JPS60210929A - 耐除草剤性植物 - Google Patents

耐除草剤性植物

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JPS60210929A
JPS60210929A JP60042022A JP4202285A JPS60210929A JP S60210929 A JPS60210929 A JP S60210929A JP 60042022 A JP60042022 A JP 60042022A JP 4202285 A JP4202285 A JP 4202285A JP S60210929 A JPS60210929 A JP S60210929A
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JP
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herbicide
sorghum
plant
resistant
tissue culture
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JP60042022A
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ポール・カーチス・アンダーソン
ケネス・エイ・ヒバード
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MOREKIYURAA JINETEIKUSU Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は植物、植物組織及び種子において耐除草剤性を
与える遺伝子及び酵素に関する。特に本発明は、耐除草
剤性があり且つこの特性をその子孫に遺伝的に伝える農
業経済的に重要な作物を含む。
作物中の雑草又は植物を駆除するために除草剤を用いる
ことは広〈実施されるようになった。現在これらの除草
剤の市場は年間１億ドルに達している。この多量の使用
にも拘らず、雑草の駆除は農家にとって依然重大で、費
用のかかる問題である。
今日、単独で或いはタンク混合物で使用される除草剤は
、効果的ならしめるために慎重な取り扱いを必要とする
。施用時期と方法及び雑草植物の発育段階は、除草剤を
用いて良好な雑草駆除をするために厳密である。いくつ
かの雑草種は今日の除草剤に対して単純に耐性をもって
いる。それ故に、効果的な除草剤の製造は、特に他の雑
草が駆除され、従って競争相手がなくなるにつれて、年
々重要になってきている。ここに多量の限界すれずれに
効果的な除草剤を適用すれば、その除草剤に敏感な作物
の連作を妨害する化学物質が土壌中に残留するから、続
く年にその作物を生育させることが危うくなる。
他の除草剤は、作物畑の雑草を直接駆除するのに使用さ
れないけれど、鉄道や工業地域の雑草を完全に駆除する
ために「全植物駆除剤」として使用される。これらの除
草剤は水の流出又は他の自然現象により作物の植えつけ
られた場所に貯まるかもしれない。即ち、全植物駆除剤
を用いた土地からのその流出によって影響された畑では
、敏感な作物は死滅し或いはその生長が著るしく損われ
る。
大きい能力、広い範囲の雑草駆除及び土壌中での迅速な
分解は、これらの問題にかなりの衝撃を与えるであろう
。不幸なことに、これらの化合物は大きい作物に対する
植物毒性も有する。該化合物に対する耐性をもつ作物の
雑種又は変種は、該化合物を作物に対する損傷の危険な
く使用しうるという点で魅力的な解答を与えてくれよう
。
植物種とは関係なく、殆んどの組織培養計画に当てはま
る多くの共通の特徴がある。細胞及び組織培養の技術は
広く開発されており、双子葉植物の組織培養物の生長、
代謝及び分離については多くの研究がなされてきた（Ｙ
ａｍａｄａ、　１９７７、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、Ｔｉ
５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。
Ｒｅ１ｎｅｒｔ及びＢａｊａｊ編、１４４〜１５９頁、
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　、　Ｂｅｒｌｉｎ）
。しかしながら、植物の再生に至る単子葉植物（例えば
、穀類作物例えばモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、
コウリャン、カラスムギ、ライムギ及びキビ）に関する
組織培養の研究は、双子葉植物の場合はど成功裡に報告
されていない。その成功は、適当な遺伝子型の並びに生
理的及び発育状態の植物に由来する供与体組織を培養の
開始に当って選択したかどうかにしばしば依存する。明
らかにＭ侠である他の特徴は、生長媒体の有磯及び無機
組成、才だ培養体の生長する物理的環境を包含する。
モロコシ（ｍａｉｚｅ）において、植物の再生可能な組
織培養の開発は適当な遺元子型及び供与体組織の同定後
に達成される（Ｇｒｅｅｎ及びＲｈｏｄｅｓ、１９８２
年、Ｍａｉｚｅ　ｆｏｒ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓ
ｅａｒｃｈ　、Ｗ、　Ｆ、　８ｈｅｒｉｄａｎｉ４．３
６７〜３７１頁、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉ−ａｔｉｏｎ　、Ｃｈａｒ
ｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）。モロコシの組織培養
から植物を再生する開発された第１の方法は、未成熟な
胚を供与体組織として使用した。
Ｎ６又はＭＳ成長媒体（後述）及び合成オーキシン例工
ば２，４−ジクロルフェノキシ酢酸（２゜４−Ｄ）を用
いる場合、組織培養物は胚の胚盤から迅速に発育する。
得られる培養物は発育に従つて不均一となり、種々の組
織型を含む。生長媒体から２．４−Ｄを除去すれば、こ
れらの培養物は多数の再生された植物を生産できる。こ
の型の培養物は３年までの間植物を再生しうろことがわ
かった。
モロコシの再生しうる培養物の基となる他の供与体組織
は未成熟のふさ状花序である。この組織は雄花であり、
それが成熟するにつれて花粉を生産するようになる。培
養物の再生の起源となる穀類中の未成熟な胚、花序、及
びいくつかの他の組織はすべてが若いという共通の特性
をもっている。
組織培養から得られる再生された植物は、温室、生長室
、又は畑において成熟するまで生長される。
再生された植物との交配で作られた子孫の種子から、続
く世代の評価が可能である。トウモロコシに対して開発
された基本的な組織培養法が多くの他の穀類種に拡張さ
れてきた。
近年の興味ある進歩は、モロコシの組織培養における体
腔胚形成の存在であった。体腔胚形成は、カルス（ｃａ
ｌｌｕｓ）、懸濁液、又は原形質培養物からの細胞が種
子中で形成される受精胚と同様に完全な胚に発育する過
程である。今や、２つの重要な特性を有するトウモロコ
シの培養を、信頼性をもって開始することが可能である
。１つはカルス培養物が脆いことであり、これはそれが
組織的に軟かく、弛んでいることを意味する。この性質
はこの種の培養物が急速に生長するから重要であり、ま
たそれは懸濁液細胞培養の開始を容易にする。
これらの脆い培養物の他の有用な寄与は、それが非常に
多数の体腔圧を形成しつることである。顕微鏡検査によ
ると、多くの小さい有機化された構造がカルスの表面に
存在していることがわかる。
これらの構造は種々の発育段階における若い体腔圧であ
る。これらの脆い培養物は２年もの長い間その胚形成能
力を保持し、また非常に多数の体腔圧を生成する能力を
示すであろう。
これらの脆いカルス中での体腔圧は、培養物を、５〜６
チのスクロースを含有し且つホルモンを含まない媒体に
移した時に成熟するまで発育する。
この媒体で約２週間の生長の後、多くの胚は完全に成熟
する。それは迅速に発芽し、２％スクロースを含有する
ＭＳ又はＮ６媒体上に置いた時、植物にまで発育する。
次いでこの植物は土壌に定着し、成熟するまで生長する
。
現在、高度の遺伝子変異性は植物の組織培養から回収で
きることが良く報告されている。培養した植物細胞にお
ける自然の遺伝子変異性は突然変異の結果であってよい
ことも良く報告されている（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ　ａｎｄ
　Ｃａｒｌｓｏｎ　、　ｌ　９８２年、Ｈｅｒｂｉｃｉ
ｄｅ　Ｒｅ５ｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ＰｌａｎｔｓＬｅ
ｂａｒｏｎ及びＧｒｅｓｓｅ１編、２７５〜２９１頁、
Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、ＮＹ）。突
然変異の頻度は化学的又は物理的変異誘発素を用いて増
加させることもできる。この変異性のシ）＜つかは農政
的に重要である。耐病気性の突然変異体は、砂糖キビの
フィージー病、ジャガイモの初期及び後期胴枯れ病、及
びモロコシの南方トウモロコシ葉枯れ病について得られ
ている。イネ、モロコシ及びコムギでは、植物の品種改
良の興味をもつ単一の遺伝子として遺伝される体質、例
えば種子の付く時期及び成熟の時期、種子の色及び発育
、植物の高さ、植物の形態、及び受精率を含む体質に関
してかなりの変異体が回収されている。
モロコシの組織培養は、下記の如く耐病気性及びアミノ
酸過生産に対する突然変異体を回収するために使用され
てきた。
モロコシのテキサス種の雄の不妊細胞質（ｃｍｓ−Ｔ）
の遺伝子型は菌Ｈｅ１ｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍｍａ
ｙｄｉｓ　ａＴによって作られる病毒床に敏感であり、
一方正常の細胞質（Ｎ）遺伝子型はそれに耐性がある（
Ｇｅｎｇｅｎｂａｃｈら、１９７７年、ｐｒｏｃ。
Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、　７４
．５１１３〜５１１７）。
同様に、ｃｍｓ−Ｔ　遺伝子型から得られる組織培養物
は病毒素化敏感であり、一方Ｎ遺伝子型培養物は耐性が
ある。Ｈ，ｍａｙｄｉｓ種Ｔからの病毒床は、致死量以
下での選別法を用いて耐性細胞系統を敏感なｃｍｓ−Ｔ
培養物から選別するために使用される。選別圧力を増し
て５回サイクルさせた後、致死量の病毒床に耐性のある
細胞系が回収できる。これらの細胞系統から再生される
植物も病毒床に耐性があり、雄不知である。耐性の雄不
妊植物から得られる子孫の遺伝子分析は、両方の性質が
母性遺伝されることを示す。Ｈ，ｍａｙｄｉｓ種Ｔ胞子
を用いての植物の感染は、耐病毒素性に対する選別の結
果、植物が病原有機体に耐性となるということを示す。
モロコシの組織培養におけるリシンとスレオニンの等モ
ル濃度（ＬＴ）による生長禁止に対する耐性の選別は安
定な耐性系ｉ、’ｒ１ｇを与える（Ｈｉｂｂｅｒｅｄ及
びＧｒｅｅｎ、　１９８２年、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９．
５５９〜５６３　）。
ＬＴ１９から再生される植物の子孫の遺伝子分析は、耐
ＬＴ性が単一の優勢な核遺伝子として遺伝されることを
示す。耐性胚に基づく組織培養物は、ＬＴに敏感な胚か
らの培養物よりも生長の禁止のために５〜１０倍高量の
ＬＴを必要とする。ＬＴ１９における耐ＬＴ性は、根及
び芽の生長の、ＬＴの存在に対する感性の減少として表
現される。
スレオニンの自由な蓄積は、それぞれＬＴに敏感な胚及
び植物からの培養物及び核と比べて、耐ＬＴ性の植物の
未成熟な胚に基づく培養物において６倍、またＬＴ１９
に対するホモ接合性の核において７５〜１００倍増大す
る。遊離のスレオニンの過生産はホモ接合性のＬＴ１９
核の全スレオニン含量を３３〜５９％だけ増大させる。
結果は、組織培養法で選別される耐ＬＴ性は遺伝され、
そして培養物、実生、及び核において表現されることを
示す。
植物が除草剤に耐性となる或いはそれを許容するには３
つの一般的な機作がある。これらの機作は、除草剤の作
用部位における鈍感性（普通酵素）、除草剤の迅速な代
謝（共役又は分解）、或いは除草剤の貧弱な捕捉及び転
位を含む。除草剤の作用部位を敏感形から鈍感形に変え
ることは、敏感な植物種に耐性を付与する好適な方法で
ある。これはこの性質の耐性が、１つの遺伝子に暗号化
された主な性質となり、また丁度側々の化学物でなくて
、単一の作用部位を分配する全化合物の同族体を包含す
るようであるからである。それ故に、除草剤の作用の生
化学的部位及び機作に関する詳細な情報は非常に重要で
あり、これは２通りで使用することができる。第一に、
情報は適当な除草剤に耐性の変種を効果的に同定し且つ
分離するための細胞選別方策の開発に使用することがで
きる。
第二に、それは選別に由来する変種細胞系統及び再生さ
れた植物を特徴づけるために用いられる。
組織培養法は、多・種類の除草剤及び植物種一本川いる
ことにより耐性（又は許容）に対して選別するために使
用されてきた（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ及びＣａｒ−１ｓｏｎ
、　１９８２年、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ　Ｒｅ５ｉｓｔａ
−ｎｃｅ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ、Ｌｅｂａｒｏｎ及びＧ
ｒｅｓｓｅ１編、２７５〜２９１頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ
ｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ。
ＮＹ、の総説を参照）。これらの研冗の結果は、除草剤
の許容性が安定に遺伝され且つ選別した耐性培養物から
再生された植物の子孫に表現されるう かされないかに基づいて２つの範ちａＣ分けることがで
きる。この基準は選別した性質の突然変異性を明らかに
する。多くの組織培養の研究は、人参、タバコ及びコゴ
メハギ中の２，４−ジクロルフェノキシ酢酸（２，４−
Ｄ）、タバコ中のアミトール、セロリ中のアスラム（ａ
ｓｕｌａｍ）、及びタバコ中のバラクワットに対する許
容性の選別のために行なわれてきた。これらのいずれに
おいても、耐性の性質の突然変異性は遺伝子分析によっ
て立証されてない。それ故にこれらの研究は、耐性を表
現する性質を子孫に伝える除草剤に耐性の突然変異性植
物を生産するための、組織培養選別法の可能性を示す証
拠を殆んど与えていない。
しかしながら、組織培養法が除草剤に耐性の突然変異体
を得るために利用できるという証拠を示す３つの研究が
ある。ペンタシン（ｂｅｎｔａｚｏｎ）及びフエンメジ
ファＡ　（ｐｈｅｎｍｅｄ　ｉｐｈａｍ）に対する許容
に関して選別したタバコは、耐性の植物を産する（Ｒａ
ｄｉｎ及びＣａｒｌｓｏｎｌｌ　９７８、Ｇｅｎｅｔ。
１（ｅｓ、、　Ｃａｍｂ、、３２　：　８５〜９０　）
。再生された植物からの子孫の遺伝子分析は７、Ｆ２世
代において、８つのペンタシン及び２つのフェンメジフ
ェンに対して選別された系統で耐性に対する遺伝子に基
づく性質を確証するデータを与えた。Ｆ２の分離比は２
つの遺伝子を示すペンタシン（ｂｅ−ｎｔａｚｏｎ）系
統を除く系統の殆んどに対して単一の遺伝子の劣性突然
変異を示した。
Ｃｂａｌｅｆｆ及びＰａｒｓｏｎｓ　（１９７８年、Ｐ
ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ　、　７５
．５１０４〜５１０７）はタバコの懸濁液培養からピク
ロラム（ｐｉｃｌｏ−ｒａｍ）に耐性の突然変異体を分
離するために組織培養選別法を用いた。植物は選別した
７つの耐性系統のうぢ６つから再生される。ピクロラム
に対する耐性は、これらの系統の４つが子孫に伝達され
、植物とカルス組織の双方において表現される。
すべての４つの場合、分離比は主な単一遺伝子突然変異
から予想されるものである。更にこれらの突然変異体の
２つは遺伝子分析によると関連していることがわかる。
パラクワツ）　（ｐａｒａｑｕａｔ）の野生型細胞に対
する致死量濃度において、生長する能力に関してトマト
のカルス系統を選別した（Ｔｈｏｍａｓ　ａｎｄＰｒａ
ｔｔ、　１９８３年、Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ
ｎｅｔ。
６３．１０９〜１１３）。分離した１９のバラクワット
に耐性のカルス系統のうち９つから２倍性の植物が再生
される。これらの再生された植物から新しいカルス培養
を始めると、これは央型的にはバラクワットに対する耐
性において野性型よりも少くとも３０倍の耐性を示す。
再生された植物の性的な子孫に基づくカルス系統に関す
る試験は、３つの系統のバラクワットに耐性の表現型が
主な核突然変異に由来することを示す。バラクワットの
噴霧実験では、耐性系統の１つだけにおいて、僅かな耐
性が植物レベルで表現されることがイつかる。
イミダゾリノン類、特に２−（２−イミダプリン−２−
イル）ピリジン及び２−（２−イミダシリン−２−イル
）キノリン、又はこれらの誘導体の広い範囲の化合物が
除草活性を示す。参照例えば、発明者Ｌｏｇ及び申請者
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａ−ｍｉｄ　Ｃｏ、による
ヨーロッパ特許願第８１１０３６３８、１号。
この明細書に記述されている特に興味ある除草剤の例は
、２−（５−イソプロピル−５−メチル−４−オキソ−
２−イミダシリン−２−イル）ニコチン酸（ＡＣ２４３
，９９７）、２−（５−イソプロピル−５−メチル−４
−オキソ−２−イミダシリン−２−イル）３−キノリン
カルボン酸（ＡＣ２５２，２１４）、〔５−エチル、２
−（５−イソプロピル−５−メチル−４−オキソ−２−
イミダシリン−２−イル）ニコチン酸（ＡＣ２６３，４
９９）、及びこれらの酸付加塩である。
本明細書において引用する目的のために、廐ぐ上に記述
した除草剤及び構造的に関連する除草剤化合物は、まと
めてイミダブリノン又は除草剤のイミダゾリノン同族体
として言及される。
ある種のスルホンアミド類は、植物に対して一般的且つ
選択的な除草活性を示す。そのような除草剤スルホンア
ミドは少くとも次の番号の米国特許に開示されている： ４．４３５２０６　４，３７０，４８０　４，３０２．
２４１４．４２４，０７３　４，３７０，４７９　４，
２９３，３３０４．４１７，９１７　４，３６９．３２
０　４，２５７，８０２４．３９８，９３９　４，３６
９，０５８　４，２３１，７８４４．３９４，５０６　
４，３６８，０６７　４，２２５，３３７４．３９１，
６２７　４，３４８．２１９　４，２２１，５８５４．
３８３，１１３　４，３４２，５８７　４，２１４，８
９０４．３７８，９９１　４，３３９，２６７　４，１
９０，４３２４．３７２，７７８　４，３３９，２６６
　４，１６９，７１９４．３７１，３９１　４，３１０
，３４６　４，１２７，４０５特に興味ある１つのその
ような除草剤スルホンアミドは２−クロル−Ｎ−［（４
−メトキシ−６−メチル−１，３，５−トリアジン−２
−イル）アミノカルボニル〕ベンゼンスルホンアミドで
あり、クロルスルフロンとしても公知である。
本明細書において引用する目的のために、直ぐ土に言及
した除草剤及び構造的に関連する除草剤化合物は、まと
めて除草剤スルホンアミドとして言及される。
本発明は、通常では植物、植物組織及び植物の種子の生
長及び発育を禁止する濃度の除草剤による禁止に耐性を
示す農業経済的に重要な該植物、植物組織、及び植物の
種子に関する。本発明は双子葉植物、単子葉植物を含む
が、但しこれに限定されない農業的に重要な作物、特に
穀類作物例えばイネ、モロコシ、コムギ、カラスムギ、
コウリャン、カラスムギ、ライムギ、キビなどに耐除草
剤性を付与することを意図する。
特に本発明は、通常変質前では酵素活性を禁する濃度の
除草剤によって禁止されるのに耐える酵素を含有する植
物、植物組織、及び植物の種子の生産法に関する。この
酵素、即ち変質されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（
ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、植物、植物組織及び種子におい
である種の除草剤に対する耐性を付与する。また本発明
は、この変質された酵素を製造し且つ利用するための方
法及び組成物、並びに耐性酵素を暗号化して有する遺伝
子に関する。本発明の１つの特別な具体例は除草剤の作
用の１次部位に変質を有する除草剤に耐性の細胞系統の
生産に関する。本発明は、耐除草剤性の特性を子孫に遺
伝的に伝達する除草剤に耐性のモロコシ系統を分離し、
特徴づけ及び開発するために、細胞培養技術を利用する
。
また本発明は、通常変質前では酵素の活性を禁止する観
閲の除草剤による禁止に対して耐性の変質されたアセト
ヒドロキシ酸シンターゼを暗号化した遺伝子を含む耐性
細胞系統からの植物、植物組織及び種子を生成せしめる
方法も提供する。
本明細書に揚足する実施例においては、ある種のイミダ
ゾリノン及び／又はスルホンアミド除草剤に（通常変質
してない酵素の活性を禁止する濃度において）耐性のあ
る新規な酵素、即ち変質されたアセトヒドロキシ酸シン
ターゼが記述される。
この酵素は植物、植物組織及び種子に耐除草剤性を伺与
する。この変質されたＡＨＡ８を表現するモロコシの遺
伝子型が記述される。このモロコシノ遺伝子型は、モロ
コシの生産において雑草を効果的に駆除するためにイミ
ダゾリノン又はスルホンアミド除草剤と共に使用するこ
とができる。
本発明は、更に本明細書に記述する化合物に対する耐除
草性が他のいろいろな機作によって付与されうるという
ことも意図している。例えば耐性は、真核有機体に制限
されなくて、無核有機体を含むいずれかの起源から得る
ことのできる酵素の暗号化された遺伝子によって付与さ
れ、或いはこれは全部が又は部分的に化学的又は酵素的
合成法によって作られうる。耐性の他の機作は前述した
通りである。
以下の詳細な記述は本発明の１つの具体例を表わすもの
と理解すべきである。この具体例は、植物、植物組織及
び種子を、耐性の必要な除草剤のスルホンアミド除草剤
に対して耐性ならしめる特別な酵素、即ちアセトヒドロ
キシ酸シンターゼにおける変質に関する。予期を越えて
、これらの植物、植物組織及び種子はある種のスルホン
アミド除草剤に対して耐性のあることも発見された。即
ち本明細書に開示される変質された酵素は、１次的作用
部位としてアセトヒドロキシ酸シンターゼを禁止する棟
々の除草剤に対して耐性を付与しうる。
第１図はロイシン、バリン及び、イソロイシンそれぞれ
１ｍＭの媒体補充をした（白丸）又はしてない（黒丸）
場合におけるＡＣ２４３，９９７の濃度の関数としての
モロコシ細胞の懸濁液培養での成長を示す。
第２図は植物中のロイシン、バリン及びイソロイシンの
生産に対する生合成経路を示す。
第３図はＡＣ２５２，２１４の存在又は不存夜において
生長した実生の芽の長さを示す。
第４図はＡＣ２５λ２１４の存在又は不存夜において生
長した実生の根の長さを示す。
本発明の具体例は、イミダゾリノン及び／又はスルホン
アミド除草剤による禁止に対して耐性のある酵素を含む
植物、植物組織、及び植物の種子に関する。該酵素は植
物、植物組織、及び種子に上述の除草剤に対する耐性を
付与する変質されたアセトヒドロキシ酸シンターゼであ
る。更に変質されたＡ　ＨＡ　８の暗号化された遺伝子
を含む植物、植物組織及び種子の生産法及びそのための
組成物が提供される。更に、ある種のイミダブリノン及
び／又はスルホンアミド除草剤に対して耐性の新規なモ
ロコシの遺伝子型を選別するための細胞培養選別法も記
述される。これらのモロコシ系統の生産は、これらのモ
ロコシ系統の分離、同定及び発育、そして除草剤に耐性
であるこれらの培養からの植物の再生を包含する。
本発明の方法は記述の目的のために次の部分に分割する
ことができる： （１）イミダブリノン類の除草剤の１次的作用部位の決
定；（２）イミダゾリノン除草剤の、モロコシの細胞培
養に及ぼす影響の特徴化及び耐除草剤性の細胞系統の選
別方式の決定；（３）　耐除草剤の細胞系統の選別及び
特徴化；（４）　耐除草剤性他物の栴生及び種子の生産
；そして（５）除草剤に耐える開業的な雑種の種子の開
発。
限定するものではないがイミダゾリノン類及びスルホン
アミド類を含む除草剤の、モロコシの組織における生化
学的な作用部位は、最初に植物毒性化合物に組織を露呈
した時、いずれの一般的な細胞代謝過程が影響されるか
を評価することによって決定される。次いで特異的な作
用部位を、影響された代謝過程内での個々の反応を試験
管内試験で評価して絞っていく。
１次的作用部位は、除草剤にさらした組織に対し、除草
剤によって影響される疑いのある過程の種々の生成物を
添加することによって決定することができる。除草剤の
生長禁止効果に逆行する生成物は除草剤によって影響さ
れる過程を示す。
組織培養法を用いる所望の除草剤に耐性の突然変異体の
効果的な選別は、選別条件の注意深い決定を必要とする
。これらの条件は細胞数の大量な生長を禁止しつつ、希
れな除草剤に耐性の細胞を生長且つ蓄積させるように最
適化される。この状態は、増殖中の個々の細胞の生活力
が隣る細胞の生活力に非常に依存するという事実によっ
て達成される。
細胞培養物を除草剤にさらす条件は、この化合物の組織
との相互作用を特徴づけることによって決定される。培
養中の細胞による該化合物の蓄積、及び媒体中且つ細胞
中の双方における該化合物の持続性及び安定性のような
因子を考慮する必要がある。またこの化合物の影響がそ
の除去後に容易に逆戻りするかどうかも重要である。
除草剤化合物の化学と関連する因子とは別に、その培養
物の生活力及び形態に及はす影響は注意深く評価する必
要がある。培養物の植物再生能ヵに衝撃を与えない除草
剤露呈条件を選択することは特に重要である。除草剤露
呈条件の選択は、除草剤が細胞を死滅させるか或いは単
に細胞分裂を禁止するかによっても影響される。
選別手順の選択は上述の考察に依存する。選択過程では
、簡単に以下に述べる手順のいずれかを利用することが
できる。但し本発明はこれらの方法に限定されるもので
はない。第１の手順では、液体懸濁液培養物中の微粉砕
された細胞を、短期間に亘って高除草剤量まで露呈する
。次いで生き残った細胞を回収し且つ貯め、次いで更に
長期間に亘って再露呈する。他に、統合され、部分的に
区別された細胞培養物を、最初の低除草剤量に連続的に
露呈して生長させ且つ２次培養する。次いでいくつかの
２次培養の度に除草剤の濃度を徐々に増加させる。
通常では有毒な除草剤量の存在下に良く生育することが
観察される細胞又は組織が回収されるまで選別を行なう
。次いでこれらの細胞「系統」を除草剤の存在下に繰返
し２次培養し、特徴づける。得られた耐性の量は、これ
らの細胞系統の生長を、種々の除草剤の濃度の存在下に
、選別してない細胞又は組織の生長と比較することによ
って生長される。培養した細胞の除草剤に耐える性質の
安定性は、選別した細胞系統を単に除草剤の不存在下に
種々の期間生長させ、次いで組織を除草剤に再露呈した
後の生長を解析することによって評価する。
本発明において、変質された除草剤の作用部位のために
耐性となった細胞系統は根本的に興味ある。細胞系統は
構造的に選別剤に関連する除草剤に対して耐性を試験し
てもよい。耐性の細胞系統は、試験管内での化学的検討
を用いて、除草剤の作用部位がより銃座な形態に変質さ
れたことを証明することにより評価してもよい。
変質された除草剤の作用部位を有するために満足な耐性
度を示す細胞系統を、植物再生手順に従って処置して、
耐性の体質を表現する成熟した植物及び種子を得る。こ
の植物の再生手順は、体腔胚を発達させ、続いて根及び
芽を生長させるものである。耐除草剤性の体質が植物の
分化した器官において表現され且つ分化されてない細胞
培養物においてだけ表現されないということを決定する
ために、通常では芽及び根の形成及び生長を禁止するで
あろう鼠の除草剤の存在下に初期の再生工程を行なう。
次いで体質を表現することの知られた細胞系統から成熟
した植物を得る。可能ならば、再生された植物は自家受
粉される。さもなければ再生植物から得られた花粉を交
配して、農業経済的に重要な同族交配した系統の生育植
物の種子を得る。他にこれらの同族交配した植物からの
花粉を用いて再生植物を受粉させてもよい。次いで第１
及び後続の世代の子孫における体質の分離を評価するこ
とによって体質の遺伝を特徴づける。組織培養で選別さ
れた体質の植物における遺伝及び表現は、体質を商業的
に有用ならしめる場合に特に重要である。
組織培養から再生された植物からの種子を畑に播き、自
家受粉させて純血植物を生じさせる。これらの植物から
の子孫は純血系統となり、これがある範囲の環境条件下
に畑において耐除草剤性が評価される。除草剤に対する
耐性は、除草剤を最も活性にならしめる畑の条件下に最
大の施用割合においてトウモロコシを保護するのに十分
でなければならない。適当な除草剤の濃度及び施用法は
、問題の除草剤に対して言及されているものである。
耐除草剤性のトウモロコシの商業的な価値は、多くの耐
性をもつ異なった雑種組合せ物が市販されている場合に
最大となる。農家は典型的には成熟性、自立性又は他の
農政的な体７質のような相違に基づく１種以上の雑種を
生長させる。更にトウモロコシ地帯の一部に適している
雑種は、成熟度、病気及び耐昆虫性のような体質に相違
があるために他の部分には適さない。この理由から、多
くの雑陣組合せ物が生産できるように、耐除草剤性を多
くの親糸に付与することが必要である。
耐除草剤性を農政的に選ばれた系統に付与することは、
耐除草性の遺伝子制御が理解されるならば最も効果的に
達成される。これは剛性の植物と敏感な植物を交配させ
ること、及びその体質が優性又は劣性として表現される
かどうかを確かめるために世代を隔離することにより遺
伝形式、含まれる遺伝子の数、そして１つ以上が表現に
必要ならば遺伝子に起こりうる相互作用を研究すること
、を含む。この遺伝子解析は農政的に選び抜かれた、し
かし敏感な系統を耐性系統へ転換するための初期の勢力
の一部となりうる。
転換過程（戻し交配）は、起源の耐性系統を敏感な選び
抜かれた系統により交配させ且つその子孫を敏感な親に
戻し交配さぜることによって行なわれる。この交配から
の子孫は、いくつかの植物が耐性遺伝子（Ｓｌを有し、
一方いくつかが有さないというように分離するであろう
。耐性遺伝子（Ｓ）をもつ植物を敏感な親に再び戻し交
配して子孫を得、もう一度耐性種と敏感種に分離する。
そして起源の敏感な親が耐性系統に転換され、但し敏感
な親に元々見出される如きすべての他の重要な属性を有
するまで上記過程を・繰返す。耐除草剤性系統に転換す
べき各敏感な選ばれた系統に対して別の戻し交配過程を
実施する。
戻し交配に続いて、新規な耐性系統及び良好な商業的雑
種を作る適当な系統の組合せを、耐除草剤性並びに一連
の重要な農政的体質に関して評価する。起源の敏感な系
統及び雑種の種類に対応する耐性系統及び雑種が作られ
る。これはその系統又は雑種が一般に商業的に生育され
るある範囲の環境条件においての評価を必要とする。満
足な能力を有する雑種の親糸統を増やし、標準的な雑種
の種、トウモロコシ生産法を用いることｌこ、雑種の生
産のために使用する。
一般に、組織培養において耐除草性に通じるＡＨＡＳの
変質又は置換、種子及び再生植物は本発明のこの具体例
において利用することができる。
ＡＨＡＳはいずれかの植物種において変質し又は置換す
ることができる；この場合除草剤が使用される農政的及
び園芸的作物は特に重要である。そのような植物は例え
ば単子葉植物及び穀類作物例えばモロコシ、イネ、コム
ギ、オオムギ、コウリヤン、カラスムギ、ライムギなど
を含む。ＡＨＡ　Ｓの変質は、限定するものではないが
次の方法を含む多くの方法のいずれかによって達成する
ことができる＝（１）組織培養中の自然の変異及び直接
的な突然変異の選別；（２）すべての種類、柚子及び植
物の組織培養における直接的又は間接的変異過程；及び
（３）分子生物学、化学技術、及びその他の技術及び耐
除草剤性遺伝子の植物中へて再導入を用いることによる
遺伝子の分離、複写、改変、或いは遺伝子の全体の又は
部分的な合成。
更に、植物に適用される化学化合物に対する耐性又はそ
の許容性における変化に通ずるＡＨＡ　Ｓ改質のいずれ
かの種を利用するこきができる。これらの変化は酵素構
造における変質を含み、酵素の表現及び／又は機能にお
いて変化を含む。化学化合物は、有機化学の技術によっ
て合成しうるものばかりでなく、植物中においてＡＨＡ
８活性に影゛坪しつる天然産の化合物例えばロイシン及
びバリンを含む。耐除草剤性は、いずれかの手段により
内生Ａ　ＨＡ　Ｓを、他の起源即ち、真核又は無機有機
体を含むがこれに限定されない起源からのいずれか他の
ＡＨＡＳと置換し又はこれを追加すること（即ち遺伝子
治療又は外来遺伝子の付加用こよって、或いはＡＨＡＳ
と同一の反応を触媒する遺伝子の全部又は一部分を化学
合成するによって達成することもできる。
Ａ　ＨＡ　Ｓを暗号化した遺伝子は、植物及び微生物に
おけるアスパルテート及び分岐鎖アミノ酸経路に共通で
ある。Ａ　ＨＡ　Ｓはアミノ酸ロイシン、バリン及びイ
ソロイシンの合成における第１段階を触媒する。ＡＨＡ
Ｓ活性は生合成径路の種々の最終生成物又は最終生成物
の組合せによって生体内で調節される。種々の調節特性
を有するＡＨＡＳ遺伝子は、これに限定されないが、大
腸菌、イースト掬及びパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ
）　を含む微生物から手に入る、これらはイミダゾリノ
ン除草剤に天然に耐性のあるＡＨＡＳ遺伝子を含んでい
てよい。例えばバクテリヤ大腸菌に存在するアイソチー
ム（Ｉ、Ｉｆ及び■）は試験管内で評価した時ＡＣ２４
３，９９７のミリモル濃度に対して新４感である。それ
故に大腸菌のＡＣ２４３，９９７号に関する耐性は、除
草剤の代謝の結果であるということと反対に、純感な作
用部位の結果であるように見える。他の有機体における
耐性は、同一の性質のようであり、耐除草剤性Ａ　ＨＡ
　Ｓを暗号化した遺伝子の種々の起源を提供する。すべ
ての３つの大腸菌アイソチームを暗号化した遺伝子は分
枝系であり、因果的系列である。植物の組織培養を含む
微生物又は植物におけるイミダゾリノン耐性の突然変異
体ＡＨＡＳ遺伝子に対する選別は、植物に移した時、耐
除草性の植物を生成する多様の遺伝子源を与えるであろ
う。
分離した遺伝子又は遺伝子群を植物細胞のゲノム中へ導
入するためには、十分な、ポスト遺伝子のベクトル系が
必要である。異質の異転子は変換された植物細胞中で表
現され、生産される細胞の次の世代まで安定に（体腔的
に及び性的に）伝達されるべきである。このベクトルは
、これに限定されないが、植物、動物、バクテリヤ、菌
又はウィルスを含む種々の起源から遺伝子を植物中に導
入し、維持し且つ表現することができるべきである。
更にベクトルを広い種類の植物に導入することも可能で
あるべきである。新規な遺伝子の、植物のゲノム中の位
置は遺伝的に処理した植物の有効な遺伝子表現を決定す
るのに重要でありうる。更に効果的であるためには、新
しい遺伝子は正常の遺伝によって子孫に伝えられなけれ
ばならない。
双子葉（広葉）植物例えばタバコ、ジャガイモ及びアル
ファルファにおいて外来の遺伝子の間接的な遺伝子的変
質及び表現は、アグロバクテリウム−’、／メファシｘ
　７　ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｕｕｍ　ｔｕｍｅ−ｆａ
ｃｉｅｎｃｅ）の腫瘍を誘導する（Ｔｉ　）プラスミド
のＴ−ＤＮＡを用いることにより、可能であることが示
された。組みかえＤＮＡ技術及びバクテリヤ遺伝子工学
を用いることにより、ＤＮＡのいずれかの外来部分をア
ミノバクテリウムのＴ　−ＤＮＡ中に挿入することがで
きる。該バクテリウム又はＴｉプラスミドによる感染に
続いて、外来のＤＮＡを宿主の植物のクロモシーム中に
挿入し、このようにして遺伝的に処置した細胞及び時に
遺伝的に処置した植物を生産する。第２の方法は根を誘
導する（Ｒｉ）プラスミドを遺伝子ペルトルとして導入
することである。ナグロバクテリウムは双子葉植物だけ
を攻撃するように見えるけれど、多くの重要な作物植物
（トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、カラスムギ
、モロコシ、キビ及びライムギ）は単子葉であり、アグ
ロバクテリウムによる変換に敏感であることが知られて
いない。しかしながら　Ｉｌｌ　ｉプラスミドは未来に
おいて単子葉植物に対してベクトルとして作用するもの
として敗り扱いうる。更にＴｉプラスミドをモデル系と
して用いるこＬにより、単子葉植物に対する遺伝子ベク
トルを人為的に構成することも可能でありつる。
Ｔｉプラスミド又は他のプラスミドは、ミクロ注入、或
いは単子葉植物の原形質体と植物の核ＤＮＡに統合され
うるＴ領域を含むバクテリヤのスフェロプラストとの間
の融合、のような人為的方法によって単子葉植物中に導
入してもよい。
植物の遺伝子工学は、除草剤に純然なＡ　ＨＡ　Ｓ酵木
の暗号化された機能性の遺伝子を含む所望のＤＮＡを、
限定するものではないが、以下のものを含む４１．ｆ々
の形態及び器官のＤＮＡ分子を用いて、植物組織又は細
胞中へ導入することによって達成することができる：植
物病原菌、例えばＤＮＡウソルス例えばＣａｕ目ｆｌｏ
ｗｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃウイルス（ＣａＭＶ）又はジエミ
ニウイ／ｌ／ス軸ｅｍｅｎｉｖｉｒｕｓ）、几ＮＡウィ
ルス、及びビロイズ（ｖｉｒｏｉｄｓ）　；オルガネル
（ｏｒｇａｎｅｌ　１ｅｓ）中のエクセトラクロモソー
ムＤＮＡ要素のような不安定な植物ゲノム成分（例えば
クロロプラスト又はミトコンドリア）に由来し、或いは
制御要素が核に暗号化されたＤＮＡ分子；安定な植物の
ゲノム成分（例えば複写の原型及び導入されるＤＮＡを
オルガネル又は核ゲノム中に統合せしめる且つ普通に複
写させ、普通に植物の細胞分裂及び性的再生中に分離さ
せ、また植物の連続した世代に遺伝させうる他のＤＮＡ
シーケンス）からのＤＮＡ成分。
Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃウイＪＬ／　ス
（ＣａＭＶ）は、ある槌の昆虫がウィルスを破壊するの
を防御しうる機能の遺伝子をもっている。この遺伝子の
残りの部分は余分であり、植物の置端に有用である遺伝
子で置き換えることができる。ジエミニウイルス（又は
ツウインウィルス）は双生の蛋白質カプセルで包まれた
ＤＮＡの２本のストランドからなり、外生の遺伝子を単
子葉植物に転移するために使用することができる。外生
の遺伝子を植物のＤＮＡ中へ運ぶためには、トランスボ
ソムも使用することができる。
Ａ　Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｓ　ｉ伝子を含有する］）ＮＡは、感
染性プラスミド、例えばＴｉ１ウイルス又はＡ、ツメフ
ァシェンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）のような微生
物により、リポソームの使用、機械的又はレーザ光法に
よるミクロ注入により、全クロモンーム断片により、及
び感染性植物ウィルスの作物への直接的な唱舖により、
植物細胞又は組織中へ直接供給し°Ｃもよい。
除草剤に耐性の植物は、上述の手段のいずれか、更に限
定するものではないが通常の遺伝的及び植物の繁殖法、
全植物の遺伝子法及び原形質体融合による体腔雑種化を
含む他の手段を用いることにより発育させることができ
る。
本発明の特別な具体例に従い、イミダゾリノン除草剤の
作用機構及び除草剤活性の１次作用部位が酌゛素アセト
ヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＩ（Ａｓ）であることが決
定された。イミダゾリノン除草剤に耐性のモロコシの組
織培養物を選別し、除草剤に耐性の植物をこれらの培養
物から再生した。変質したＡＨＡ８酵素を耐除草剤性培
養物において固定した。本発明の詳細な記述を以下に行
なう。
除草剤のイミダゾリノン同族体の生化学的作用機構の推
定を、以下９９７　（Ａｍｅｒ　１ｃａｎ　Ｃｙａｎａ
−ｒｎｉｄ　Ｃｏ、、　Ｐｒ１ｎｓｔｏｎ、　ＮＪ）と
して言及される除草剤化合物ＡＣ２４３，９９７［２−
（５−イソプロピル−５−メチル−４−オキソ−２−イ
ミダシリン−２−イル）−ニコチン酸〕を用いて行なっ
た。この化合物は、すべてではないが多くの高級な植物
線に植物毒を示す。
植物物質 Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ大学（ｓｔ、Ｐａｕｌ、　ＭＮ）　
、　Ａｇｒｏ−ｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｏ科、ＢｕｒｌｅＧｅｇｅｎｂａｃｈ博士から
、非再生性のブラック・メキ’／ｌｙ７−ス’）イー　
）　酔コー７　（Ｂｌａｃｋ　Ｍｅｘｉ−ｃａｎ　８ｗ
ｅｅｔ　Ｃｏｒｎ）の細胞懸濁液培養物（即ぢ、植物を
再生する能力に欠けた細胞培養物）を得た。
株の細胞培養物を、２，４−ジクロルフェノキシ酢酸（
２，４−Ｄ）　２ｗｑ／ｌを含有する液体のＭｕｒａｓ
ｈｉｇｅ及び８ｋｏｏｇ　（ＭＳ）媒体（Ｍｕｒａ−ｓ
ｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２年、Ｐｈｙｓｉｏｌ
。
Ｐｌａｎｔ、１５．　４７３）中に保持し、元の容量の
コτまで新しい媒体で希釈することによって１過間２次
培養した。培養物を、媒体１２５ｄを含有する５００１
のフラスコ中において２６℃で暗所中で生育させた。
９９７の生長禁止効果 均一な未分別の植物細胞培養物（即ち細胞懸濁液培養物
）は、生化学的レベルにおいて除草剤の作用機構を研究
するのに簡便な系を提供する。
９９７の、モロコシの細胞懸濁液培養物及び未成熟の胚
に由来するモロコシの実生に対する生長禁止効果の初期
の比較を行なった。この生長禁止の検討は、本発明の具
体例での除草剤作用の生化学のすべての研究において、
モロコシ細胞の懸濁液培養物とモロコシの実生が９９７
に対して同様の具合に応答するから、モロコシ細胞の懸
濁液培養物をモデル系として用いることを指示した。
生長禁止の検討を、試験媒体３　Ｑ　ｍｌを含有するフ
ラスコ１２５　＃Ｉｔ中で行なった。９９７を濾過収繭
し、冷〃νに、次いでオートクレーブに添加した。
試験０９体を細胞と共に接種して、懸濁液ＩＱｍ／当０
．２ｄの沈降細胞容量（遠心分離せずに１５分間）を得
た。６日又は７日間の生長後、沈降したＩＷｌｌ胞′縛
量を再び秤はした。
９９７の、モロコシの実生に及ぼす除草剤効果を、切り
取った成熟したモロコシの胚からの発芽及び実生の生長
を評価することによって決定した（Ｇｒｅｅｎ　、　１
９７４年、Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、　、　１４．　５４〜５
８）。種子を０．５％次亜塩素酸塩中で１０分間殺菌し
、次いで無菌の蒸留水中に２４時間浸した３成熟した胚
を無菌状態で切りとり、種々の濃度の９９７を有し１つ
２．４−Ｄを含まない固体のＭＳｉ体（寒天９％）上に
置いた。胚はその芽の軸を媒体から離して置いた。芽の
生長は７日後に定量化できた。
実生及び懸濁液培養物の生長は、媒体中において非常に
低いＤ度、即ち１〜３Ｘ１０”Ｍの除草剤で５０ｑ６禁
止された。異なる背景の６種のモロコシの繁殖系統、Ａ
１８８、Ａ６３２　（八ｌ’１ｎｅ−ｓｏｔａ　Ｃｏｒ
ｐ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　Ａｓ５ｏｃ、、　Ｓｔ。
Ｐａｕｌ、　ＭＮ）　；　Ｗｌ　１７　（Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ　ｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、
ＷＩ）；Ｂ３７、Ｂ７３（Ｉｏｗａ　Ｃｏｒｐ　Ｉｍｐ
ｒｏｖｅｍｅｎｔ　Ａｓ５ｏｃ、　）　；及びＭｏ　ｌ
　７　（Ｉｆ　１ｉｎｏｉｓ　Ｃｏｒｐ　Ｉｍｐｒｏｖ
ｅｍｅｎｔＡｓｓｏｃ、、　Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、　Ｉ
Ｌ）を試験し、評価の実験範囲内において９９７に対し
同様に敏感であることがわかった。非常に分化した実生
及び未分化のａ濁液細胞液は除草剤に対して高度の敏感
性を示した。これは植物の発育が敏感性の表現のために
必要とされず、またＩＩ！Ｌｉｉ渕液細胞が化合物９９
７の作用１ル、′４を決グピする基本的なイσＦ究に約
して使用できることを示唆した。
９９７のイ］ψ白′墳合成に及ぼす影・袢９９７の生陵
禁市（ｆ（：が細胞蛋白質合成に禁止効果を及ぼすかど
うかを決定するために実験を行なった。懸２蜀液培養の
Ｍ１＋　を准を、ｌＸ１０−６Ｍの９９７の存在又は不
存在下に４８時間予備培養し、次いでｌＯ係細胞容量／
懸制沿容量の細胞密度において、卸１胞０．　ｌ　ｍｌ
当り７５μＣｉの３５８−メチオニン（１２１ＯＣ１／
ミリモ／Ｌ／、Ｎｅｗ　ｌｉｉｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅ
ａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、’ＪＡ）又は３Ｈ−Ｄ　Ｌ　−ロ
イシン（ｓ　５　Ｃｉ　／ミリモル、ＩＣＮ　Ｐｈａｒ
ｍａｃｅ−ｕｆｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、　−Ｋ及びＫ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、　ＮＹ）に１２時間さらした。次
いで８１腓ルを３００　ｘｇの遠心分離にかけ、冷Ｍ、
Ｓ培養媒体で洗浄し、冷乳鉢及び乳棒で６Ｍ尿素ｌ容量
の存在下に粉砕した。得られた抽出物を１２８００ｘｇ
で５分間運上分雌にかけた。次いでこのペレットを再抽
出し、遠心分離後に抽出物を一紹にした。蛋白質を１０
％ｗ　／　ｖのトリクロル酸［（ＴＣＡ）を添加して沈
殿させた。蛋白質を遠心分離によって除去し、６Ｍ尿素
中に再溶解し、シンチレーション計数器により放射性物
の蛋白質中への導入を決定した。
ＩＸ　１０−’　Ｍの濃度において、放射性アミノ酸の
、ＴＣＡで沈殿させうる細胞成分中への導入を定量化す
ることによって決定される如く、９９７は蛋白質合成を
かなり禁止することがわかった。
異なる後続２次培養の間隔における細胞を用いての実験
では、蛋白質合成の禁止が細胞の新鮮な重量基準におい
て５０〜７７チの範囲にあった。
蛋白質の合成に及ぼす除草剤の影響が非特異的であるか
どうかを決定するために、１０％５１）８（ドデシル硫
酸ナトリウム）のポリアクリルアミド平板ゲル（Ｌａｅ
ｍｍｌ　ｉｌｌ　９７０年、Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８
０）に基づき且つフルオルグラフィーで（面認（データ
は示し“Ｃない）できる放射性標識を混入した平板を用
い、蛋白質を一方向での電気泳動で分離した。Ｑ、　４
　ｔｓｌの細胞容量を、上述の如＜ｌＸｌ０−’Ｍ　の
除草剤の存在又は不存在下に３１１８−メチオニンに露
呈し、乳鉢及び乳棒で粉砕し、次いでＳＤＳ試料緩衝”
ＪＬＯ，７５ａｔで抽出した。
この抽出物を遠心分離で清澄させ、２０μｍ又は４μｌ
の試料を直接ゲル中に負荷した。禁止は本質的に非特異
的であるように見えた。すべての主たる６Ｍ尿素に可溶
な細胞内蛋白質成分は減少した酸の放射性標識を示した
。
との関係 ９９７の、遊離のアミノ酸のプール・サイズ（ｐｏｏｌ
　５ｉｚｅ）　に及ぼす影響を解゛析して、アミノ岐代
謝の変員が蛋白質合成における変化と関連するかどうか
を決定した（４１表診照）。
１−１　’／／ ×ト 一　−−の　−〇　〇　哨　− ヘ マ １ト 区 幾淘液培養細胞を、ｌＸ１０’Ｍの９９７で３．５時間
又は４８時間処置した。＃ｌＩ］廁を許過によって懸濁
液から除去し、１ｙの新鮮物重喰のものを５％ＴＣＡ１
＊中において砂と共に乳鉢及び乳棒で粉砕した。５チＴ
　ＣＡ　４　ｙｔを添加し、抽出物を１００００Ｘ５＋
で１０分間−１１：ξ心分離にかけた。
このペレットを再抽出し、上澄液を一緒にし、カチオン
交換クロマトグラフィーに供した。試料を、５％′ｖＣ
Ａで予じめ平衡化したＢｏｎｄ　ｌｉ：１ｕｔＳＣＸカ
ラム（Ａｎａ　Ｉｙｔ　ｉｃｈｅｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ
　１ｏｎａｌＩｎｃ１Ｈａｒｂｏｒ　Ｃｊ　ｔｙ　、　
ＣＡ）に供した。試料の適用に続いて、カラムを５　ｔ
ｒｌの蒸留脱イオン水で洗浄し、アミノ酸を５　％　ｖ
　／　ｖ　トリエチルアミンで２　ｍ１画分ずつ流出さ
せた。両分を一緒にしく６期〆）、凍結乾燥し、次いで
Ｋｏｎｔｒｏｎ　Ｌｉｑｕｅｍａｔ謝アミノ酸分析機（
Ｉ［ｅｓｂｅｒ　、Ｍｉ　ｄｄｌｅｓｅｘ　’ｒｗ５０
ＱＵ　、　Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いてアミノ酸を分析し
た。
９９７は、培養中でのトウモロコシ組繊の生長において
、遊離のアミノ酸量に異なる影響を示した。９９７で処
理したＢｌａｃｋ　Ｍｅｘｉｃａｎ　ＳｗｅｅｔＣｏ　
ｒ　ｎの組織における全遊離のアミノ酸量は、対照の培
養物よりも増大した（第１表）。生合成的に関連するア
ミノ酸、セリン、メチオニン、及びシスティンは除草剤
の露呈中に最大の増加を受けた（それぞれ４８時間に亘
って３，８及び２４倍）。
しかしながら生化学的に関連するアミノ酸、ロイシン、
バリン、及びイソロイシンは、除草剤処理後に減少した
。除草剤露呈４８時間後に、これらのアミノ酸の量は、
未処置の細胞培養物中に見られる量の、それぞれ８，１
２及び３１チまで減少した。
細胞を試験して、除草剤に誘導される生長の禁止がこれ
らの３種の分岐鎖アミノ酸の減少した結果であるかどう
かを決定した。細胞を、１ｍＭ濃度のロイシン、バリン
及びイソロイシンを補充した或いは補充してない媒体中
において、有毒量（１ｘ１ｏ−’Ｍ）の９９７にさら七
た。アミノ酸補充物の不存在下及びｌＸ１Ｏ’Ｍの９９
７の存在下における培養物の生長速度は、除草剤を含ま
ない培養物のそれの１６チまで減少した。分岐鎖アミノ
酸の補充は、平均して対照培養物の９１俤の生長速度を
もたらした。これは除草剤で誘導される生長禁止の殆ん
ど完全な除去を示した。
次いで最大の除草剤保護を得るための、３種のアミノ酸
各の最適補充量を決定し且つ化合物の作用部位を洞県す
べく実験を行なった。用いた最も効果的な濃度組合せは
３穏のアミノ酸各の１ｍＭであった。ロイシン及びバリ
ン各の１ｍＭは最も有効な対の組合せであるように見え
、またバリンは単独の補充物として最も効果的であった
（第２表参照）。
これらの結果は、９９７で誘導された生長の禁止及び蛋
白質合成の禁止はアミノ酸ロイシン、バリン及びインロ
イシンの存在の減少であるということを示した。更に結
果は、主な９９７の作用部位がロイシン、バリン、イソ
ロイシンの生合成経路と関連することを暗示した。更に
これらの３種のアミノ酸を補充した媒体は、１×１０−
＆〜１×１０−５Ｍの濃度範囲の９９７の生長禁止効果
に逆行しうることがわかった。これはこの代謝過程が唯
一の重要な作用部位を含んでいることを示した（第１図
参照）。しかしアミノ酸は高濃度において毒性効果を示
すから、完全な逆行は得ることができなかった。
ロイシン、イソロイシン、及びバリン各１ｍＭを補充し
た媒体も、９９７に構造的に関連する化学物のイミダゾ
リノン類の２つの更なる化合物（ＡＣ２５２，２１４［
２−（５−インプロピル−５−メチル−４−オキソ−２
−イミダプリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸
、以下２１４として言及〕及びＡＣ２６３，４９９［５
−エチル。
２−（５−イソプロピル−５−メチル−４−オキソ−２
−イミダシリン−２−イル）ニコチン酸、以下４９９と
して言及］　）　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａ−ｍ
ｉｄ　Ｃｏ、、　Ｐｒ１ｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）の、細胞
懸濁液に及ぼす生長禁止作用に逆行しうる。この結果は
、上述の観察が９９７に独特でないことを示し、また該
化合物の全同族類が同一の作用と作用部位をもつことを
示した。
分岐鎖アミノ酸を用いる除草剤の構造的情報及び除草剤
毒性−こ対する逆行研究は、アセトヒドロキシ酸シンタ
ーゼが除草剤の作用部位であることを示唆した。
ＡＣ２４３，９９７の１次的作用部位は、多分ロイシン
及びバリンのピルベートからの生合成及びイソロイシン
のα−ケト酪酸からの生合成におけるある反応にあるＣ
第２図参照）。これらの経路においては４つの酵素が３
ｓのアミノ酸の各の合成に関与する。除草剤活性の最大
の軽減には、すべて３種のアミノ酸を補充した媒体が必
要であるから、これらの４つの酵素は除草剤の相互作用
に対する最も類似した部位である。更に、ＡＣ２４３，
９９７はロイシン及びバリンに類似の構造をもっている
。除草剤分子におけるイソプロピル及びカルボキシル残
基は、ロイシン又はバリン上の同等の残基と同一の空間
的配置で存在しうる。ピルベートからの経路における第
１の反応を触媒する酵素のアセトヒドロキシ酸シンター
ゼは、ロイシンとバリンをそれぞれ認識する２つの規制
結合部位を有するように見える。経路の最後の反応を触
媒するトランスアミナーゼは、多分反応の生成物ロイシ
ン、バリン及びイソロイシンに対しである親和性を有す
る基質結合部位を有する。上述の観察は、これらの２つ
の酵素が、以後の試験管内での研究に対する最も理にか
なった候補であることを意味する。次の節はイミダゾリ
ノンが試験管内においてＡＨＡＳの活性に影響すること
を示す研究を記述する。
評価はＳｍ１ｔｂら（１９７９年、Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ
。
Ｇｅｎｅｔ、ｌｅ’ｌ、２９９〜３１４）の方法を改変
して行なった。植物細胞の培養物を、０．０５Ｍ燐酸カ
リウＡ（ｐＨ７，０）、０．１　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、及
びｏ、　ｓ　ｍ　Ｍジチオスレイトールを含有する細胞
破壊媒体の等（１（Ｗ／Ｖ）中において、砂と共に冷乳
鉢及び乳棒で粉砕した。この調製物を１１，０００ｘｇ
で２０分間遠心分ｐ１１１こかけ、上澄液をＡＨＡＳ活
性ζこ対して評価した。この評価は、０．０５　Ｍ燐ｒ
Ｒ力ＩＪ　ラム（ｐＨ８，０）、４ｏｍＭピルベート、
５　ｍ　Ｍ　ＭｇＣＩ　２．　０．１　ｍ　Ｍピロ燐酸
チアミン、細胞抽出物０．２ｍＭ、及び種々の濃度の問
題の除草剤を含有する１１の容量中で行なった。反応混
合物を３０℃で７５分間培養し、反応を５０％（ｖ　／
　ｖ　）　Ｈ，８０４の添加で停止させた。　更に２０
分間４０℃に保温した後、酸性によってアセトラクテー
トから生成したアセトインを、Ｗｅｓ−ｔｅｒｆｉｅｌ
ｄ　（１９４５年、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
１６１．４９５）の方法を用いて定量化した。反応混合
物０，２ｄに、水０．８ａ＋ｊ、０．５％（ｗ／Ｖ）ク
レアチン０．５１、及び１０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ中５
％（Ｗ／Ｖ）ナフトール０．５　ａ／を添加した。混合
後、溶液を室温で１時間培養した。生ずる桃色を、５３
Ｑｎｍでの吸光を測定することによって定量化した。
モロコシ細胞の培養物からのＡＨＡＳ活性は、９９７に
より著るしく禁止されることがわかった。
酵素活性は８Ｘ１０−８Ｍの９９７によって５０％減少
した。ＡＣ２５２，２１４及びＡＣ２６３，４９９も酵
素活性を禁止した。このデータは、ＡＨＡＳがイミダゾ
リノン系除草剤の植物毒性活性の１次部位であるという
ことを強く示唆した。
イミダゾリノン除草剤の影響の特徴づけと耐除草剤性の
モロコシ細胞の選別法 植物再生能力を保持するモロコシ細胞培養の繁殖系Ａ１
８８植物（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ大学、ＣｒｏｐＩｍｐｒ
ｏｖｅｍｅｎｔ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）の、繁殖系
Ｂ７３植物（Ｉｏｗａ　州立大学）の花粉での受粉によ
って生産した雑種の未成熟な胚から、もろい胚形成のモ
ロコシ仮皮培養を開始した。胚が１．５〜２．０期の長
さに達した時に穂を刈りとった。全部の穂を、市販の漂
白剤（２，６３％ｗ　／　ｖの次亜塩素酸ナトリウム）
　５　Ｑ　ｖ　／　ｖ中において室温で２０分間表面殺
菌した。次いで穂を無菌の蒸留脱イオン水で洗浄した。
未成熟の胚を無菌分離し、根／芽軸を媒体にさらして、
栄養寒天の開始／保持媒体上に置いた。この開始／保持
媒体は、２％（Ｗ／ｖ）スクロース、２　、４−Ｄｌ、
５ｍｆ／ｌ。
５ｍＭプロリン、及び０．９％（Ｗ／Ｖ）寒天を有する
〜６基本媒体（Ｃｈｉｈ−Ｃｈｉｎｇ　、Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉ−ｎｇｓ　ｏｆ　Ｓｙｒｎｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　、　１９７８
年５月２５〜３０日、５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ　、
Ｐｅｋｉｎｇ　、　４３〜５０頁）からなった。
未成熟の胚を、純い光のもとて２６℃下に培養した。未
成熟の胚の圧盤からの細胞増殖を、もろいカルスの密度
及び良く定義された体腔胚の存在に対して評価した。こ
の形態を有する組織を、未成熟の胚を最初に処理してか
ら１０〜１４日後に新しい媒体に移した。次いで組織を
１２〜１６日毎にルーチン的に２次培養した。約１ｐの
大きさに達し且つ新しい媒体に移した組織片からは６〜
８グ量の組織が除かれた。２次培養では、正しい形態の
組織だけが保持されていることを確かめるために、常に
肉眼で注意深く監視した。体腔胚の存在は、培養が適当
な条件下に植物を生成するということを保証した。
イミダゾリノン除草剤による仮皮培養の生長禁止 モロコシは一般にダイズの後で畑で生育するから、モロ
コシの耐性を、９９７（全植物用化合物）よりも２１４
（ダイズ用除草剤）に関して選別することが理にかなっ
ているように見える。それ故に、２１４の影響をカルス
の生長について決定した。大きさで平均９０■の組織の
量を、０．００３〜３Ｗ／４の範囲の濃度の２１４を含
有する栄養寒天保持媒体に移した。８つの組織片を各プ
レート上に置き、除草剤の濃度当り３つのプレートとし
た。１４日間の生長後、組織を再び秤量した。
生長割合の禁止は０．１〜０．３■／ｌの２１４の濃度
範囲において最大の半分であることが発見された。細胞
の死滅は、試験した除草剤の濃度のいずれにおいても１
４日間にわたって観察されなかった。しかしながら、培
養物の形態変化が、生長速度の最大の半分までの禁止よ
りも大きい禁止を与える除草剤濃度で起こった。特に体
腔胚の形成の消失が明らかであった。
組織を同一のプレート上で１４日間以上除草剤の存在下
に生長させる、或いは同一の除草剤濃度を有する新しい
プレートに転移するという、１４日間以上の期間に亘っ
て行なった生長禁止の研究は、より小さい（３〜１０倍
）除草剤濃度に窓いて最大の半分の生長禁止効果を示し
た。それ故に除草剤の生長禁止効果は、時間と共に並び
に媒体中の除草剤の量の増加と共に増大した。この観察
は、除草剤が非常に永続的である、即ちそれは大程度ま
で代謝されず且つ組織中に蓄積するということを示した
。
２１４の可逆的影響 ２１４の影響が可逆的であるかどうかを決定するために
、液体懸濁液培養物中で生育する１３１ａｃｋＭｅｘｉ
ｃａｎ　Ｓｗｅｅｔ　Ｃｏｒｎ細胞を、７２時間までの
種々の期間にわたって０．０３■／ｌの２１４に露呈し
た。次いで細胞を除草剤を含まない媒体で洗浄し、生長
速度を除草剤の不存在下に再び評価　−した。細胞は急
速に禁止されてない生長速度に戻ることかわかった。除
草剤にさらしである間細胞は分裂しないが生きたままで
おり、一度除草剤が除かれると分裂を始めた。この除草
剤によって誘導される生長禁止の可逆性は、選別には与
えられた期間に亘る断続的な露呈と反対に、連続的な除
草剤の露呈を使用しなければならないことを示唆してい
る。　− 耐除草剤性の細胞系統の選別と同定 除草剤に耐性の細胞を固定し且つ分離するために用いた
選別の手順は次のことを考慮したものであった： ０）除草剤の効果は可逆的である；（２）除草剤の効果
は経時的に増大する；そして（３）高除草剤濃度は体腔
胚の発達及び潜在的には植物の再生能力に悪影響する。
それ故に、この方法は、組織をいくつかの２次培養間隔
に亘って低除草剤濃度に連続的に露呈すること及び選別
１こおいてすべての組織の生長を注意深く記録しつづけ
ることを含む。この方法において除草剤は、除草剤に耐
える細胞を経時的に蓄積させる連続的な選別圧力をもっ
て徐々に影響するが、植物の再生に対する能力には影響
しないようにした。この方法では少程度の除草剤許容性
（除草剤碌度において２〜３倍）の細胞が選別された。
耐除草剤性の細胞系統の選別 上述した選別手順を用いて多くの選別を行なった。同定
された１つのそのような耐除草剤性の系統の選別を以下
に詳純に記述する。
激シく生育するモロコシのカルス組織的１３９を、除草
剤２１４の０．０３Ｗ／４を含有するペトリ皿中の保持
媒体に転移した。３０のプレートを順備し、組織８０〜
９０ｍｙを各プレート上に５つの領域として植えつけた
。そして生長禁止の研究から、除草剤に最初２週間露呈
している間に２０〜４０％以下の生長禁止を与えるよう
に、除草剤の鼠を選択した。
１０日後に組織は４倍以上の蛍に増大した。激しい生長
速度と胚形成の形態保持（即ち体腔胚の存在）を示す組
織８０〜９０η片を０．０３ｍｆ／ｌの２１４を含有す
る新しい媒体で２次培養した。
プレート当り平均７つの組織片を含む３０のプレートを
準備した。組織の６片を標識し、「系統」の原種とした
。完全な遺伝系が保持され、これを将来の２次培養のた
めに記録した。続く２次培養の間隔は、カルス組織の全
生長に依存して１５〜３０日の範囲であった。
各転移に対して、生長と体腔胚の形成能力を示すすべて
の組織を新しい媒体上に置き、与えられた「系統」内の
均一な寸法のカルス片の数を記録した。選別過程中、除
草剤が中介する生長の禁止が強力になるにつれて、系統
の全数は減少する。
しかしながら多くの系統は大きさが増大する。５回目の
選別サイクルの終りに、２１４の量を０．１ｗｖ／Ｌま
で増大させて選別圧力を増加せしめた。
５回目及び６回目の選別サイクルの間、系統ＸＡ　１７
における組織の量はかなり増加しはじめた。増大した生
長速度を示す組織は、選別を開始した親組織と異なる形
態を有した。細胞は平均して小さく、細胞質遺伝的にＭ
であり、組織に黄色の色合いを与えた。この組織は、選
別における組織の大多数が系統ＸＡ　１７として同定さ
れるまで、後続の２次培養間隔に亘って迅速に生長しつ
づけた。７回目の２次培養において、系統ＸＡ　１７の
組織を同定の目的のために選別培養物から除いた。
この株組織を、０．１■／ｌの２１４を含有する上述の
保持媒体上に保持し且つ蓄積させた。
耐性細胞系統を、（１）耐性の程度；（２）耐性の化学
的範囲；及び（３）耐性に対する生化学的基準、を評価
することによって特徴づけた。
最初に系統ＸＡ１７が安定に生育する２１４の最大量を
決定した。０．ｌｙ／４の２１４の存在下に保持した株
組織を、３０■／ｌまでの範囲の量の２１４を含有する
媒体の転移した。次いで組織をいくつかの２次培養間隔
の間保持し、生長速度を評価した。系統ＸＡ　１７の組
織は、３．０ｗｇ／ｌの２１４の最高量において、選別
されてない組織の最高０．０１■／ｌの場合と対比しう
る如く生長した。
２週間の生長禁止の研究を、２１４．９９７．４９９及
びクロルスルホンに関して（上述の如く）行なった。５
０％の生長禁止を与える２１４．９９７及び４９９の量
は、２１４に対して３０ｑ／１１及び９９７及び４９９
に対して３０ｗｑ／を以上であることが判明した。これ
に対し、選別されてない組織に対するその量は０．１〜
０．３■／ｌであった。系統ＸＡ１７の組織の生長速度
は、選別されてない組織の０．０１ｍ９／ｌに対し、ク
ロルスルホン（２−クロル−Ｎ−（（４−メトキシ−６
−メチル−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ
カルボニル〕ベンゼンスルホンアミド、クロルスルホン
ＤＰＸ４１８９としても公知　Ｂ。
１、ＤｕＰｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ　。
Ｗｉ　Ｉｍｉｎｇｔｏｎ　、　Ｄｌｉ）の場合１０Ｗ／
ｌによって５０％が禁止された。系統ＸＡ１７を２１４
に対する耐性のために選別したけれど、これは他の試験
した化合物に対しても少くとも３００倍（濃度基準）の
耐性の増大を示した。
モロコシの系統ＸＡ１７のＡＨＡＳ活性系活性系統ＸＡ
１小組織出したアセトヒドロキシ酸シンターゼが除草剤
に対する敏感性に関して変質されているかどうかを決定
するために評価を行なった。そのような変化は、この酵
素の変質が耐除草剤性を付与するということを意味しよ
う。
評価は上述の如く行なった。対照の組織のＡＩ−ＩＡ　
Ｓ活性は、１×１Ｏ−６〜Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍの濃度範
囲において、９９７．２１４及び４９９により５０チ禁
止された。系統ＸＡ１７組織のＡＨＡＳ活性は除草剤３
×１０司〜３Ｘ１０−”Ｍの限度範囲において９９７．
２１４及び４９９により５０％禁止された。このことは
設度基準において少くとも１０００倍の、除草剤に対す
る敏感性の変化の起こったことを示す。対照組織のＡＨ
ＡＳ活性は、系統ＸＡ　１７　ＡＨＡ　５（７）　３　
Ｘ　１０−？ＭｉＣ’！６ける５０チ集止と比較される
如＜ｌＸｌ０−’Ｍのクロルスルフロンにより５０％禁
止されることが発見された。
結果は、ＡＨＡＳが試験した除草剤の作用部位であり、
更に耐性は作用部位の変質によって与えられるというこ
とを示す。系統ＸＡ１７は変質された作用部位を有する
ために細胞レベルにおいて耐性を表わすから、この除草
剤の許容性は除草剤のイミダゾリノン及びスルホンアミ
ド同族体のすべての化合物を含め、ＡＨＡ８に同一の部
位で作用する多くの化合物に対して同様に拡張できる。
除草剤のイミダゾリノン及びスルホンアミド同族体は構
造的に類似していない。それらは両方とも植物において
Ａ　ＨＡ　Ｓ活性を禁止するけれど、酵素の異なる部位
と相互するように見える。それらが異なる部位と相互作
用する場合、イミダゾリノン耐性を生ずるＸＡ１７Ａｌ
（Ａｓにおりる変質は両部位に影響するのに十分大きい
ようである。
ＸＡ１７組織のＡ　）Ｉ　Ａ　８変質は酵素と相互作用
するイミダゾリノン又はスルホンアミド以外の化合物の
結合にも影響しつる。
除草剤によって影響される作用部位の上述の説明が正し
いか又は正しくないかに拘らず、系統ＸＡｔ７のカルス
組織及び再生植物が、他のモロコシの細胞培養物又は植
物と比較される如き、両除草剤類の化合物に対する実質
的なｌの許容性を示すという事実は残る。
植物の再生と種子の生産 植物再生手順 モロコシのカルス組織８０〜９０１ｖｔを、ペトリペレ
ート中の胚及び芽の発育（再生）媒体に転移した。この
媒体は２．４−Ｄｏ、１〜／を及び１ｘｌｏ−’Ｍ離層
酸を補充したＭＳ基本媒体からなった。寒天の代りに０
．２５チＧｅ１ｒｉｔｅ（Ｋｅｌｃｏ　Ｃｏ、、　Ｓａ
ｎ　Ｄｉｅｇｏ　、　（Ａ）を固体支持体として用いた
。組織を２６℃で１週間暗所で培養した。次いで１４時
間の明及び１０時間の暗のサイクルで、プレートを２６
℃下に光条件下に移した（約３００フートキヤンドル、
やわらかい白色螢光）。植物を１〜３ｃｒＩＬの寸法ま
で発育させ、次いでこれを更に発育させるために補充物
を含まなｃ）Ｍｓ媒体を含有するフラスコ又はジャーに
移した。植物が２〜３葉段階に達したとき、植物をバー
ミキュライトを含む鉢に移し、２６００フートキヤンド
ルの光にさらした。これらの植物に、これが安定に生育
するまで２０％ｖ　／　ｖ　Ｍ　Ｓ媒体を１週間、次い
で水を散布した。続いて植物を成熟するまで土壌に移し
て生長させた。
２１４の種々の濃度の植物再生（胚及び芽の発育）に及
ぼす影響を評価した。選別されてない培養組線を、０．
０１〜０．３．　ｒｑ　／　ｔの範囲の種々の濃度の２
１４を含有する再生媒体に移した。次いでこの組織を、
上述の植物再生手順により最初３週間処理した。この期
間の後、培養物を良く定義された芽の生成に関して評価
した。
植物の再生は、生成した芽の数に基づいて、０．０３〜
０．１■／ｌの濃度範囲において２１４により５０チ禁
止された。０．３ｔＩＩｇ／ｌの２１４は体腔胚の発育
及び芽の生成を完全に禁止した。
系統ＸＡ１７のカルス組織から再生した植物における耐
除草剤性の表現 分化されてない細胞培養物に対、して選別される且つ表
現される体質は、発育する植物の分化した器官及び組織
において必すしも表現されない。それ故に、系統ＸＡ１
７のカルス組織から再生された植物を、通常の禁止濃度
の２１４の存在下に検査することが必要であった。系統
ＸＡ１７の組織を、２１４を０．１．０．３及び３．０
ＴＷ１／ｌで含有する再生砂体に転移した。すべての３
種の除草剤量において、正常に発育する小植物が得られ
た。これは耐除草剤性が植物の発育中に表現されたこと
を示す。
成熟した植物の再生と種子の生産 少くとも３回の２次培養に対する除草剤の露呈から除去
された或いは保持媒体上において０．１．０．３又は３
．０■／ｌの２１４に連続的に露呈された系統ＸＡ１７
のカルス組織から成熟した植物を再生した。すべての場
合において、植物の再生頻度は１００ｇの細胞培養当り
植物約１本であった。
植物を成熟するまで生長させ、得られた花粉を用いて、
繁殖するＢ７３の植物を受粉させる。逆に８７３植物か
らの花粉を系統ＸＡ１７の再生植物に交配させた。得ら
れた種子は通常の植えつけ条件下に発芽することがわか
った。再生した植物の子孫の耐性の体質の表現及び遺伝
の程度を研究する。
細胞系統ＸＡ１７から再生された植物から得られる子孫
の実生の分析を下記の如く行なって、培養物中に選別さ
れた耐除草剤性が世代サイクルに従って遺伝され且つ表
現されるかどうか決定した。
正常の穂を有するＸＡｔ７の再生された植物を、種子か
ら生育させた除草剤に敏感な繁殖Ｂ７３植物からの花粉
で受粉させた。受粉から約４０日で種子を得、収穫した
。
遺伝の評価において対照としてイ吏用しつる種子を、再
生値物から、系統ＸＡ１７と同一の遺伝的バックグラン
ドの除草剤に敏感な細胞系統から得た。これらの再生植
物を、種子から生長させた除草剤に敏感な繁殖１３７３
植物から得た花粉で交配させた。受粉から約４０日で種
子を収穫した。
２０の対照の種子と１０のＸＡ１７の種子を、２．６チ
次亜塩素酸すトリウムで２０分間表面殺菌し、次いで無
菌の蒸留水で洗浄した。種子を少量の殺菌剤ｃａｐｔａ
ｎ　（Ｎ　−トリクロルメチルチオ−４−シクロヘキセ
ン−１，２−ジカルボキシミド）を含む無菌水中に浸し
た。次いで成熟した胚を種子から切り取り、２．４−Ｄ
を含まない固体のＭＳ媒体上に圧盤側を下にして置いた
。１０の対照の種子を、２１４を含まない媒体上に置き
、１０をオートクレーブ後であるがゲル化前に媒体中に
混入した６ＸＩＯ’Ｍの２１４の存在する媒体上に１６
いた。すべて１０のＸＡ１７の種子を６×１０−’Ｍの
２１４の存在下に置いた。これから７日後に実生を評価
した。
２１４の不存在下における対照の実生は、７日間を通し
て正常に生長し、平均の芽の長さが１１．８ｃｒｒＬ（
第３図）及び平均の根の長さが８．１　ｃｍ　（第４図
）に達した。２１４の存在下における対照の実生の生長
禁止は最初３日目に観察された。後続の日には更なる生
長が起こらなかった。達成された平均の芽の長さ及び根
の長さはそれぞれ１．５ｃｒＩＬ及び１．１ｃ＋＋＋で
あった。
２１４の存在下に生長させた１０のＸＡ１７の実生のう
ち５つの実生の生長は、２１４の存在下に生長させた対
照の実生と同一の程度まで禁止された。５つのＸＡ１７
の実生は２１４による生長禁止に対して耐性を示した（
第３図及び第４図）。
耐性の実生の根の生長は特に驚くほどであった。
根は除草剤を含む媒体へ入り込み、実質的な根分かれを
示して迅速に生長し、６〜７（ｍの長さに達した。敏感
な芙生の根は殆んど生長せず（０〜１ｃＩｒＬ）、媒体
の表面に達しただけであった。このデータは、培養で選
別された耐除草剤性の体質が優性遺伝子きして伝達され
ること、またこれが２１４に対する高度の耐性を植Ｉｆ
ｌＩＪζこ与えることを示した。
耐性の及び敏感な実生を、成熟するまで生長させるため
に鉢に移した。この体質はこれらの植物から、商業的に
発育させるための農政的に重要な繁殖系統へ交配される
であろう。
均一な耐除草剤性の種子を得る方法 除草剤に敏感な植物との交配から得られた耐除草剤性の
再生された植物の種子は、耐除草剤性の体質に関して、
耐性種と敏感種に分離する。即ち半分の１項子は耐性の
暗号化された単一の遺伝子を有し、半分の種子は耐性を
有さない。体質を均一に表現し且つ耐性のアセトヒドロ
キシ岐シンターゼの遺伝子に関してヘテロ接合又はホモ
接合性である柚子は次の交配を行なうことに、よって得
ることができる。
敏感な植物と交配させた除草剤に耐性の再生された植物
から得た種子を植え、性的に成熟するまで生長させ、自
家授粉させた。得られた穂から刈り取った種子の試料を
、実生評価により耐除草剤性に関して評価した。半分の
穂は耐性のない種子を有するであろう。他の半分は体質
の分離１：２：１（ホモ接合耐性：ヘテロ接合耐性：ホ
モ接合敏感性）を有する耐性の体質を表現する種子、即
ち耐性の体質を有する種子７５％を有するであろう。
次いで耐性の体質を有する穂からの種子を生長させ、自
家授粉させた。得られる穂からの種子を耐性に関して再
び評価した。これらの穂の２５％は耐除草剤性を均一に
表現する種子を有するであろう。これらの種子は耐性の
体質に対してホモ接合性であり、゛ホモ接合性植物に由
来する。
耐性の体質に対して均一にホモ接合性である種子は、ホ
モ接合性の種子から植物を生長させ、そして耐性遺伝子
の欠ける植物との交配においてこれらの植物を雄又は雌
の親として用いることによって得ることができる。これ
らの交配からの子孫は均一に耐除草剤性であり、耐性遺
伝子に関してホモ接合性である。
以下の節は、２種の更なるイミダゾリノン耐性のモロコ
シ細胞系統ＱＪ　２２及びＵＶ１８の選別及び部分的特
性を記述する。
モロコシ細胞系統ＱＪ　２２の選別 次の重要な差異を除いて系統ＸＡ１７の選別に関して詳
細に１己述した手順を用いることにより、モロコシの細
胞培養物から系統ＱＪ２２を選別した＝（１）モロコシ
のカルス組織を除草剤４９９を用いて選別し、また（２
）選別を開始するために用いた組織を予じめ選別した細
胞系統ＸＡ１１９から得た。ＸＡ１１９は、２１４の許
容性に対する選別において同一であり、細胞レベルにお
いて２１４の許容性が約３倍高められることが示される
。
選別系統ＱＪ　２２を０．１■／ｌの４９９の態度で開
始した。１２週間の期間に亘る２回の非常に長い２次培
養間隔を通して選別を保持した。系統ＱＪ２２は１２週
間の選別後、良好な組織形態を有する急速に生長する組
織集落として同定した。
ＱＪ　２２組織は０．１〜／ｌの４９９の存在下に、後
続の週に亘って増加した。８週間の蓄積後、細胞系統を
特徴づけ、植物の再生の努力を開始した。
いくつかの芽と小さい植物を得、これを成熟するまで生
長させた。
系統Ｕ■１８の選別 系統ＵＶ１８も、１つの重要な差異のある以外系統ＸＡ
１７の選別に関して詳細に記述した手順を用いることに
より、モロコシの細胞培養物から選別した。この選別を
開始するために用いた組織を、２１４にさらす前に紫外
線の照射に供した。
紫外線の照射のために、組織をプラスチック製のペトリ
皿中の保持媒体上に薄い層（１〜３　ｍ　）で広げた。
次いでこれらのプレートを可視光線の不存在下に０．１
．２．４及び８分間ＵＶ光を照射した。紫外線の光源は
Ｗｅｓｔｉｎｇｈｏｕｓ製７８２Ｌ−３０型の２９Ｗラ
ンプ（ＷｅｓｔｉｎｇｈｏｕｓＥｌｅｃｔｒｉｃａｌ　
Ｃｏｒｐ、、　Ｌａｍｐ　ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＤｉｖ
ｉｓｉｏｎ、　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ、　ＮＪ　）であ
り、これを組織から約７インチのところに置いた。この
照射した組織を暗所で２週間生長させた。次いで生き残
った組織を転位して０．　ｉ　ａｙ　／　ｔの２１４を
含む媒体を保持し、２１４に対する耐性の選別を開始し
た。
紫外線に２分間照射して得た組織からの系統ＵＶ１８を
同定した。２１４に対する許容性を与える変質が紫外線
照射の結果であるか或いは選別過程で起こった自然の変
化であったかを決定することはできなかった。
ＵＶ１３細胞系統を、８回の２次媒養の間隔を含んでな
る選別の２５週間後に最初に観察した。
選別過程において、組織を、４回の２次培養間隔に対し
０．１ｑ／ｌの２１４、次いで４回の２次培養間隔に対
し０．３■／ｌの２１４に露呈した。ＵＶ１８は９回目
の２次培養中良好な形態を有する急速に生長する組織集
落として同定された。この組織は、除草剤の不存在下に
おける対照組織と同様に、０．３■／ｌの２１４の存在
下に急速に成長した。
細胞系統は２１４の存在下に急速に増加し、特徴づける
ことができた。植物は通常の有毒量の２１４（０，３η
／ｌ）の存在下に再生された。これは耐性の体質が分化
した植物の器官ｉとおいて表現されるこ己を示す。ｕｖ
ｌｓの細胞培養物から再生した除草剤に耐性の植物は現
在成熟するまで生長している。
系統ＱＪ２２及びＵＶ１８の特性 除草剤の許容性の大きさ及び範囲を決定するために、耐
性のカルス組織を特徴づけた。
系統ＱＪ　２２及びＵＶ１８からのカルス組織を、化合
物２１４．９９７．４９９、及びクロルスルフロンを一
連の濃度で用いる生長禁止に関する研究に供した。第３
表はこれらの検討の結果を記述する。数は対照組織と比
較した時の細胞系統の各によって許容されうる除草剤湿
度の増加の倍数を表わす。この値は生長速度の５０チ減
少を与える除草剤の１片に基づいて決定した。１００倍
よりも　−大きい耐性が示される場合には、組織は試験
した最高濃度を完全に許容した。一般にＵＶ１８は系統
ＸＡ１７と同様の除草剤の許容性を示した。ＱＪ　２２
ハＵＶ　１８及ヒＸＡ　１７　トｈす’ｌ）８ナリ、即
ち２１４の許容性が小程度であり、クロルスルフロンの
許容性は本質的に観察されなかった。
第３表 カルス生長 ＱＪ２２　３０−５０　５　３０−５０　０ＵＶ１８　
１００　１００　１００　３００モロコシの系統ＱＪ２
２．及びＵＶ１ｇのＡＨＡＳ活性の除草剤による禁止 アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を、細胞系統ＸＡ１
７に関して詳細に上述した如く、細胞系統ＬＪｖ１８及
びＱＪ　２２から抽出し、評価した。
両方の選別した系統からのＡＨＡＳ活性は、対照培養物
からのＡＨＡ８活性よりも１００倍以上の濃度（３Ｘ１
０−’〜３Ｘ１０−’Ｍ）の９９７を許容した。この結
果はＵＶ１ｇ及びＱＪ２２が、ＸＡ１７と同様に変質さ
れた除草剤の作用部位を有するために耐除草剤性である
ことを示唆している。更に他の機構は耐除草剤性をこれ
らの細胞系統中に付与することに包含されうる。
本明細書に記述する如き次の細胞系統をル１−ｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
　。
１Ｌｏｃｋｖｉ　ｌｉｅ　、Ｍａｒｙｌａｎｄに預託し
た。　これらは次の受け入れ番号が割当てられた： 細胞系統　受は入れ番号 ＸＡ１７　４０１００ ＱＪ２２　４０１２９ ＵＶ１８　４０１２８ 本明細書に記述する如き細胞系統ＸＡ１７から生長させ
た植物に由来する種子を、ＩｎＶｉｔｒ。
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　、　Ｉｎｃ、、　Ａｎｎ
　Ａｒｂｏｒ。
Ｍｉｃｈｉｇａｎ　に預託した。これはＩＶＩ受は入れ
番号１００１１が割当てられた。
本発明は預託した細胞系統又は種子によって範囲が制限
されるものではない。その理由は、預託した具体例が本
発明のある観点の１つの例として意図され、機能的に同
等であるいずれの細胞系統又は種子も本発明の範囲内に
入るからである。確かに上記記述及び添付する図面から
、本明細書に示した且つ記述したものの他に、種々の本
発明の改変が同業老には想起されるであろう。そのよう
な改変は特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【図面の簡単な説明】
第１図はロイシン、バリン及びイソロイシンそれぞれ１
ｍＭの媒体補充をした（白丸）又はしてない（黒丸）場
合におけるＡＣ２４３，９９７の濃度の関数としてのモ
ロコシ細胞の懸濁液培養での成長を示し、 イシンの生産に対する生合成経路を示り、＞第３図はＡ
Ｃ２５２，２１４の存在又は不存在−において生長した
実生の芽の長さを示し、そして第４図はＡＣ２５２，２
１４の存在又は不存在において生長した実生の根の長さ
を示す。 １／３ ０　−１１　−７　−１５　−５　−４　−！ＩＬｏｇ
　９９７　濱農　（Ｍ）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、生長と発育が通常ではモロコシ植物の生長と発育を
    禁止する量の２−（２−イミダシリン−２−イル）ピリ
    ジン除草剤又はその誘導体による禁止に対して耐性であ
    る該モロコシ植物；生長と発育が通常ではモロコシ植物
    の生長と発育を禁止する量の２−（２−イミダシリン−
    ２−イル）キノリン除草剤又はその誘導体による禁止に
    対して耐性である該モロコシ植物：或いは生長と発育が
    通常ではモロコシ植物の生長と発育を禁止する量の除草
    剤スルホンアミドによる禁止に対して耐性である該モロ
    コシ植物。 ２　除草剤がＡＣ２６３，４９９である；除草剤がＡＣ
    ２４３，９９７である；除草剤がＡＣ２５２，２１４で
    ある；或いは除草剤が２−クロル−Ｎ−［（４−メトキ
    シ−６−メチル−１，３゜５−トリアジン−２−イル）
    アミノカルボニル〕ベンゼンスルホンアミドである、特
    許請求の範囲第１項記載のモロコシ植物。 ３、モロコシ植物がこの植物中に天然に生じない該除草
    剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む；遺伝子が真核
    有機体からである；遺伝子が原核有機体からである；或
    いは遺伝子が化学的又は酵素的合成法によって全部が又
    は部分的曇こ作られる、特許請求の範囲第１項記載のモ
    ロコシ植物。 ４、モロコシ植物が、通常では変質されてないアセトヒ
    ドロキシ酸シンターゼの活性を禁止する濃度における該
    除草剤による禁止に耐性のある変質されたアセトヒドロ
    キシ酸シンターゼを特徴とする特許請求の範囲第１又は
    ２項記載のモロコシ植物。 ５、耐性を付与する遺伝子が、通常では変質されてない
    アセトヒドロキシ酸シンターゼの活性を禁止する濃度に
    おける除草剤による禁止に耐性のある変質されたアセト
    ヒドロキシ酸シンターゼを暗号で廟し、モロコシは該遺
    伝子を表現することができる特許請求の範囲第３項記載
    のモロコシ植物。 ６、ＡＴＣＣに預託され且つ受け入れ番号４０１００号
    の割当てられたモロコシの細胞系統ＸＡ　１７、及びそ
    の突然変異体、組換え物及び遺伝子工学的誘導体に由来
    する耐除草剤性のモロコシ植物；ＡＴＣＣに預託され且
    つ受け入れ番号４０１２９号の割当てられたモロコシの
    細胞系統ＱＪ２２、及びその突然変異体、組換え物及び
    遺伝子工学的誘導体に由来する耐除草剤性のモロコシ植
    物、ＡＴＣＣに預託され且つ受け入れ番号４０１２８号
    の割当てられたモロコシの細胞系統［ＪＶ１８、及びそ
    の突然変異体、組換え物及び遺伝子工学的誘導体に由来
    する耐除草剤性のモロコシ植物；或いはＩｎ　Ｖｉｔｒ
    ｏ’　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ、に預託され
    且っＩＶＩ受は入れ番号１００１１号の割当てられた種
    子、及びその突然変異体、組換え物及び遺伝子工学的誘
    導体に由来する耐除草剤性のモロコシ植物。 ７、遺伝子が通常では変質されてないアセトヒドロキシ
    酸シンターゼの活性を禁止する濃度における除草剤によ
    る禁止に耐性のある変質されたアセトヒドロキシ酸シン
    ターゼが暗号化されており、植物は該遺伝子を表現する
    ことができる該植物。 ８、植物が単子葉植物である；植物が穀類作物である；
    或いは植物がモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、コウ
    リャン、カラスムギ、ライムギ及びキビからなる群から
    選択される特許請求の範囲第７項記載の植物。 ９、除草剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）ピリ
    ジン又はその誘導体である；除草剤がＡＣ２６３，４９
    ９である：除草剤がＡＣ２４３，９９７である：除草剤
    が２−（２−イミダシリン−２−イル）キノリン又はそ
    のＭＳ体である；除草剤がＡＣ２５２，２１４である；
    除草剤が除草剤スルホンアミドである；或いは除草剤が
    ２−クロル−Ｎ−［：　（４−メトキシ−６−メチル−
    １，３゜５−トリアジン−２−イル）アミノカルボニル
    ］ベンゼンスルホンアミドである、特許請求の範囲第８
    項記載の植物。 １０、組織培養物の生長が、２−（２−イミダシリン−
    ２−イル）ピリジン除草剤又はその誘導体による、通常
    では該組織培養物の生長を禁止する量での、禁止に対し
    て耐性があり、但し除草剤がＡＣ２６３，４９９であり
    又は除草剤がＡＣ２４３、９９７である、モロコシの組
    織培養物；組織培養物の生長が、２−（２−イミダシリ
    ン−２−イル）キノリン除草剤又はその誘導体による、
    通常では該組織培養物の生長を禁止する量での、禁止に
    対し７て耐性があり、但し除草剤がＡＣ２５２，２１４
    である、モロコシの組織培養物；或いは組織培養物の生
    長が、除草剤スルポンアミドによる、通常では該組織培
    養組成物の生長を禁止する量での、禁止に対して耐性が
    あり、但し除草剤が２−クロル−Ｎ−［（４−メトキシ
    −６−メチル−１，３，５−１−リアジン−２−イル）
    −アミノカルボニル ロコシの組織培養組成物。 １１、組織培養物がこの組織培養物中に天然に生じない
    該除草剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む；遺伝子
    が真核有機体からである；遺伝子が原核有機体からであ
    る；或いは遺伝子が化学的又は酵素的合成法によって全
    部が又は部分的に作られる、特許請求の範囲第１０項記
    載のモロコシの組織培養物。 １２、組織培養物が、通常では変質されてないアセトヒ
    ドロキシ酸シンターゼの活性を禁止する濃度における該
    除草剤による禁止に耐性のある変質されたアセトヒドロ
    キシ酸シンターゼを特徴する特許請求の範囲第１０項記
    載のモロコシの組織培養物。 １３、耐性を付与する遺伝子が、通常では変質されてな
    いアセトヒドロキシ酸シンターゼの活性を禁止する濃度
    における除草剤による禁止に耐性のある変質されたアセ
    トヒドロキシ酸シンターゼを特徴とする特許請求の範囲
    第１１項記載のモロコシの組織培養物。 １４、ＡＴＣＣに預託され且つ受け入れ番号４０１００
    号の割当てられたモロコシの細胞系統ＸＡ１７、及びそ
    の突然変異体、組換え物及び遺伝子工学的誘導体に由来
    する耐除草剤性のモロコシの組織培養物；ＡＴＣＣに預
    託され且つ受け入れ番号４０１２９号の割当てられたモ
    ロコシの細胞系統ＱＪ２２、及びその突然変異体、組換
    え物及び遺伝子工学的誘導体に由来する耐除草剤性のモ
    ロコシの組織培養物ＱＡＴＣＣをこ預託され且つ受け入
    れ番号４０１２８号の割当てられたモロコシの細胞系統
    ＵＶＩＢ、及びその突然変異体、組換え物及び遺伝子工
    学的誘導体に由来する耐除草剤性のモロコシの組織培養
    物；或いはＩｎ　Ｖｉｔｒ。 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ、に預託され且つ
    ＩｖＩ受は入れ番号１００１１号の割当てられた種子、
    及びその突然変異体、組換え物及び遺伝子工学的誘導体
    に由来する耐除草剤性のモロコシの組織培養物。 １５、除草剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）ピ
    リジン又はその誘導体である；除草剤がＡＣ２６３，４
    ９９である；除草剤がＡＣ２４３゜９９７である；除草
    剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）キノリン又は
    その誘導体である；除草剤がＡＣ２５２，２１４である
    ；除草剤が除草剤スルホンアミドである；或いは除草剤
    が２−クロル−Ｎ−［（４−メトキシ−６−メチル−１
    ，３゜５−トリアジン−２−イル）アミノカルボニル〕
    ベンゼンスルホンアミドである、特許請求の範囲第１４
    項記載の植物の組織培養物。 １６、通常では変質されてないアセトヒドロキシ酸シン
    ターゼの活性を禁止する濃度における除草剤による禁止
    に対して耐性のある変質されたアセトヒドロキシ酸シン
    ターゼを暗号化した遺伝子を含む植物の組織培養物であ
    り１．但し該組織培養物が該遺伝子を表現することがで
    き：組織培養物が単子葉植物に由来し；組織培養物が穀
    類作物に由来し；或いは組織培養物がモロコシ、イネ、
    コムギ、オオムギ、コウリャン、カラスムギ、ライムギ
    及びキビからなる群から選択される、該組織培養物。 １７、組織がこの植物中に天然に生じない該除草剤に対
    する耐性を付与する遺伝子を含む；遺伝子が真核有機体
    からである；遺伝子が原核有機体からである；或いは遺
    伝子が化学的又は酵素的合成法によって全部が又は部分
    的に作られる、特許請求の範囲第１６項記載の植物の組
    織培養物。 １８、植物の生長と発育が、２−（２−イミダシリン−
    ２−イル）ピリジン除草剤又はその誘導体による、通常
    では該組織培養物の生長と発育を禁止する量での、禁止
    に対して耐性があり、但し除草剤がＡＣ２６３，４９９
    であり又は除草剤がＡＣ２４３，９９７である、モロコ
    シの組織培養物；植物の生長と発育が、２−（２−イミ
    ダゾリン−２−イル）キノリン除草剤又はその誘導体に
    よる、通常では該組織培養物の生長を禁止する量での、
    禁止に対して耐性があり、但し除草剤がＡＣ２５２，２
    １４である、モロコシの組織培養物；或いは植物の生長
    と発育が、除草剤スルホンアミドによる、通常では該組
    織培養組成物の生長を禁止する量での、禁止に対して耐
    性があり、但し除草剤が２−クロル−Ｎ−［（４−メト
    キシ−６−メチル−１、３、５−トリアジン−２−イル
    ）−アミノカルボニル〕ベンゼンスルホンアミドである
    、モロコシ植物を生長させることのできるモロコシの種
    子。 １９、種子がこの種子中に天然に生じない該除草剤に対
    する耐性を付与する遺伝子を含む；遺伝子が真核有機体
    からである；遺伝子が原核有機体からである；或いは遺
    伝子が化学的又は酵素的合成法によって全部が又は部分
    的に作られる、特許請求の範囲第１８項記載のモロコシ
    の種子。 ２０、種子が、通常では変質されてないアセトヒドロキ
    シ酸シンターゼの活性を禁止する濃度における該除草剤
    による禁止に耐性のある変質されたアセトヒドロキシ酸
    シンターゼを特徴する特許請求の範囲第１８項記載のモ
    ロコシの種子。 ２１、耐性を付与する遺伝子が、通常では変質されてな
    いアセトヒドロキシ酸シンターゼの活性を禁止する濃度
    における除草剤による禁止に耐性のある変質されたアセ
    トヒドロキシ酸シンターゼを暗号で有し、種子は該遺伝
    子を表現することのできる特許請求の範囲第１９項記載
    のモロコシの種子。 ２２、ＡＴＣＣに預託され且つ受け入れ番号４０１００
    号の割当てられたモロコシの細胞系統ＸＡ１７、及びそ
    の突然変異体、組換え物及び遺伝子工学的誘導体に由来
    する耐除草剤性のモロコシの柚子；ＡＴＣＣに預託され
    且つ受け入れ番号４０１２９号の割当てられたモロコシ
    の細胞系統ＱＪ２２、及びその突然変異体、組換え物及
    び遺伝子工学的誘導体に由来する耐除草剤性のモロコシ
    の種子；ＡＴＣＣに預託され且つ受け入れ番号４０１２
    ８号の割当てられたモロコシの細胞系統Ｕｖ１８、及び
    その突然変異体、組換え物及び遺伝子工学的誘導体に由
    来する耐除草剤性のモロコシの種子；或いはＩｎ　Ｖｉ
    ｔｒｏ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ、に預託さ
    れ且つＩＶＩ受は入れ番号１００１１号の割当てられた
    種子、及びその突然変異体、組換え物及び遺伝子工学的
    誘導体に由来する耐除草剤性のモロコシの種子。 ２３、通常では変質されてないアセトヒドロキシ酸シン
    ターゼの活性を禁止する濃度における除草剤による禁止
    に対して耐性のある変質されたアセトヒドロキシ酸シン
    ターゼを暗号化した遺伝子を含む種子であり、但し該種
    子が該遺伝子を表現することができ；種子が単子葉植物
    に由来し；種子が穀類作物に由来し：或いは組織培養物
    がモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、コウリャン、カ
    ラスムギ、ライムギ及びキビからなる群から選択される
    ；また除草剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）ピ
    リジン又はその誘導体であり；除草剤がＡＣ２６３，４
    ９９であり：除草剤がＡＣ２４３，９９７であり；除草
    剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）キノリン又は
    その誘導体であり；除草剤がＡＣ２５２，２１４であり
    ；除草剤が除草剤スルホンアミドであり；或いは除草剤
    が２−クロル−Ｎ−（（４−メトキシ−６−メチル−＼ １、’３．５−１−リアジンー２−イル）アミノカルボ
    ニル〕ベンゼンスルホンアミドである、該種子。 ２４、通常では変質されてないアセトヒドロキシ酸シン
    ターゼの活性を禁止する濃度における除草剤による禁止
    に対して耐性のある変質されたアセトヒドロキシ酸シン
    ターゼを暗号化して含む遺伝子。 ２５、（ａ）　植物から無菌で得られた未熟成の胚に由
    来する植物の組織培養を開始し且つ該胚を開始／保持媒
    体平板上に置き； （ｂ）　該胚に由来する植物の組織培養物を、約２０〜
    約４０％以下の生長禁止を与える量の除草剤の存在下に
    、最初の２週間該除草剤にさらしつつ生長させ； （Ｃ）　工程（ｂ）の植物の組織培養物を２次培養し；
    （Φ　該除草剤の不存在下における植物の組織培養物に
    匹敵する速度で生長する工程（Ｃ）からの安定な耐除草
    剤性の植物の細胞系統を同定し；そして （ｅ）　該安定な耐除草剤性の植物の細胞系統から、通
    常では再生しつつあるモロコシ植物の生長を禁止する除
    草剤量の少くとも３倍を越える量の除草剤の存在下に、
    植物を再生し且つ種子を生産する、 工程を含んでなる耐除草剤性の植物、植物組織又は植物
    の種子を生産する方法。 ２６、工程（ｂ）の植物の組織培養物を最初に紫外光を
    用いて照射する特許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、除草剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）ピ
    リジン除草剤を含んでなる；除草剤が２−（２−イミダ
    シリン−２−イル）キノリン除草剤を含んでなる；除草
    剤が除草剤スルホンアミドを含んでなる；植物が単子葉
    植物である；或いは植物が穀類作物を含んでなる、特許
    請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８、（ａ）　モロコシ植物から無菌で得られた未熟成
    の胚に由来するモロコシ植物の組織培養を開始し且つ該
    胚を開始／保持媒体平板上に置き； （ｂ）　該胚に由来するモロコシ植物の組織培養物を、
    約２０〜約４０ｔｓ以下の生長禁止を与える曾の除草剤
    の存在下に、最初の２週間該除革剤にさらしつつ生長さ
    せ； （ｃ）　工程中）のモロコシ植物の組織培養物を２次培
    養し； （山　該除草剤の不存在下におけるモロコシ植物の組織
    培養物に匹敵する速度で生長する工程（ｅ）からの安定
    な耐除草剤性のモロコシ植物の細胞系統を同定し；そし
    て （ｅ）　該安定な耐除草剤性のモロコシ植物の細胞系統
    から、通常では再生しつつあるモロコシ植物の生長を禁
    止する除草剤量の少くとも３倍を越える量の除草剤の存
    在下に、モロコシ植物を再生し且つ種子を生産する、 工程を含んでなる耐除草剤性のモロコシ植物、モロコシ
    植物組織又はモロコシ植物の種子を生産する方法。 ２９、除草剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）ピ
    リジン除草剤を含んでなる：除草剤が２−（２−イミダ
    シリン−２−イル）キノリン除草剤を含んでなる：除草
    剤が除草剤スルホンアミドを含んでなる；特許請求の範
    囲第２８項記載の方法。 ３０、（ａ）　植物から無菌で得られた未熟成の胚に由
    来する植物の組織培養を開始し且っ該胚を開始／保持媒
    体平板上に置き： Φ）該胚に由来する植物の組織培養物を、約２０〜約４
    ０％以下の生長禁止を与える量の除草剤の存在下に、最
    初の２週間該除草剤にさらしつつ生長させ； （Ｃ）　工程中）の植物の組織培養物を２次培養し；（
    ｄ）　該除草剤の不存在下における植物の組織培養物に
    匹敵する速度で生長する工程（Ｃ）からの安定な耐除草
    剤性の植物の細胞系統を同定し；そして （ｅ）　該安定な耐除草剤性の植物の細胞系統から、通
    常では再生しつつあるモロコシ植物の生長を禁止する除
    草剤量の少くとも３倍を越える量の除草剤の存在下に、
    植物を再生し且つ種子を生産する、 工程を含んでなる方法によって製造される耐除草剤性の
    植物、植物組織又は植物の種子を生産する方法。 ３１、除草剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）ピ
    リジン除草剤を含んでなる；除草剤が２−（２−イミダ
    シリン−２−イル）キノリン除草剤を含んでなる；除草
    剤が除草剤スルホンアミドを含んでなる；植物が単子葉
    植物である；或いは植物が穀類作物を含んでなる、特許
    請求の範囲Ｍ３０項記載の方法。 ３２、（ａ）　モロコシ植物から無菌で得られた未熟成
    の胚に由来するモロコシ植物の組織培養を開始し且つ該
    胚を開始／保持媒体平板上に置き； Φ）該胚に由来する植物の組織培養物を、約２０〜約４
    ０％以下の生長禁止を与える量の除草剤の存在下に、最
    初の２週間該除草剤にさらしつつ生長させ； （Ｃ）　工程（ｂ）のモロコシ植物の組織培養物を２次
    培養し； （ｄ）　該除草剤の不存在下におけるモロコシ植物の組
    織培養物に匹敵する速度で生長する工程（Ｃ）からの安
    定な耐除草剤性のモロコシ植物の細胞系統を同定し；そ
    して （ｅ）　該安定な耐除草剤性のモロコシ植物の細胞系統
    から、通常では再生しつつあるモロコシ植物の生長を禁
    止する除草剤量の少くとも３倍を越える量の除草剤の存
    在下に、モロコシ植物を再生し且つ種子を生産する、 工程を含んでなる方法で生産される耐除草剤性のモロコ
    シ植物、モロコシ植物組織又はモロコシ植物の種子。 ３３、除草剤が２−（２−イミダシリン−２−イル）ピ
    リジン除草剤を含んでなる；除草剤が２−（２−イミダ
    シリン−２−イル）キノリン除草剤を含んでなる；除草
    剤が除草剤スルホンアミドを含んでなる、特許請求の範
    囲第３２項記載の耐除草剤性のモロコシ。
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