JPS60188092A - ラムノリピドの生物工学的製造方法及び分子内にただ１個のβ−ヒドロキシデカンカルボン酸残基を有するラムノリピド - Google Patents
ラムノリピドの生物工学的製造方法及び分子内にただ１個のβ−ヒドロキシデカンカルボン酸残基を有するラムノリピドInfo
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- JPS60188092A JPS60188092A JP60020211A JP2021185A JPS60188092A JP S60188092 A JPS60188092 A JP S60188092A JP 60020211 A JP60020211 A JP 60020211A JP 2021185 A JP2021185 A JP 2021185A JP S60188092 A JPS60188092 A JP S60188092A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
従来技＋ｌ：Ｉ
陰イオン性ラムノリピドが微生物、特にシュードモナス
属の増殖液内培養によって産生されることは公知である
。
属の増殖液内培養によって産生されることは公知である
。
ずなわらＢｅｒｇｓｔｒｏｍ等のＡ ｒ ｋ ｉ ｖｆ
ｏｒ ｋｅｍｉ、Ｍｉｎｅｒａｌｏｇｉｏｃｈ Ｇｅｏ
ｌｏｇｉ （化学、鉱物学及び地質学の記録）、２３八
巻（１０００年）１３号１〜１２頁の記載によると、例
えばカゼイン／グルコース培地で緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｐｙｏｃｙａｎｅａ）を培養すると、酸性脂
質と呼ばれるピオリピン酸が生成する。
ｏｒ ｋｅｍｉ、Ｍｉｎｅｒａｌｏｇｉｏｃｈ Ｇｅｏ
ｌｏｇｉ （化学、鉱物学及び地質学の記録）、２３八
巻（１０００年）１３号１〜１２頁の記載によると、例
えばカゼイン／グルコース培地で緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｐｙｏｃｙａｎｅａ）を培養すると、酸性脂
質と呼ばれるピオリピン酸が生成する。
、Ｊ ａ ｒ ｖ ｉ ｓ等はＪ、Δｍｅｒ、Ｃｈｅｍ
。
。
Ｓｏ ｃ、 、７ｉ（１９４９年）、４１２４〜４１２
６頁の中で、２−０−α−Ｌ−ラムノピラノシルーα−
Ｌ−ラムノピラノシル−β−ヒドロキシデカノイル−β
−ヒドロキシデカン酸と呼ばれ、次のような構造式を有
する陰イオン性ラムノリピド（１）について報告してい
る；０１１ ０１１ Ｈｉ ｓ ａ ｔ ｓ ｕ ｋ ａ等はＡｇｒ、Ｂｉｏ
ｌ。
６頁の中で、２−０−α−Ｌ−ラムノピラノシルーα−
Ｌ−ラムノピラノシル−β−ヒドロキシデカノイル−β
−ヒドロキシデカン酸と呼ばれ、次のような構造式を有
する陰イオン性ラムノリピド（１）について報告してい
る；０１１ ０１１ Ｈｉ ｓ ａ ｔ ｓ ｕ ｋ ａ等はＡｇｒ、Ｂｉｏ
ｌ。
Ｃｈｅｍ、 、５巻、（１９７１年）５号、６８６〜６
９２頁の中で、緑膿菌によるラムノリピドの生成及び炭
化水素の発酵にお（、Ｊるラムノリピドの作用について
述べている。彼等は炭素ｉ１ｊ；ｊ及びエネルギー源と
してのｎ−パラフィンに及はす緑膿菌の作用によってラ
ムノリピド （１）を得ている。彼等はこのラムノリピ
ド（１）がかなり低深度においてずでに、ｎ−ヘキザデ
カン培地での緑膿菌の増殖を非常に強く促進させること
を確認している。この場合にラムノリピド（１）によつ
゛（起こさ−ｌる増殖促進は、他の炭化水素を利用する
微生物には認めることができないものであった。
９２頁の中で、緑膿菌によるラムノリピドの生成及び炭
化水素の発酵にお（、Ｊるラムノリピドの作用について
述べている。彼等は炭素ｉ１ｊ；ｊ及びエネルギー源と
してのｎ−パラフィンに及はす緑膿菌の作用によってラ
ムノリピド （１）を得ている。彼等はこのラムノリピ
ド（１）がかなり低深度においてずでに、ｎ−ヘキザデ
カン培地での緑膿菌の増殖を非常に強く促進させること
を確認している。この場合にラムノリピド（１）によつ
゛（起こさ−ｌる増殖促進は、他の炭化水素を利用する
微生物には認めることができないものであった。
伊藤等はＴｈｅ Ｊｏｕｒｎ、’ｏｆ Ａｎｔ−ｉｂｉ
ｏＬｉｃｓ （抗生物質ジャーナル）、２４巻（１９７
１年）、８５５〜８５９頁の彼らの論文の中で、この先
行技術に基ついて、ラムノリピドの生合成について正確
な知識を持つならば、ラムノリピＦ（１）の前駆体を表
す他のうムノリビドの生成が推察されると述べている。
ｏＬｉｃｓ （抗生物質ジャーナル）、２４巻（１９７
１年）、８５５〜８５９頁の彼らの論文の中で、この先
行技術に基ついて、ラムノリピドの生合成について正確
な知識を持つならば、ラムノリピＦ（１）の前駆体を表
す他のうムノリビドの生成が推察されると述べている。
彼らは緑膿菌のｎ−パラフィン増殖培養から、彼らがラ
ムノリピドＲ−１と名づレノだ公知のラムノリピド（１
）の他に、Ｌ−α−ラムノピラノシル−β−ピドロギシ
デカノニルーβ−ヒドロキシデカノエートと同定され、
ラムノリピド（１）の前駆体と認められる他のラムノリ
ピドＲ−２が単離されることを発見している。
ムノリピドＲ−１と名づレノだ公知のラムノリピド（１
）の他に、Ｌ−α−ラムノピラノシル−β−ピドロギシ
デカノニルーβ−ヒドロキシデカノエートと同定され、
ラムノリピド（１）の前駆体と認められる他のラムノリ
ピドＲ−２が単離されることを発見している。
Ｉ ｔｏｈ等はＡｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、３６Ｓ
（１９７２年＞２２３３〜２２３５頁においても、これ
について同様な定義を用いて報告している。彼らはさら
に、ｎ−パラフィンを栄養素として利用する能力を失っ
た緑膿菌変異体が、培養懸濁？Ｉｌにラムノリピドを加
えるならば、ふたたび増殖するようになることを報告し
ている。このことから彼らは、変異体が栄養素源として
ｎ−パラフィンを利用する酵素活性を失ったのではなく
、緑膿菌によるｎ−パラフィシの処理にはラムノリピド
が本質的に必要であることを結論している。
（１９７２年＞２２３３〜２２３５頁においても、これ
について同様な定義を用いて報告している。彼らはさら
に、ｎ−パラフィンを栄養素として利用する能力を失っ
た緑膿菌変異体が、培養懸濁？Ｉｌにラムノリピドを加
えるならば、ふたたび増殖するようになることを報告し
ている。このことから彼らは、変異体が栄養素源として
ｎ−パラフィンを利用する酵素活性を失ったのではなく
、緑膿菌によるｎ−パラフィシの処理にはラムノリピド
が本質的に必要であることを結論している。
Ｃｏｏｐｅｒ等はＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉ）ｅ−ｇｒａ
ｄａｔｉｏｎ ｏｒ Ｐｏ１ｌｕａｎｔｓｉｎ Ｍａｉ
ｎｅ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔｓ（マイン河雰囲気におけ
るｌη染物の微生物分解）（１９７９年）２３１〜２４
０頁におけるラムノリピドの報告の中で、前述の研究を
参照して、１ｔｏｈ等の引用文献（１９７１年）と一致
したラムノリピドの名称を述べている。彼らはα−Ｌ−
ラムノピラノシルーβ−ヒドロキシデカノイル−β−ヒ
ドロキシデカノエートと見なしたラムノリピドに対して
、１個のラムノース残基と１（固のヒドロキシデカン酸
残基のみを有する構造式を確かに不適切に与えている。
ｄａｔｉｏｎ ｏｒ Ｐｏ１ｌｕａｎｔｓｉｎ Ｍａｉ
ｎｅ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔｓ（マイン河雰囲気におけ
るｌη染物の微生物分解）（１９７９年）２３１〜２４
０頁におけるラムノリピドの報告の中で、前述の研究を
参照して、１ｔｏｈ等の引用文献（１９７１年）と一致
したラムノリピドの名称を述べている。彼らはα−Ｌ−
ラムノピラノシルーβ−ヒドロキシデカノイル−β−ヒ
ドロキシデカノエートと見なしたラムノリピドに対して
、１個のラムノース残基と１（固のヒドロキシデカン酸
残基のみを有する構造式を確かに不適切に与えている。
これと同じような誤りがＡｄｖａｎｃｅｓ １ｎＡｐｐ
ｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ （応用微生物学の進歩
）、２６巻（１９８０年）２２９〜２５３頁のＣｏｏｐ
ｅｒ等の論文の２３４〜２３５頁に見出される。
ｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ （応用微生物学の進歩
）、２６巻（１９８０年）２２９〜２５３頁のＣｏｏｐ
ｅｒ等の論文の２３４〜２３５頁に見出される。
西ドイツ公開明細書第２１５０３７５号からは、ラムノ
ース含を糖脂質の生物工学的製造方法が公知である。こ
れによると、シュードモナス属のこのような糖脂質産生
菌は同化可能な炭化水素源を少なくともひとつ含有する
水性栄養培地（ｐＨ値４〜１０、温度２５〜３７°Ｃ）
において、好気的に増殖し、培養液から１ｇ脂質が単離
される。これらの方法は糖脂質を高収率で製造するとい
う課題を解決するものと考えられる。
ース含を糖脂質の生物工学的製造方法が公知である。こ
れによると、シュードモナス属のこのような糖脂質産生
菌は同化可能な炭化水素源を少なくともひとつ含有する
水性栄養培地（ｐＨ値４〜１０、温度２５〜３７°Ｃ）
において、好気的に増殖し、培養液から１ｇ脂質が単離
される。これらの方法は糖脂質を高収率で製造するとい
う課題を解決するものと考えられる。
この西ドイツ公開明細書の実施例によると、前記シュー
ドモナス属のこれらの菌に割当てられた炭素源への作用
によって、次のような収率が得られている： シュードモナス属 炭素源 ラムノリピド収率（ｇ／ｊ
！（培養肉汁）） 緑＋ａ菌 ＡＴＣＣ１５２４６ｎ−パラフィン２．４シ
１−ト壬ナス、フルオレセンス 八ＴＣＣ１５４５３ｎ
−パラフィン ５．０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ）緑Ｉ農菌 八ＴＣＣ１０１４５グリ
セリン ０．８７緑膿菌 八ＴＣＣ１０１４５ｎ−パラ
フィン ９．７緑ＩＩ農菌 八ＴＣＣ１５２４６グルコ
ース ５．６ントト干ナス・フルオレセンス ＡＴＣＣ
１５４５３グリセリン ３．３ラムノリピドとしてα−
Ｌ−ラムノピラノンルーβ−ヒドロギシデカノイルーβ
−ヒｌロキシデカン酸と２−０− Ｌラムノピラノシル
−α−Ｌ−ラムノピラノシルーβ−ヒｌ′ロキシテカノ
イルーβ−ヒト′ロキシデカン酸が得られている。
ドモナス属のこれらの菌に割当てられた炭素源への作用
によって、次のような収率が得られている： シュードモナス属 炭素源 ラムノリピド収率（ｇ／ｊ
！（培養肉汁）） 緑＋ａ菌 ＡＴＣＣ１５２４６ｎ−パラフィン２．４シ
１−ト壬ナス、フルオレセンス 八ＴＣＣ１５４５３ｎ
−パラフィン ５．０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓ）緑Ｉ農菌 八ＴＣＣ１０１４５グリ
セリン ０．８７緑膿菌 八ＴＣＣ１０１４５ｎ−パラ
フィン ９．７緑ＩＩ農菌 八ＴＣＣ１５２４６グルコ
ース ５．６ントト干ナス・フルオレセンス ＡＴＣＣ
１５４５３グリセリン ３．３ラムノリピドとしてα−
Ｌ−ラムノピラノンルーβ−ヒドロギシデカノイルーβ
−ヒｌロキシデカン酸と２−０− Ｌラムノピラノシル
−α−Ｌ−ラムノピラノシルーβ−ヒｌ′ロキシテカノ
イルーβ−ヒト′ロキシデカン酸が得られている。
この先行技術から、今までは、１個または２個のラムノ
ース残基の他に２個のヒドロキシデカン酸残基を含有す
るラムノリピドの生物工学的製造のめに成功しているこ
とがわかる。
ース残基の他に２個のヒドロキシデカン酸残基を含有す
るラムノリピドの生物工学的製造のめに成功しているこ
とがわかる。
発明の目的
従って、他のラムノリピドを発見し、細胞群に関連づり
られたラムノリピド収率を高める可能性を見出すという
課題が設定された。
られたラムノリピド収率を高める可能性を見出すという
課題が設定された。
少なくとも１種類の同化可能な炭素源を含む水性培地（
ｐＨ値は４を超える。温度は３０゛Ｃ以上）においてシ
ュードモナス属の微生物によりラムノリピドを製造する
方法が今回発見された。
ｐＨ値は４を超える。温度は３０゛Ｃ以上）においてシ
ュードモナス属の微生物によりラムノリピドを製造する
方法が今回発見された。
この方法では、微生物として水サンプルから単離された
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の菌株を９１１値６．
５〜７．３及び温度３０〜３７℃において用いている。
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の菌株を９１１値６．
５〜７．３及び温度３０〜３７℃において用いている。
このシコごトモナス属ＤＳＭ２８７４の菌株の細胞は桿
状であり、約０．５μｍの直径で約１．０μｍの長さを
有しており、可動性であり、１本の鞭毛によって単極性
に鞭毛運動をする。このシュードモナス属ＤＳＭ２８７
４のコロニーはヘキサデカンの複合培地上で黄色に着色
され、光沢のある不透明な表面と平滑なコロニー縁部と
を有している。１日後にコロニー直径は約１１になる。
状であり、約０．５μｍの直径で約１．０μｍの長さを
有しており、可動性であり、１本の鞭毛によって単極性
に鞭毛運動をする。このシュードモナス属ＤＳＭ２８７
４のコロニーはヘキサデカンの複合培地上で黄色に着色
され、光沢のある不透明な表面と平滑なコロニー縁部と
を有している。１日後にコロニー直径は約１１になる。
このシュードモナス属ＤＳＭ２８７４の菌株はグラム陰
性で、好気性であり、これの細胞乾燥塊は黄灰色を有し
ている。
性で、好気性であり、これの細胞乾燥塊は黄灰色を有し
ている。
この菌株はゼラチンを液化し、グルコース上で４２℃の
温度において増殖する。さらに、これば溶血性であり、
ウレアーゼ陽性である。
温度において増殖する。さらに、これば溶血性であり、
ウレアーゼ陽性である。
なお、この菌株が次のような窒素源または炭素源を利用
しうろことが確認されている。
しうろことが確認されている。
窒素源：硫酸アンモニウム
亜硝酸ナトリウムまたは硝酸ナトリウム尿素
炭素源ニゲルコース
アラビノース グルタミン酸塩
フラクトース セリン
グリセリン
クエン酸塩
マロン酸塩
コハク酸塩
リンゴ酸塩
ピルビン酸塩 グリセリン
エタノール
プロパノール
オクタノール
ステアリン酸
ミリスチン酸
アルカン
本発明によって使用するシュードモナス属ＤＳＭ２８７
４の菌株は、適当量の水酸化アンモニウムまたは水酸化
アルカリ溶液、特に水酸化ナトリウム溶液の添加によっ
て、増殖中のｐ＋＋値を一定に保持した栄養素溶液内で
の好気性増殖中に、ラムノリピドを産生ずる。このよう
な栄養素溶液は例えば次のような物質を、脱イオン化水
１０００−につき記載したｇＲで含む：ＮａｚｌｌＰＯ
４Ｈ２ｔｌ。０５．３４Ｋｌｌ□ｐｏ、 ２．７２ （Ｎ＋１４）２５（１４・７１１□０８．０Ｃａｃ１２
−２１１２０ ０．２ ＭＢ５Ｏｓ・７１１□００．４ ＦｅＳＯ４’ ７！ｈ０ ０．０２ Ｍｎ５Ｏ＝ ・１１２０ ０．００２５ヘゾタｆリノテ
ン酸アンモニウム ０．００１このような物質を殺菌済
みの同化可能な炭素源に加える前に、先ず最初に従来の
方法で殺菌し〜冷却する。炭素源としては、炭素数１４
の分子を８９％、炭素数１５の分子を９％含有するｎ−
パラフィンを用いるのが望ましい。
４の菌株は、適当量の水酸化アンモニウムまたは水酸化
アルカリ溶液、特に水酸化ナトリウム溶液の添加によっ
て、増殖中のｐ＋＋値を一定に保持した栄養素溶液内で
の好気性増殖中に、ラムノリピドを産生ずる。このよう
な栄養素溶液は例えば次のような物質を、脱イオン化水
１０００−につき記載したｇＲで含む：ＮａｚｌｌＰＯ
４Ｈ２ｔｌ。０５．３４Ｋｌｌ□ｐｏ、 ２．７２ （Ｎ＋１４）２５（１４・７１１□０８．０Ｃａｃ１２
−２１１２０ ０．２ ＭＢ５Ｏｓ・７１１□００．４ ＦｅＳＯ４’ ７！ｈ０ ０．０２ Ｍｎ５Ｏ＝ ・１１２０ ０．００２５ヘゾタｆリノテ
ン酸アンモニウム ０．００１このような物質を殺菌済
みの同化可能な炭素源に加える前に、先ず最初に従来の
方法で殺菌し〜冷却する。炭素源としては、炭素数１４
の分子を８９％、炭素数１５の分子を９％含有するｎ−
パラフィンを用いるのが望ましい。
前記の表に記載した化合物以外の化合物を炭素源として
用いても、同様に良好な成果が得られることは自明のこ
とである。
用いても、同様に良好な成果が得られることは自明のこ
とである。
増殖が終了した後に、得られた液内培養を本来公知の方
法で、例えば酢酸エチルのような適当な溶剤によって抽
出する。得られたラムノリピド含有抽出液を混合し、好
ましくは真空下で残渣になるまで濃縮し、最後に本来公
知の方法で、特にクロマ１−グラフィによって処理する
。
法で、例えば酢酸エチルのような適当な溶剤によって抽
出する。得られたラムノリピド含有抽出液を混合し、好
ましくは真空下で残渣になるまで濃縮し、最後に本来公
知の方法で、特にクロマ１−グラフィによって処理する
。
このような増殖からシュードモナス属ＤＳＭ２８７４に
よって、公知のラムノリピド２−０−α−Ｉ、−ラムノ
ピラノシルーα−■７−ラムツピラノシルーβ−ヒ１Ｌ
Ｊ−トシデカノイルーβ−ヒドロキシデカン酸 Ｏ １ ０１１０１１ 及びα−Ｌ−ラムノピラノシルーβ−ヒドロキシデカノ
イル−β−ヒドロキシデカン酸１ が生成する。
よって、公知のラムノリピド２−０−α−Ｉ、−ラムノ
ピラノシルーα−■７−ラムツピラノシルーβ−ヒ１Ｌ
Ｊ−トシデカノイルーβ−ヒドロキシデカン酸 Ｏ １ ０１１０１１ 及びα−Ｌ−ラムノピラノシルーβ−ヒドロキシデカノ
イル−β−ヒドロキシデカン酸１ が生成する。
この両ラムノリピドを合計した収量は細胞乾燥塊１ｇに
つき０．１ｇまたは培養液１０００ｃＪにつき０．８
ｇである。
つき０．１ｇまたは培養液１０００ｃＪにつき０．８
ｇである。
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４を同し方法で、但し窒
素供給量を制限して増殖させた場合には、前記のラムノ
リピド（１）と（ＩＩ）が細胞乾燥塊１ｇにつき０．５
ｇまたは培養液１０００ｃｉにつき約１２ｇの間で同様
に得られる。この場合には、増殖間のｐＨ値調節を水酸
化ナトリウム溶液で行うのが有利である。
素供給量を制限して増殖させた場合には、前記のラムノ
リピド（１）と（ＩＩ）が細胞乾燥塊１ｇにつき０．５
ｇまたは培養液１０００ｃｉにつき約１２ｇの間で同様
に得られる。この場合には、増殖間のｐＨ値調節を水酸
化ナトリウム溶液で行うのが有利である。
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の増殖をＭｇ２“−イ
オン濃度を制限して行う場合にも、同様な作用が得られ
る。ラムノリピド（１）及び（ＴＩ）の収率は細胞乾燥
塊１ｇにつき約０．４ｇになる。
オン濃度を制限して行う場合にも、同様な作用が得られ
る。ラムノリピド（１）及び（ＴＩ）の収率は細胞乾燥
塊１ｇにつき約０．４ｇになる。
１種類の同化可能炭素源を倉荷する栄養物溶液中の好気
性条件下でシュードモナス属１） Ｓ Ｍ２８７４を増
殖させ、次に培養液から細胞含湿塊を分離するならば、
細胞乾燥塊に基づくラムノリピド収率をさらに高めるこ
とができる。
性条件下でシュードモナス属１） Ｓ Ｍ２８７４を増
殖させ、次に培養液から細胞含湿塊を分離するならば、
細胞乾燥塊に基づくラムノリピド収率をさらに高めるこ
とができる。
この分離の際に残留する液相からは、前述のように、ラ
ムノリピドを単離することができる。
ムノリピドを単離することができる。
得られた細胞含湿塊（休止細胞）を場合によっては（−
３０℃〜−３５℃の温度に中間保持した後にも）０．４
〜０．６重量％のＮａＣＬを含有する希薄な塩化ナトリ
ウム水溶液中に）Ｕ濁させる。
３０℃〜−３５℃の温度に中間保持した後にも）０．４
〜０．６重量％のＮａＣＬを含有する希薄な塩化ナトリ
ウム水溶液中に）Ｕ濁させる。
この懸濁液に例えばグリセリンまたはｎ−パラフィン（
Ｃ，，１８９％、Ｃ８，９％）のような同化可能な炭素
源を添加した後に、約３０〜４０℃の温度においてこＱ
懸濁液を活発に動かしながら培養し、懸濁液のｐＨ値を
常に監視し、ＩＮ水酸化すトリウム溶液の適当量を添加
して６．０〜６．８のｐＨ値に維持する。培養が終了し
た後に、細胞含湿塊を分離する。上清水層のｐｉ値を例
えば硫酸、塩酸のような強い無機酸希薄溶液好ましくは
１０％溶液によって、約２まで低下させ、その後にこれ
からラムノリピドを単離する。細胞含湿塊を塩化ナトリ
ウム溶液に再度）び、濁させ、同化可能な炭素源を添加
した後に、前述と同様に培養する。この過程を休止細胞
に関して再度くり返すことができる。
Ｃ，，１８９％、Ｃ８，９％）のような同化可能な炭素
源を添加した後に、約３０〜４０℃の温度においてこＱ
懸濁液を活発に動かしながら培養し、懸濁液のｐＨ値を
常に監視し、ＩＮ水酸化すトリウム溶液の適当量を添加
して６．０〜６．８のｐＨ値に維持する。培養が終了し
た後に、細胞含湿塊を分離する。上清水層のｐｉ値を例
えば硫酸、塩酸のような強い無機酸希薄溶液好ましくは
１０％溶液によって、約２まで低下させ、その後にこれ
からラムノリピドを単離する。細胞含湿塊を塩化ナトリ
ウム溶液に再度）び、濁させ、同化可能な炭素源を添加
した後に、前述と同様に培養する。この過程を休止細胞
に関して再度くり返すことができる。
この後に、ごの休止細胞の生産活性は実際に零になる。
休止細胞を最初に用いた場合には、細胞乾燥塊１ｇにつ
きラムノリピド約１．１ｇの収率が得すイ１１、二回目
に用いた場合にはこの量の３２％、三回目に用いた場合
にはこの量の１４％が収率として得られるので、この場
合の総合収率は細胞乾燥塊１ｇにつきラムノリピド約１
．６ｇになる。
きラムノリピド約１．１ｇの収率が得すイ１１、二回目
に用いた場合にはこの量の３２％、三回目に用いた場合
にはこの量の１４％が収率として得られるので、この場
合の総合収率は細胞乾燥塊１ｇにつきラムノリピド約１
．６ｇになる。
この場合に、分子内にβ−ヒドロキシデカノイル残基を
ただ１個含め、３３４または４８０の分子量を有するラ
ムノリピドが初めて単離された。このラムノリピドは次
の構造式：％式％ ヲ有し、α−Ｌ−ラムノピラノシルーβ−ヒドロキシデ
カン酸（ラムノリピド（Ｉｌ［））または２−０−α−
Ｉ、−ラムノピラノシルーα−Ｌ−ラムノピラノシル−
β−ヒドロキシデカン酸（ラムノリピド（ＩＶＹ）と名
づけられるものである。これらの構造は元素分析、１３
ｃｍ及び１１１−核磁気共鳴スペクトル及び質量スペク
トル分析によって一義的に確認されたものである。
ただ１個含め、３３４または４８０の分子量を有するラ
ムノリピドが初めて単離された。このラムノリピドは次
の構造式：％式％ ヲ有し、α−Ｌ−ラムノピラノシルーβ−ヒドロキシデ
カン酸（ラムノリピド（Ｉｌ［））または２−０−α−
Ｉ、−ラムノピラノシルーα−Ｌ−ラムノピラノシル−
β−ヒドロキシデカン酸（ラムノリピド（ＩＶＹ）と名
づけられるものである。これらの構造は元素分析、１３
ｃｍ及び１１１−核磁気共鳴スペクトル及び質量スペク
トル分析によって一義的に確認されたものである。
さらに、休止細胞によって得られたラムノリピド（１）
〜（ｒＶ）の混合物の組成は同化可能な炭素源に対し、
炭素源が同しである場合には培養温度に対して、次に示
すように依存する二犬−± ３０°Ｃの培養温度において休止細胞によって産生され
たラムノリピド（１）〜（ＩＶ）の混合物の組成の同化
可能な炭素源の種類への依存性ラムノリピド ９１１
ｆ １１ン ｎ−パラフィン（ＣＩ４８９％、 Ｃ１，
９％ ）（１） ６１．５％ ４１％ （ＩＩ） ２２．４％ ４２％ （ｉｌｌ、） １５．１％ １５％ （ＩＶ） １．０％ ２％ 塾−−？− 同一炭素源であるｎ−パラフィン（Ｃ，４８９％、０１
５９％）に対する休止細胞の作用によって得られたラム
ノリピド（１）〜（ＴＶ）混合物組成の培養温度に対す
る依存性 ラムノしく１ ３０℃ 支７ ’ｃ （１） ４１％ ３２％ （１１） ４２％ ６６％ （ｉｌｌ） １５％ １％ （ＩＶ） ２％ １％ 本発明による方法の他の態様は、ソニートモナス属ＤＳ
Ｍ２８７４によってラムノリピドを良好な収率で得るた
めの他の可能性を提供するものである。これによると、
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４を、例えばクルコース
、ｎ−ノ〈ラフイン等のような同化可能な炭素源を１種
類含む栄役素溶液中で特に３０〜３７℃の温度において
好気的に増殖させるが、この場合に希’ｔＷな、特に１
０％の水酸化ナトリウム溶液を培養液中に添加すること
によってｐＨ値を中和点に、特に６．８〜７．２に常に
維持する。培養の終了後に、培養液から細胞含湿塊を分
離し、希薄な、特に０．５〜１．０％の塩化ナトリウム
溶液中に懸濁させ、この：ｎ濁液中にアルギン酸ナトリ
ウム溶液を加えて攪拌する。この混合物を次に攪拌しな
がら、未飽和塩化カルシウム溶液中に滴加し、粒状物が
形成され、その直径が平均して約１．５ ｍ１１になる
まで、この混合物を攪拌する。この粒状物を液相から分
離し、特に０．５〜１．０重量％のＮａＣＬを含有する
不飽和塩化ナトリウム溶液中に移し入れる。この溶液に
少量の塩化カルルシウムをン容かし込み、イ列えばグリ
セリン、ｎ−パラフィン（ＣＩ４８９％、０１５９％）
等のような同化可能な炭素源を含ませる。培養を３０〜
４０°Ｃの温度及び６．５〜６．９のｐｕ値において実
施した後に、粒状物を液相から分離し、液相からラムノ
リピドを抽出によって単離する。分離した粒状物は生物
反応触媒としてさらに数回、同様に用いることができる
。この粒状物は前述の休止細胞よりも実際に緩慢にその
活性を失う。粒状物の相対活性は、１００％の活性をイ
Ｊする最初の装入に対して、第２回装入では９０％、第
３回装入では４４％及び第４回装入では３４％になる。
〜（ｒＶ）の混合物の組成は同化可能な炭素源に対し、
炭素源が同しである場合には培養温度に対して、次に示
すように依存する二犬−± ３０°Ｃの培養温度において休止細胞によって産生され
たラムノリピド（１）〜（ＩＶ）の混合物の組成の同化
可能な炭素源の種類への依存性ラムノリピド ９１１
ｆ １１ン ｎ−パラフィン（ＣＩ４８９％、 Ｃ１，
９％ ）（１） ６１．５％ ４１％ （ＩＩ） ２２．４％ ４２％ （ｉｌｌ、） １５．１％ １５％ （ＩＶ） １．０％ ２％ 塾−−？− 同一炭素源であるｎ−パラフィン（Ｃ，４８９％、０１
５９％）に対する休止細胞の作用によって得られたラム
ノリピド（１）〜（ＴＶ）混合物組成の培養温度に対す
る依存性 ラムノしく１ ３０℃ 支７ ’ｃ （１） ４１％ ３２％ （１１） ４２％ ６６％ （ｉｌｌ） １５％ １％ （ＩＶ） ２％ １％ 本発明による方法の他の態様は、ソニートモナス属ＤＳ
Ｍ２８７４によってラムノリピドを良好な収率で得るた
めの他の可能性を提供するものである。これによると、
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４を、例えばクルコース
、ｎ−ノ〈ラフイン等のような同化可能な炭素源を１種
類含む栄役素溶液中で特に３０〜３７℃の温度において
好気的に増殖させるが、この場合に希’ｔＷな、特に１
０％の水酸化ナトリウム溶液を培養液中に添加すること
によってｐＨ値を中和点に、特に６．８〜７．２に常に
維持する。培養の終了後に、培養液から細胞含湿塊を分
離し、希薄な、特に０．５〜１．０％の塩化ナトリウム
溶液中に懸濁させ、この：ｎ濁液中にアルギン酸ナトリ
ウム溶液を加えて攪拌する。この混合物を次に攪拌しな
がら、未飽和塩化カルシウム溶液中に滴加し、粒状物が
形成され、その直径が平均して約１．５ ｍ１１になる
まで、この混合物を攪拌する。この粒状物を液相から分
離し、特に０．５〜１．０重量％のＮａＣＬを含有する
不飽和塩化ナトリウム溶液中に移し入れる。この溶液に
少量の塩化カルルシウムをン容かし込み、イ列えばグリ
セリン、ｎ−パラフィン（ＣＩ４８９％、０１５９％）
等のような同化可能な炭素源を含ませる。培養を３０〜
４０°Ｃの温度及び６．５〜６．９のｐｕ値において実
施した後に、粒状物を液相から分離し、液相からラムノ
リピドを抽出によって単離する。分離した粒状物は生物
反応触媒としてさらに数回、同様に用いることができる
。この粒状物は前述の休止細胞よりも実際に緩慢にその
活性を失う。粒状物の相対活性は、１００％の活性をイ
Ｊする最初の装入に対して、第２回装入では９０％、第
３回装入では４４％及び第４回装入では３４％になる。
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の粒状形態で固定化さ
れた細胞塊によっても、ラムノリピド（１）〜（１■）
が得られる。
れた細胞塊によっても、ラムノリピド（１）〜（１■）
が得られる。
本発明によって得られたラムノリピド及びその混合物は
、２０〜９０ ’Ｃの温度範囲のｎ−ヘキサデカンｌ水
の系において温度依存性を示さず、３〜９の範囲におけ
るｐＨ値変比変化びに〉０から１４重■％までの範囲の
水相の塩分によって殆ど影響されない界面活性作用を有
することをｌ′１１￥！１．とする。また、この範囲に
おいてラムノリピドの加水分解はみられなかった。
、２０〜９０ ’Ｃの温度範囲のｎ−ヘキサデカンｌ水
の系において温度依存性を示さず、３〜９の範囲におけ
るｐＨ値変比変化びに〉０から１４重■％までの範囲の
水相の塩分によって殆ど影響されない界面活性作用を有
することをｌ′１１￥！１．とする。また、この範囲に
おいてラムノリピドの加水分解はみられなかった。
以上の理由から、本発明によって製造したラムノリピド
−は石油貯蔵所の３次サージタンク用の界面活性添加剤
として特に適している。実験では、溢流水１１あたりわ
ずか０．５〜０．７ｇのラムノリピドによって、１２％
以上の大きな脱油効果が達成されることが示されている
。
−は石油貯蔵所の３次サージタンク用の界面活性添加剤
として特に適している。実験では、溢流水１１あたりわ
ずか０．５〜０．７ｇのラムノリピドによって、１２％
以上の大きな脱油効果が達成されることが示されている
。
夫族炎−上
増殖細胞によるラムノリピドの産生
それぞれ培地１００歳（組成： ＮａｚｌｌＰＯ４’
２Ｈｚ００．５３４ ｇ ＸＫＩ１２ＰＯ４０，２７２
ｇ 、 （Ｎｉｌ□）’ｚｓＯ４・７１１□００．８ｇ
、ＣａＣ１，２＋ ２１１２００．０２ｇ 、 ＭｇＳ
Ｏ４０，０４ｇ−ＦｅＳＯ，＋ ・７１１２０ ０．０
０２ｇ、、Ｍｎ５Ｏ，・Ｉ２００．０００２５ｇ、ヘプ
タモリブデン酸アンモニウム０．０００１ ｇ及び蒸留
水１００ Ｊ＞を含む、デフレフタイ」きの５００槻−
エルレンマイヤーフラスコ内で１１００ｒｐ及びｐＨ値
６．８において、シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の増
殖を行った、この培地は１２１°Ｃにおいて３０分間殺
菌し、３０℃に冷却後、無菌パラフィン５（ＣＩ４１３
９％、Ｃｌｓ ９％）２ｇを加え、シュードモナス属Ｄ
ＳＭ２８７４の２４時間液内培養ｔＪを接種したもので
ある。増殖中に液内培養のｐＨ値を２４時間後及び４８
時間後に、無菌のＩ Ｎ Ｎａ０１１溶液によってｐＨ
６，８に調節する。増殖が７２時間後に終了した後に、
得られた液内培養を酢酸エチルを用いて周知の方法で徹
底的に抽出した。有機抽出液は真空製１宿後ｔこ８０■
のラムノリピド、ずなわらうｌ、ノリピト＋４０＋ｎｇ
（全ラムノリピＦに関して５０％）、ラムノリピド１１
４０ｍｇ（全ラムノリピドに関して５０％）を含有した
。
２Ｈｚ００．５３４ ｇ ＸＫＩ１２ＰＯ４０，２７２
ｇ 、 （Ｎｉｌ□）’ｚｓＯ４・７１１□００．８ｇ
、ＣａＣ１，２＋ ２１１２００．０２ｇ 、 ＭｇＳ
Ｏ４０，０４ｇ−ＦｅＳＯ，＋ ・７１１２０ ０．０
０２ｇ、、Ｍｎ５Ｏ，・Ｉ２００．０００２５ｇ、ヘプ
タモリブデン酸アンモニウム０．０００１ ｇ及び蒸留
水１００ Ｊ＞を含む、デフレフタイ」きの５００槻−
エルレンマイヤーフラスコ内で１１００ｒｐ及びｐＨ値
６．８において、シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の増
殖を行った、この培地は１２１°Ｃにおいて３０分間殺
菌し、３０℃に冷却後、無菌パラフィン５（ＣＩ４１３
９％、Ｃｌｓ ９％）２ｇを加え、シュードモナス属Ｄ
ＳＭ２８７４の２４時間液内培養ｔＪを接種したもので
ある。増殖中に液内培養のｐＨ値を２４時間後及び４８
時間後に、無菌のＩ Ｎ Ｎａ０１１溶液によってｐＨ
６，８に調節する。増殖が７２時間後に終了した後に、
得られた液内培養を酢酸エチルを用いて周知の方法で徹
底的に抽出した。有機抽出液は真空製１宿後ｔこ８０■
のラムノリピド、ずなわらうｌ、ノリピト＋４０＋ｎｇ
（全ラムノリピＦに関して５０％）、ラムノリピド１１
４０ｍｇ（全ラムノリピドに関して５０％）を含有した
。
夫順列−叢
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４を実施例１と同様に増
殖さゼたが、培地中にＭｇ５Ｏｎ・ ７１１□０を０．
０４ｇでばなく ０．００２ ｇのみ加えた。抽出は実
施例１と同様に実施した。得られた有機抽出液はラムノ
リピドＩＩ １１３ｍｇ （全ラムノリピドに関して６
５％）及びラムノリピド１６０ｍｇ（全ラムノリピドに
関して３５％）を含むものであった。
殖さゼたが、培地中にＭｇ５Ｏｎ・ ７１１□０を０．
０４ｇでばなく ０．００２ ｇのみ加えた。抽出は実
施例１と同様に実施した。得られた有機抽出液はラムノ
リピドＩＩ １１３ｍｇ （全ラムノリピドに関して６
５％）及びラムノリピド１６０ｍｇ（全ラムノリピドに
関して３５％）を含むものであった。
簾↓
転倒装置を備えたバイオ反応器に栄養塩７容液２Ｏｎ（
Ｎｉ成：クエン酸塩１水和′＃６ｇ 、 ＮａＪＰＯ４
２１１□０８８．４ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４６８ｇ、 （Ｎ
ｌｌｔ）２ＳＯＡ１６０ ｇ、ＣａＣ［、ｚ −２１１
２０１２ｇ−ＭｇＳＯ４・７Ｈｚ０１２ｇ、、Ｆｅ５０
４７＋＋□０１２ Ｖ、、Ｍｇ５Ｏａ ・１１□ＯＯ，
Ｌ５じ及びヘプタモリブデン酸アンモニウム０．．０３
６ ｇ及び脱イオン化水２０ρ）を加え、脱イオン化水
１０００ｃ♂中に分離したリン酸塩を殺菌して殺菌後に
添加し、ｐＨ値３．０．１２１ ”Ｃにおいて３０分間
殺菌し、３０゛Ｃに冷却した後に無菌パラフィンＳ （
Ｃｚ ８９％、Ｃ＋ｓ９％）１．６００ｇを加える。培
養液のｐＨ値を１０％Ｎ１１．０Ｉ＋溶液によってｐＨ
６，６に調節し、シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の２
４時間経過液内培養２０００−を接触した。増殖中ば液
内培養を最初は１０％ＮＩ＋４０１１溶液５ｏｏＪを用
いた滴定、ついで１０％Ｎａ０ＩＩ溶液を用いた滴定に
よるｐ１１調節階段によって自動的に、ｐ＋１６．６〜
ｐＨ７，２に常に維持し、３０℃、１１０００ｒｐの回
転数及び０．６２Ｖ／Ｖ／ｍの通風速度において空気を
供給した。増殖は１６８時間後に終了し、その後得られ
た液内培養を公知のやり方で酢酸エチルによって徹底的
に抽出した。有機抽出液を合わせて真空製ｋｉ’ｒ＋
シた。有機１１１抽出物は、再生利用するパラフィンＳ
（２００ｇ）の他に、ラムノリピドＬｌ１５Ｇｇ（全
ラムノリピドに関し一〇（ｉ５％）とラムノリピドＩ
８３ ｇ （全ラムノリピドに関して３５％）を含むも
のであった。
Ｎｉ成：クエン酸塩１水和′＃６ｇ 、 ＮａＪＰＯ４
２１１□０８８．４ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４６８ｇ、 （Ｎ
ｌｌｔ）２ＳＯＡ１６０ ｇ、ＣａＣ［、ｚ −２１１
２０１２ｇ−ＭｇＳＯ４・７Ｈｚ０１２ｇ、、Ｆｅ５０
４７＋＋□０１２ Ｖ、、Ｍｇ５Ｏａ ・１１□ＯＯ，
Ｌ５じ及びヘプタモリブデン酸アンモニウム０．．０３
６ ｇ及び脱イオン化水２０ρ）を加え、脱イオン化水
１０００ｃ♂中に分離したリン酸塩を殺菌して殺菌後に
添加し、ｐＨ値３．０．１２１ ”Ｃにおいて３０分間
殺菌し、３０゛Ｃに冷却した後に無菌パラフィンＳ （
Ｃｚ ８９％、Ｃ＋ｓ９％）１．６００ｇを加える。培
養液のｐＨ値を１０％Ｎ１１．０Ｉ＋溶液によってｐＨ
６，６に調節し、シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の２
４時間経過液内培養２０００−を接触した。増殖中ば液
内培養を最初は１０％ＮＩ＋４０１１溶液５ｏｏＪを用
いた滴定、ついで１０％Ｎａ０ＩＩ溶液を用いた滴定に
よるｐ１１調節階段によって自動的に、ｐ＋１６．６〜
ｐＨ７，２に常に維持し、３０℃、１１０００ｒｐの回
転数及び０．６２Ｖ／Ｖ／ｍの通風速度において空気を
供給した。増殖は１６８時間後に終了し、その後得られ
た液内培養を公知のやり方で酢酸エチルによって徹底的
に抽出した。有機抽出液を合わせて真空製ｋｉ’ｒ＋
シた。有機１１１抽出物は、再生利用するパラフィンＳ
（２００ｇ）の他に、ラムノリピドＬｌ１５Ｇｇ（全
ラムノリピドに関し一〇（ｉ５％）とラムノリピドＩ
８３ ｇ （全ラムノリピドに関して３５％）を含むも
のであった。
実施例 ４
シュードモナス属ＤＳＭ２８７４０：）埼殖転倒装置を
Ｄ１１τえたバイオ反応器に栄養塩溶液（組成：クエン
酸１水和物５ ｇ 、ＮａｚｌｌＰＯ，＋ ・２ Ｈｚ
ｏｌｌｏ ｇ 、 Ｈｌ□ＰＯ＜ ８５ ｇ −、（Ｎ
ｌｌａ）ｚｓＯｎ １５２．５ ｇ、ＣａＣＬｚ −２
１１２０１０ｇ、 Ｍｇ５Ｏｎ −７１１２０１０８，
ＩンｅｓＯｓ７ｕ２ｏ １ｇ、 Ｍｎ５０ｍ ’Ｈ２０
０，１２５ｇ１ヘプタモリブデン酸アンモニウム０．０
３ｇ及び脱イオン化水２２ｒ）を入れ−ｐＨ３，０，１
２１℃において３０分間殺菌し、３０℃に冷却後、５０
重里％の無菌グルコース溶液１０００ ｇを加え、１０
重量％のＮａ０ｌｌ溶液によってｐＨ値を６．８に調節
し、シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の２４時間経過液
内培養２５００Ｊを接種した。増殖中に１０％Ｎａ０１
ｌ；容液を用いる滴定によるｐＨｉＢ１節段階によって
、液内培養を自動的にｐＨ値６．８〜７．２に常に維持
し、３０°Ｃ１回転数１５０Ｏｒｐｍ及び通風速度０．
６２Ｖ／Ｖ／ｍにおいて空気を供給した。グルコースが
９時間後に消耗された後に、培養懸濁液から細胞塊を遠
心分１ｉｉ１［によって周知のように分離した。
Ｄ１１τえたバイオ反応器に栄養塩溶液（組成：クエン
酸１水和物５ ｇ 、ＮａｚｌｌＰＯ，＋ ・２ Ｈｚ
ｏｌｌｏ ｇ 、 Ｈｌ□ＰＯ＜ ８５ ｇ −、（Ｎ
ｌｌａ）ｚｓＯｎ １５２．５ ｇ、ＣａＣＬｚ −２
１１２０１０ｇ、 Ｍｇ５Ｏｎ −７１１２０１０８，
ＩンｅｓＯｓ７ｕ２ｏ １ｇ、 Ｍｎ５０ｍ ’Ｈ２０
０，１２５ｇ１ヘプタモリブデン酸アンモニウム０．０
３ｇ及び脱イオン化水２２ｒ）を入れ−ｐＨ３，０，１
２１℃において３０分間殺菌し、３０℃に冷却後、５０
重里％の無菌グルコース溶液１０００ ｇを加え、１０
重量％のＮａ０ｌｌ溶液によってｐＨ値を６．８に調節
し、シュードモナス属ＤＳＭ２８７４の２４時間経過液
内培養２５００Ｊを接種した。増殖中に１０％Ｎａ０１
ｌ；容液を用いる滴定によるｐＨｉＢ１節段階によって
、液内培養を自動的にｐＨ値６．８〜７．２に常に維持
し、３０°Ｃ１回転数１５０Ｏｒｐｍ及び通風速度０．
６２Ｖ／Ｖ／ｍにおいて空気を供給した。グルコースが
９時間後に消耗された後に、培養懸濁液から細胞塊を遠
心分１ｉｉ１［によって周知のように分離した。
細胞含湿塊０．９２ｋｇが得られ、これを−３２℃で保
存した。
存した。
実施例４によって得られた細胞含湿塊２０ｇをＯ，Ｓ重
重％のＮ ａ ＣＬ溶液ＩｏｏＪ中に懸濁させ、グリセ
リン４ｇを加え、この懸濁液を５００ Ｊエルレンマイ
ヤーフラスコに入れ、回転振とう装置上で３０°ＣＣ２
１Ｏ０ｒｐにおいて培養した。ｐＨ値はＩ ＮＮａ０１
１溶液によってｐＨ６，６に調節した。１６８時間培養
後に）認濁液を１００重重１１□ＳＯ４によってｐＨ値
２．０に調節し、酢酸エチルによって完全に抽出した。
重％のＮ ａ ＣＬ溶液ＩｏｏＪ中に懸濁させ、グリセ
リン４ｇを加え、この懸濁液を５００ Ｊエルレンマイ
ヤーフラスコに入れ、回転振とう装置上で３０°ＣＣ２
１Ｏ０ｒｐにおいて培養した。ｐＨ値はＩ ＮＮａ０１
１溶液によってｐＨ６，６に調節した。１６８時間培養
後に）認濁液を１００重重１１□ＳＯ４によってｐＨ値
２．０に調節し、酢酸エチルによって完全に抽出した。
有機抽出液を合わせて真空濃縮した。
有機粗抽出物は次のラムノリピドを含有するものであっ
た： ラムノリピド（１”） ４３０．０■ ６１，５％に相
当ラムノリピド （Ｕ ） １５６．８ｍｇ２２．４％
に相当ラムノリピド（Ｉｎ ）１０５．７■ １５．１
％に相当ラムノリピド（ＩＶ）７ｍｇ１ ％に相当％値
は得られたラムノリピド全量に占める各ラムノリピドの
％割合を表す。
た： ラムノリピド（１”） ４３０．０■ ６１，５％に相
当ラムノリピド （Ｕ ） １５６．８ｍｇ２２．４％
に相当ラムノリピド（Ｉｎ ）１０５．７■ １５．１
％に相当ラムノリピド（ＩＶ）７ｍｇ１ ％に相当％値
は得られたラムノリピド全量に占める各ラムノリピドの
％割合を表す。
実施例４によって得られた細胞含湿塊２０ｇを０．５重
量％Ｎ ａ ＣＬ ？８液１００Ｊ中に懸濁させ、ｎ−
パラフィン（ＣＩ４８９％、Ｃ１，９％）４ｇを加え実
施例５に述べたように培養した後抽出した。
量％Ｎ ａ ＣＬ ？８液１００Ｊ中に懸濁させ、ｎ−
パラフィン（ＣＩ４８９％、Ｃ１，９％）４ｇを加え実
施例５に述べたように培養した後抽出した。
有機粗抽出物は次のラムノリピドを含有した：ラムノリ
ピド （１） ６３９．６■ ４１％に相当ラムノリピ
ド（Ｈ） ６５５．２ｍｇ ４２％に相当ラムノリピド
（Ｉｌｌ） ２３４ ■ １５％に相当ラムノリピド（
ＩＶ） ３１．２■ ２％に相当ラムノリピドの収率は
それぞれ、全体量に関するものである。
ピド （１） ６３９．６■ ４１％に相当ラムノリピ
ド（Ｈ） ６５５．２ｍｇ ４２％に相当ラムノリピド
（Ｉｌｌ） ２３４ ■ １５％に相当ラムノリピド（
ＩＶ） ３１．２■ ２％に相当ラムノリピドの収率は
それぞれ、全体量に関するものである。
天妻超（−１
実施例４によって得られた細胞含湿塊２０ｇを０．５重
量％ＮａＣＬ溶液１００徒中に懸濁させ、ｎ−パラフィ
ン（ＣＩ４８９％、Ｃ１，９％）４ｇを加え、乙Ｖｌ瓜
を３７℃にした以外は実施例５に述へたように培養して
から抽出した。有機の粗抽出物はラムノリピド１４５０
■（全ラムノリピドに関して６２％）とラムノリピド１
１２７０■（全ラムノリピドに関して３７％）を含有し
た。ラムノリピド■と■は、全ラムノリピドに関して１
％未ン品であった。
量％ＮａＣＬ溶液１００徒中に懸濁させ、ｎ−パラフィ
ン（ＣＩ４８９％、Ｃ１，９％）４ｇを加え、乙Ｖｌ瓜
を３７℃にした以外は実施例５に述へたように培養して
から抽出した。有機の粗抽出物はラムノリピド１４５０
■（全ラムノリピドに関して６２％）とラムノリピド１
１２７０■（全ラムノリピドに関して３７％）を含有し
た。ラムノリピド■と■は、全ラムノリピドに関して１
％未ン品であった。
実施例４によって得られた細胞含湿塊４０［を０．９重
量％ＮａＣＬ溶液４０．Ｊ中に懸濁させ、この）！、＠
液を１ｄ拌しながら、３重重％アルギン酸ナトリウム水
？ｇ ｔａ ３６ｏ Ｊ中に移し入れた。
量％ＮａＣＬ溶液４０．Ｊ中に懸濁させ、この）！、＠
液を１ｄ拌しながら、３重重％アルギン酸ナトリウム水
？ｇ ｔａ ３６ｏ Ｊ中に移し入れた。
このようにして得られた懸濁液を攪拌しながら２重量％
ＣａＣＬｚ溶液６０〇−沖に滴加した。
ＣａＣＬｚ溶液６０〇−沖に滴加した。
イオノトロピー架橋が４０分後に終了した汲に、平均直
径１．５關を有する粒状物を濾過した。このようにして
得られた固定化細胞を、グリセリン２重重％、ＮａＣＬ
Ｏ，２５重量％及びＣａＣＬｚ Ｏ，０３７重量％を
含む水溶液中で３０℃、ｐＨ値６．８において７０１１
、！Ｉ間１１゛１養した。この固定化細胞むＪ： Ｈｏ
ｇ過して、新たに生物反応触媒として用いることかでき
るものである。水性ｌ原液を実施例５と同様に抽出した
。有機粗抽出物はラムノリピド＋ １８３０■（全ラム
ノリピドに関して６１％）、うｌ、ノリビド１１６３０
ｍｇ （全ラムノリピドに関して２１％）、ラムノリ
ピド”■４８０■（全ラムノリピドに関して１６％）及
びラムノリピドＩＶ６０ｍｇ（全ラムノリピドに関して
２％）を含有した。
径１．５關を有する粒状物を濾過した。このようにして
得られた固定化細胞を、グリセリン２重重％、ＮａＣＬ
Ｏ，２５重量％及びＣａＣＬｚ Ｏ，０３７重量％を
含む水溶液中で３０℃、ｐＨ値６．８において７０１１
、！Ｉ間１１゛１養した。この固定化細胞むＪ： Ｈｏ
ｇ過して、新たに生物反応触媒として用いることかでき
るものである。水性ｌ原液を実施例５と同様に抽出した
。有機粗抽出物はラムノリピド＋ １８３０■（全ラム
ノリピドに関して６１％）、うｌ、ノリビド１１６３０
ｍｇ （全ラムノリピドに関して２１％）、ラムノリ
ピド”■４８０■（全ラムノリピドに関して１６％）及
びラムノリピドＩＶ６０ｍｇ（全ラムノリピドに関して
２％）を含有した。
特許出願人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも１種類の同化可能な炭素源を含む水性培
地内での４を超えるｐ１直ならびに３０°Ｃ以上の温度
におけるシュードモナス属微生物によるラムノリピドの
製造方法において、微生物として水サンプルから単離し
たシュードモナス属ＤＳＭ２８７４の菌株を６．７〜７
゜３のｐＨ値及び３０〜３７°Ｃの温度において用いる
ことを特徴とする方法。 ２１種類の同化可能な炭素源を含み、窒素含量を制限さ
れた栄養素溶液内の好気性条件下でシュードモナス属Ｄ
ＳＭＺ ８７４を増殖さセ、次に液内培養からラムノリ
ピドを単離することを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ３１種類の同化可能な炭素源を含み、Ｍ ｇ ２−イオ
ンを制限された栄養素溶液内の好気性条件下でシュード
モナス属ＤＳＭ２８７４を増殖させ、次に液内培養から
ラムノリピドを単１チ１１することを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ４１種類の同化可能な炭素源を含む栄養素溶液内の好気
性条件下でシュードモナス属ＤＳＭ２Ｂ７４を増殖させ
、次に培養液から細胞含湿塊を分離して、希薄な塩化す
ｌ−ＩＪウム溶液中に懸濁させ、同化可能な炭素源を添
加した後、ｐＨ一値を６．０〜６．８に常に維持しなが
ら、３０〜４０℃の温度において培養し、次に強い無機
酸の希薄な溶液によって懸濁液のｐＨを約２．０に調節
した後、この懸濁液からラムノリピドを単離することを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 培養液から分離した細胞含湿塊を希）Ｗな塩化ナト
リウム溶液に懸濁させる前に、−３０〜−３５℃の温度
に保持することを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
の方法。 ６ 細胞含湿塊を塩化ナトリウム溶液に懸濁させてから
培養に続いて、細胞含湿塊を液相から分離して、再び同
様に塩化ナトリウム溶液に懸濁させて培養し、一方液相
からはラムノリピドを単離することを特徴とする特許請
求の範囲第４項または第５項に記載の方法。 ７１種類の同化可能な炭素源を含有する栄養素溶液内の
好気性条件下でシュードモナス属ＤＳＭ２８７４を増殖
させ、次に培養液から細胞含湿塊を分離して、希薄な塩
化す１−リウム溶液中に）Ｖ、濁させ、この懸濁液中に
アルギン酸ナトリウム溶液を攪拌しながら加え、次にこ
の’、”！、 ？！ｉ：ｉ液を攪拌しながら、未飽和の
塩化カルシウム溶液中に滴加し、粒状物が形成されるま
でさらに攪拌を続シリ、この粒状物を液相から分離し、
塩化カルシウム少量と同化可能な炭素源とを含む塩化ナ
トリウム溶液に加え、３０〜４０℃の温度において６．
５〜６．８のｐＨ値を維持させながら培養し、次に粒状
物を液相から分離し、この粒状物からラムノリピドを単
離さゼるごとを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ８ 培養後に液相から分離した粒状物を新た乙こ培養す
ることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 分子内にただ１個のβ−ヒドロキシデカノイル残ム
（を有し、分子量が３３４〜４８０であることを特徴と
するラムノリピド。
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| DE19843405664 DE3405664A1 (de) | 1984-02-17 | 1984-02-17 | Verfahren zur biotechnischen herstellung von rhamnolipiden und rhamnolipide mit nur einem ss-hydroxidecancarbonsaeurerest im molekuel |
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|---|---|
| JPS60188092A true JPS60188092A (ja) | 1985-09-25 |
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