実施したが、
その場合、目的酵素を充分保有した菌体であるにもかか
わらず、菌体の種類に関係なく総合的に反応率にばらつ
きがあることがわかった。また反応時間をたとえ長時間
維持しても一定以下の反応収率しか得られないこともわ
かった。
その理由は、たとえば通常、トップトフアン・シンセタ
ーゼ生産菌として用いられているエシェリヒア・コリの
ような、細胞膜が複雑であるグラム陰性菌では、反応系
中では自己の有する細胞膜の自己消化が困難であり、し
かも反応率は初期反応速度の依存性が大きいため、反応
初期における細胞11りの反応基質及び得られた生成物
の透過性が反応速度の律速となり、菌の失活が生じるた
めと推定される。
本発明者らは、生産菌体に関係なくこのような欠点を改
善して、菌体の有する目的酵素が反応系中で失活しない
時間内で反応を行わせて反応収率を高める方法を鋭意検
討の結果、生産菌を培養後集菌した生産菌体を、所定温
度、所定時間反応系外で保存、放置した後でこれを反応
に供すれば、菌体の細11(1膜が自己消化されて膜透
過性が改良され、反応基質及び生成物の膜内への取り込
みまたは取り出しが容易となり、目的が達せられること
を見出し本発明は完成されたものである。
本発明方法において、インドールとL−セリンとの反応
に用いるトリプトファン・シンセターゼの酵素生産菌と
しては、特に限定はなく、例えばエシェリヒア・コリM
T −1fl 232 (FERM BP−1,9)、
エシェリヒア・コリMT−1(1242(FERMBP
−20)などの微生物や、メイロスボラ・クラッサ(A
’l”CC14692)などの微生物が使用できるが、
特にエシェリヒア・コリから得られたトリプトファン・
シンセターゼを用いるのが有利である。また特開昭55
−148095号公報記載のトリプトファナーゼもイ吏
用できる。
これらの菌の培養における培地としては、炭素源窒素源
、無機物および必要に応じて少量の微量栄養素を含むも
のであれば合成培地、天然培地の回れも使用可能である
。またトリプトファンシンセターゼ生産菌の培養に関し
ては一般に微量のインドールまたは1−リプトファンを
培地に加える必要がある。炭素源としては、グルコース
、フル1−−ス、澱粉、糖蜜などの炭水化物が使用でき
、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウムなどの各種の無機アンモニウム塩または
肉エキス、酵母エキスなどの天然有機窒素源が使用可能
である1、また天然窒素源の多くの場合は窒素源である
とともに炭素源ともなり得る。更に無機物として燐酸第
一水素カリウム、燐酸第二水素カリウム、塩化カルシウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、塩
化アルミニウム、塩化第一銅、塩化コバル1−1硫酸亜
鉛、ホウ酸、モルブテン酸ナトリウムなども必要に応じ
て用いるのがよい。
培養はしんどう培養あるいは通気かんはん深部培養など
の好気的条件下で行い、培養期間中培地の溶存酸素が生
育の律速因子にならないように通気およびかんはんする
ことが好ましい。培養温度は20〜50℃、好ましくは
30・−1+40″Cの範囲である。培養中の培地のP
Hは3〜9、好ましくは6〜8の範囲である。培養期間
は通常12〜72Hrである。
また工業的には、菌体を高濃度で得られる培養方法(公
開特許公報 昭58−20186)が好ましい。
以上により得られた菌体を高速遠心分n(機で集菌し、
集菌体を60℃以下、好ましくは5〜30°Cの所定温
度で少くとも6Hr以上、好ましくは12Hr〜6nH
r4 さらに好、ましくは1・2Hr〜48Hr間静置
保存後反応に使用する。保存温度が60℃以上では酵素
が失活し、また氷S催での保存は冷凍などの設備にコス
ト高となり、通常、室温付近の保存で充分である。また
保存時間は少くとも6時間以上保存したものでないと効
果に乏しく、60時間以上の長時間保存すれば菌体種類
によっては反応率が低下する場合もある。保存は特に無
菌下もしくはN、シール下などの特別な条件下で行う必
要はなく適度な清浄度の空気中で行なえばよい。
本発明における反応方法としては、主に水媒体中で公知
方法で実施できる。たとえば原料インドールが本酵素を
阻害することを考慮してインドールを分割添加する方法
(公開特許公報 昭58−16692)インドールを有
機溶媒側から水との分配平衡を利用してフィードする方
法(公開特許公報 昭59−11187)、$た原料と
してセリンをラセミ化する酵素の存在下L−セリンのか
わりにDL−セリンもしくはD−セリンを用いる方法(
公開特許公報昭57−31438)などいずれの方法で
も良い。
前記のインドールを有機溶媒側から水との分配平衡を利
用してフィードする方法では、特開昭59−1、118
7号公報記述のようにL−セリンと硫酸アンモニウム、
ピリドキサール、リン酸などを水媒体中に溶解もしくは
懸濁させ、L−セリンの濃度が2〜2nvA、%となる
様にし、一方インドールを1〜ルエンなどの有機溶媒に
溶解してインドール濃度が10〜40就係の溶液とした
それぞれをインドールに対してL−セリンのモル比が1
0〜11となる様に反応槽に仕込み、また集菌して保存
放置した1〜リフトファン・シンセターゼ生産菌は乾燥
菌体換算で水層における濃度が2〜5飢饅となる様に仕
込み、濃安水でPHを80〜90に合わせ、反応温度を
30〜50℃で20〜6(lHr反応させればよい。
本発明方法では上記の反応を実施した場合、得られた反
応液の1−ルエン府のインドール残分を分析することに
より対インドールの反応率を計算すると、菌体の培養ロ
ットに関係なく、反応率98φ以上となる。
実施例 トリプトファン・シンセターゼ生産rj−であるエシェ
リヒア・コリMT −1n 242 (FERM BP
−20)を5nnml容の坂ロフラスコ中の第1表に示
す組成の培地15(1mlに接種し、35°Cで24時
間培養した。この培養液600m1(フラスコ4本)を
201のジャーファーメンタ−中の第2表に示す組成の
培地104に接種し、35℃、PH6,8(濃安水で調
整)で培養した。
培地中の溶存酸素は飽和値の5%以下にならない様に通
気量およびかくはん回転数を調整し、あらかじめグルコ
ース濃度がゼロになると培養液の溶存酸素又はPHが上
昇するのを確認しておき、これらの値が上肩を始めた時
点でグルコースを1係になるように添v口した。この操
作を繰り返し最終的に添加したグルコース爪が5係濃度
に相当するように培養を行ない、40Hr培養後、菌体
を遠心分離により集菌した。
第 1 表 牛肉エキス 1n9 ボリペブ)−ン 10g NaCl 5g を蒸留水11に溶解して使用。(P H7,n )第 
2 表 KH,Po、 2ng、K、HPo、 2n、9Mg5
O,・7H,020g、(NH,)*S0. 15gポ
リペプトン 20g、酵母エキス 20gCaCAs2
H,OO,4,9、CuC452H,OO,n4gCO
Cl、・6H,OO,n4g、klcl、・6HIO0
,19HIBOI O,(1(15g、 MnSO4・
5HIO01gZnSO,・7)LOo、ozg、 N
aIMp04・2HIO0,02gFe50.・7H,
OO,4,!91 を蒸留水1111に溶解して使用。
集菌した菌体を、500mJ容ビーカー中に入れ、5°
C130°Cに内温を調整したふ卵器に保存し、所定時
間(6Hr、12Hr、24 Hr、3GI+r、48
Hr、6 QHr、)に菌体をサンプリングし、これを
反応に供した。
反応は、L−セリン5.66.9.硫酸アンモニウム0
77g、ピリドキサールリン酸0.(105gをイオン
交換水437gに懸濁して、濃安水にてP H8,5に
合わせておき、一方、インドール573gをトルエン2
29gに溶解しておき、これらを2(1+1m1反応器
に仕込み内温35°Cとして、上記の保存菌体を乾燥換
算t869加えてかくはん反応を開始した。
35°C/40Hr反応後、20係苛性ソ一ダ水溶液2
0gを添加して反応を止め、トルエン層を遠・ら公表3
及び図に示す。
なお、表3及び図中の保存時間0は、集菌後ただちに反
応に供した菌体を使用した場合の、保存菌体を1史用し
た場合と同様の35°c/ 4 nHrで反応終了時の
インドールの反応率である。また図中の実線は菌体を3
0℃で、破線は5℃で所定時間保存した菌体を使用した
例である。
表 3
【図面の簡単な説明】
図面は本発明実施例を実施した場合の菌体保存時間とイ
ンドール反応率との関係図であり、実線は菌体を30°
Cで保存した場合であり、破線は菌体を5°Cで保存し
た場合を示す。 特許出願人 三井東圧化学株式会社

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 インドールとL−セリンとを酵素生産菌体を用いて
    反応させてL−1−リプトフアンを製造する方法におい
    て、トリプトファン・シンセターゼまたはトリプトファ
    ナーゼ生産菌を培養後集菌した生産菌体を、60°C以
    下の温度で6時間以上保存放置した後、酵素生産菌体を
    反応に供することを特徴とする酵素によるL−1−リプ
    トファンの製造方法。 2 生産菌体の保存温度が5〜30°Cである特許請求
    の範囲第1項記載の方法。 3 生産菌体の保存時間が12〜60時間である特許請
    求の範囲第1項記載の方法。
JP59042970A 1984-03-08 1984-03-08 酵素によるl−トリプトフアンの製造方法 Pending JPS60188087A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7244203B2 (en) 2004-02-26 2007-07-17 Shimano (Singapore) Pte., Ltd. Bicycle derailleur

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7244203B2 (en) 2004-02-26 2007-07-17 Shimano (Singapore) Pte., Ltd. Bicycle derailleur

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