CZ295392B6

CZ295392B6 - Rostlinný materiál cukrové řepy rezistentní proti herbicidům, způsob produkce herbicidně rezistentní rostliny cukrové řepy a způsob kontroly růstu plevele v přítomnosti těchto rostlin

Info

Publication number: CZ295392B6
Application number: CZ1999145A
Authority: CZ
Inventors: Donald Penner; Terry R. Wright
Original assignee: Michigan State University
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-08
Publication date: 2005-07-13
Also published as: ES2274546T3; DE69736841D1; CN1230217A; WO1998002527A1; EP0960190A1; SK286030B6; EP0960190B1; JP3842299B2; SK4399A3; PL191812B1; AU3596697A; BG65035B1; ATE342960T1; TR199900115T2; PL331175A1; EP0960190A4; CZ14599A3; BG103177A; EA199900123A1; DE69736841T2

Abstract

Řešení se týká rostlin cukrové řepy, které jsou rezistentní jak proti imidazolinonovým herbicidům, tak proti sulfonylmočovinovým herbicidům. Rostliny cukrové řepy jsou odvozeny z citlivých buněk postupnou selekcí SU-R buněk, regenerací rostliny a opakovanou selekcí na IM-R. Rezistentní rosliny cukrové řepy, které jsou odvozeny z těchto buněk, mohou růst na polích, na kterých se ke kontrole plevele použily imidazolinony a sulfonylmočoviny.ŕ

Description

Rostlinný materiál cukrové řepy rezistentní proti herbicidům, způsob produkce herbicidně rezistentní rostliny cukrové řepy a způsob kontroly růstu plevele v přítomnosti těchto rostlin

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu produkce rostlin cukrové řepy (Beta vulgaris L.), které jsou rezistentní jak proti imidazolinonovým, tak proti sulfonylmočovinovým herbicidům používaným pro kontrolu plevele. Vynález se týká zejména rostlin cukrové řepy, odvozených z citlivé cukrové řepy mutací genu kódujícího acetolaktátsyntázu (ALS), která je rovněž známa jako syntáza acetohydroxykyseliny (AHAS), za postupné aplikace herbicidů na buňky v kultivačním médiu.

Dosavadní stav techniky

Známý stav popisuje genetickou alteraci acetolaktátsyntázového genu rekombinantními prostředky, které jsou popsány v patentech US 5 013 659; US 5 141 870 a US 5 378 824. Tento typ modifikace v rostlinách cukrové řepy je popsán v příkladu IV patentu '824. Výsledky získané při produkci rostlin, které by měly mít ideální herbicidní rezistenci, nebyly doposud uspokojivé.

Saunders a kol. v Crop Science 32:1357-1360 (1992) například popisuje produkci rostliny cukrové řepy (CR1-B) rezistentní proti sulfonylmočovinám z citlivého samoplodícího klonu (REL-1), jejíž podstatou je selekce buněk mutantů v kultivačním médiu obsahujícím herbicid. Byly vyprodukovány a kříženy různé rezistentní rostliny. Hart a kol. (Weed Science 40:378-383 (1992) a 41:317-324 (1993)) dále charakterizoval rezistentní linii a zjistil, že rezistence je důsledkem alterované ALS aktivity, neexistuje křížová rezistence s dalšími herbicidy inhibujícími ALS a rezistence je kódována jediným semidominantním genem.

V současnosti nejsou dostupné žádné publikace, které by popisovaly imidazolinonovou rezistenci získanou u rostlin cukrové řepy modifikací ALS. V literatuře neexistuje ani žádná zmínka o rostlinách, které by byly rezistentní jak proti imidazolinonovým, tak proti sulfonylmočovinovým herbicidům. Různé kukuřičné linie s imidazolinonovou rezistencí již byly vyvinuty, jak uvádí Newhouse a kol., Theoretical and Applied Genetics 83:65-70 (1991).

Komerčním způsobem pro ochranu sklizně je použití klinických „ochranných prostředků“, například prostředků popsaných v evropském patentu 375 875. Tento způsob zavádí do půdy další chemikálie. Z výše uvedeného vyplývá, že by v současné době bylo výhodné nalézt způsob, pomocí kterého by bylo možné vyvinout rostliny cukrové řepy, které by disponovaly rezistencí proti imidazolinonovým a sulfonylmočovinovým herbicidům.

Podstata vynálezu

Jak již bylo uvedeno, vynález poskytuje způsob produkce herbicidně rezistentní rostliny cukrové řepy, který zahrnuje:

(a) vystavení prvních buněk cukrové řepy působení imidazolinonového herbicidu s mutovaným acetolaktátsyntázovým genem kódujícím syntázu, přičemž nukleotidy v poloze 562 jsou v kultivačním médiu modifikovány zcytosinu na thymin a v poloze 337 zguaninu na adenin a homozygotním znakem prvních buněk v kulturním médiu je rezistence proti sulfonylmočovinovému herbicidu; a (b) výběr druhých buněk, které mají rezistenci proti oběma herbicidům.

-1 CZ 295392 B6

Vynález dále poskytuje rostlinný materiál cukrové řepy, který sestává z buněk s mutovaným acetolaktátsyntázovým genem kódujícím syntázu, v němž jsou modifikovány nukleotidy v poloze 562, kde je cytosin nahrazen thyminem, a v poloze 337, kde je guanin nahrazen adeninem, přičemž mutované buňky mají rezistenci jak proti imidazolinonovým, tak proti sulfonylmočovinovým herbicidům a tato rezistence se přenáší konvenčním křížením rostlin vyprodukovaných z buněk a tyto buňky jsou regenerovatelné na rostlinu.

Rostlinný materiál podle vynálezu se odvodí z citlivých buněk rodičovské rostliny cukrové řepy, označených jako CR1-B a uložených jako ATCC 97961, které mají rezistenci proti sulfonylmočovinovým herbicidům a nemají žádnou rezistenci proti imidazolinonovým herbicidům, kultivací citlivých buněk v kultivačním médiu s imidazolinonovým herbicidem za účelem výběru mutovaných buněk.

Rostlinný materiál podle vynálezu ie uložen ve formě semen pod označením ATCC 97535 (93R30B).

Rostlinný materiál podle vynálezu může mít formu semene nebo propagačního materiálu.

Vynález konečně poskytuje způsob kontroly plevele rostoucího společně s rostlinami cukrové řepy, který zahrnuje:

(a) vypěstování semen polní cukrové řepy, které obsahují buňky podle nároku 1; a (b) aplikaci imidazolinonového herbicidu na rostlinu na poli za účelem kontroly plevelů.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 schematicky znázorňuje způsob produkce imidazolinonově a sulfonylmočovinově rezistentních rostlin cukrové řepy 93E30A nebo B podle vynálezu. R = rezistentní; IM = imidazolinon; S = citlivý; SU = sulfonylmočovina; Sur = ALS alela, dominantní pro SU-R, TP-R a IM-S; SB = ALS alela, dominantní pro SU-R, TP-R a IM-R; TP = triazolopyrimidin. 93R30B je SU-R a IM-R a TP-R. 93R30 (ne 93R30B) je homozygotní pro Sur alelu (SU-R, IM-S). To byl výchozí materiál pro získání imidazolinonové rezistence.

Obr. 2 znázorňuje vývojový diagram ukazující jednotlivé kroky produkce rostliny mutanta cukrové řepy.

Obr. 3 znázorňuje graf ukazující výsledky ALS testu pro určení rezistence 93R30B proti imazethapyru.

Obr. 4 znázorňuje schéma, naznačující aminokyselinové substituce, pozorované u standardního typu (wt) tří mutantních rostlin cukrové řepy (SiR-13, Sur a SB), a odpovídající herbicidní rezistenci rostlin. Jsou zde zahrnuty pouze aminokyselinové zbytky, kterým literatura přičítá herbicidní rezistenci. Jednopísmenné aminokyselinové kódy mají následující významy: A = alanin, P = prolin, W = tryptofan, S = serin, T = treonin. Písmena v rámečcích označují změny proti sekvenci standardního typu.

Obr. 5A až 5D znázorňují fotografie ukazující odezvu celé rostliny cukrové řepy na postemergentně aplikovaný imazethapyr.

Obr. 6A až 6D znázorňují fotografie ukazující odezvu celé rostliny cukrové řepy na postemergentně aplikovaný AC 299,263.

Obr. 7 znázorňuje fotografii ukazující odezvu ALS enzymu na imazethapyr in vitro.

Obr. 8 znázorňuje fotografii ukazující odezvu ALS enzymu na fumetsulanzw vitro.

Obr. 9A až 9D znázorňují fotografie ukazující odezvu celé rostliny cukrové řepy na postemergentně aplikovaný chlorsulfuron.

-2CZ 295392 B6

Obr. 10 znázorňuje fotografii ukazující odezvu ALS enzymu na chlorsulfuron in vitro.

Rostlinu cukrové řepy REL-1 (Regenerating, East Lansing-1), která byla zpřístupněna v roce 1987, lze získat od výzkumného genetika Dr. Josepha Saunderse, Ministerstvo zemědělství US, East Lansing, Michigan. Je dostupná zdarma. REL-1 je citlivá (S) proti imidazolinonovým (IMS), sulfonylmočovinovým (SU-S) a triazolopyrimidin-sulfonanilidovým (TP-S) herbicidům, jak naznačuje obr. 1.

Za použití pletivové a suspenzní kultury se vyvinula linie, která byla heterozygotní pro imidazolinonovou a sulfonylmočovinovou rezistenci (IM-R a SU-R). Tato buněčná linie (semena) byla 6. května 1996 uložena do sbírky kultur Američan Type Culture Collection, podle Budapešťské úmluvy, jako ATCC 97535 a zde je označována jako 93R30B. Tato buněčná linie je dostupná na požádání, po uvedení označení a čísla. Pěstováním elitních rostlinných linií cukrové řepy, zejména Beta vulgaris L., lze vyprodukovat rezistentní rostliny cukrové řepy, které jsou zvláště vhodné pro komerční využití.

Rostliny cukrové řepy, rezistentní proti imidazolinonovým herbicidům, zejména imazethapyru, a proti sulfonylmočovinovým herbicidům (chlorsulfuronu) řeší problém, vznikající při použití těchto herbicidů v oblastech pěstování cukrové řepy a týkající se dalšího využití půdy, na níž se tyto herbicidy aplikují. Mezi použitím těchto herbicidů a následným využitím pole pro pěstování rostlin cukrové řepy musí v současné době oběhnout čtyřicetiměsíční čekací perioda. Další výhodou vynálezu je, že vysoká imidazolinonová a sulfonylmočovinová rezistence umožňuje použít imidazolinonové herbicidy pro kontrolu plevele v cukrové řepě.

Následující příklady ukazují izolaci a vypěstování nové rostliny cukrové řepy 93R30B, jak ukazuje obr. 1.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

1. Selekce imidazolinonové a sulfonylmočovinové rezistentní variety cukrové řepy 93R30B

Specifikace materiálů

Rel-1 (Regenerating East Lansing-1) je vysoce regenerovatelná linie dvoudomé cukrové řepy, u které plodí pouze samčí rostliny a která se použila pro počáteční buněčnou selekci, při níž se získal herbicidně rezistentní mutant s rezistencí proti sulfonylmočovinám a který se použil jako citlivý kontrolní vzorek pro většinu experimentů.

CR1-B Tento izolát cukrové řepy se vyvinul naočkováním Rel-1 buněk na médium, obsahující chlorsulfuron. Tato varieta je sulfonylmočovinové rezistentní a má mírnou rezistenci proti triazolopyrimidinovému herbicidu flumetsulanu, ale nemá žádnou imidazolinonovou rezistenci. Tuto varietu popsal Saunders a kol. (Cor Sci. 32:1357-1360) a Hart a kol. (Weed Sci. 40:378-383 a 41:317-324). SU rezistentní fen byl označen jako Sur.

93R30B Tento izolát se vyvinul naočkování buněk vysoce regenerovatelné Sur homozygotní rostliny cukrové řepy (potomek CR1-B) na médium obsahující imazethapyr.

EL-49 East Lansing 49, zveřejněný USDA v roce 1993. Linie cukrové řepy homozygotní pro Sur gen, která se použila jako sulfonylmočovinové rezistentní a na imazethapyr citlivá kontrola.

-3CZ 295392 B6

a. Rostliny, které měly sloužit jako výchozí materiály pro somaklonální selekci, se zvolily na základě své schopnosti tvořit za podmínek zahrnujících vysokou koncentraci cytokininu (v B1 médiu) pletivo a regenerovat z tohoto pletiva nové výhonky.

Protokol pro B1 médium:

g/1 sacharózy

100 mg/1 myo-inositolu

1,65 g/1 NH4NO3

1,90 g/1 KNO₃

0,44 g/1 CaCl₂.2H₂O

0,37 g/1 MgSO₄.7H₂O

0,17 g/1 KH₂PO₄

6,2 mg/1 H₃BO₃

16.8 mg/1 MnSO₄.H₂O

10,6 mg/1 ZnSO₄.7H₂O

0,88 mg/1 KI

0,25 mg/1 Na₂MoO₄.2H₂O

0,025 mg/1 CuSO₄.5H₂O

0,025 mg/1 CoCl₂.6H₂O

37,3 mg/1 Na₂EDTA

27.8 mg/1 FeSO₄.7H₂O mg/1 thiaminu

0,5 mg/1 pyridoxinu

0,5 mg/1 kyseliny nikotinové mg/1 benzylaminopurinu pH 5,95

B1 pevné médium se vařilo v autoklávu s 9 g/1 agaru rostlinné kultury a modifikovalo přefiltrovanými a sterilizovanými herbicidními zásobními roztoky podle potřeb selekčního schématu. Agarové médium se nalilo do umělohmotných Petriho misek najedno použití o rozměrech 15 x 100 mm.

B1 kapalné médium se přidalo ve 40ml alikvotních podílech do 125ml Erlenmeyerových baněk a vařilo v autoklávu, aby mohlo být použito v kapalných suspenzních kulturách.

Pro selekci imidazolinonové rezistenci variety 93R30B se jako výchozí materiál použila varieta 93R30 (Sur homozygotní, vyvinutá z CR1-B).

Podrobný popis:

1. Buňky z Rel-1 (SU-S), IM-S, TP-S) se umístily do kultury, která obsahovala buňky, zvolené pro jejich schopnost růst na chlorsulfuronu, a rostlina se regenerovala, čímž se získala CR-1B (popsaná Saundersem a kol., Crop Sci, 32:1357-1360 (1992)).

2. CR-1B se zkřížila s 293 (typičtější cukrovkou) a identifikovaly se F1 samoplodící a homozygotní rostliny pro SU-R, IM-S a TR-R. Rostlina, známá jako EL-49, splňující tento popis, byla zveřejněna v roce 1993 Saundersem (gen se označil jako Sur a byl pro ni homozygotní).

3. Později se potomstvo CR1-B, homozygotní pro Sur zvolilo na základě schopnosti regenerovat z kultury rostliny. Ty potom posloužily jako výchozí materiál (například 93R30) pro imazethapyrovou selekci v kultuře.

4. Z výše popsané selekce se odvodily izoláty, známé jako 93R30A a 93R30B, a rostliny se regenerovaly. Regenerované rostliny měly shodné vlastnosti s vlastnostmi CR1-B a navíc měly IM-R. Zdá se, že gen zodpovědný za IM-R měl alterovanou formu Sur a byl dán identitou SB.

b. Pro selekci imidazolinonové rezistentní varianty se použil následující postup, který je rovněž znázorněn na obr. 2.

-4CZ 295392 B6

Kotoučové explantáty listů se připravily z rychle se rozvíjejících listů výchozí rostliny (93R30). Povrchy listů se sterilizovaly (krok 1) dvěma po sobě jdoucími dvacetiminutovými oplachy 15% komerční bělicí lázní a 0,25% tritonem X-100 (T-9280, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Listy se dvakrát opláchly sterilní deionizovanou vodou. Listové kotouče se vyřízly pomocí korkovrtu č. 3, sterilizovaného plamenem.

Listové kotouče se asepticky umístily na pevné médium B1 (krok 2). Kotouče se inkubovaly ve tmě, při 30 °C, 4 až 8 týdnů, dokud se z listového kotouče nezískala drolivá, bílá, pletivová tkáň. Pletivové tkáně se mechanicky separovaly pomocí nůžek a následně přemístily do 125ml Erlenmeyerových buněk (krok 3), obsahujících 40 ml kapalného média Bl. Baňky se umístily na otočnou protřepávačku při 50 Hz, za nízké intenzity fluorescenčního světla (30 pE/m²s). Kapalné kultury se po jednom týdnu přemístily do čerstvého média Bl.

Dva týdny po aktivaci kapalné kultury se buněčné shluky separovaly pomocí buněčného disociačního síta (Sigma CD-1) s velikostí ok 60 mesh. Po sedimentaci buněk se odstranily přibližně dvě třetiny objemu kapalného média. V kroku 4 se buňky resuspendovaly ve zbývajícím médiu a lml alikvotní podíly se rovnoměrně rozprostřely na pevném Bl médiu, obohaceném 50 nM imazethapyrovým herbicidem (PURSUIT, Američan Cyanamid, Wayne, NJ). Plotny se zabalily a inkubovaly ve tlumeném fluorescenčním světle (5 až 10 pE/m²s) po dobu osmi až dvanácti týdnů.

c. Při 50 nM imazethapyrové koncentraci všechny citlivé buňky odumřely. Buněčné shluky, které při této koncentraci přežily a rostly, byly identifikovány jako potenciálně rezistentní variety. V kroku 5 se tyto buněčné shluky (1 až 3 mm v průměru) přenesly do čerstvého pevného Bl média, které neobsahovalo herbicid, a nechaly se růst za mírného světla (10 až 20 pE/m²s). Každá potenciálně rezistentní varieta se individuálně identifikovala a skladovala samostatně.

d. V kroku 6 se bílé, drolivé pletivo oddělovalo každé čtyři až šest týdnů do čerstvého pevného média Bl, dokud z pletiva nevyrostly jednotlivé výhonky. Tyto výhonky se přenesly do média, určeného pro udržování těchto výhonků (M20), které mělo následující složení:

Protokol pro M20 médium:

g/1 sacharózy

100 mg/1 myo-inositolu

1,65 g/1 NH₄NO₃

1,90 g/1 KNO₃

0,44 g/1 CaCl₂.2H₂O

0,37 g/1 MgSO₄.7H₂O

0,17 g/1 KH₂PO₄

6,2 mg/1 H₃BO₃

16.8 mg/1 MnSO₄.H₂O

10,6 mg/1 ZnSO₄.7H₂O

0,88 mg/1 KI

0,25 mg/1 Na₂MoO₄.2H₂O

0,025 mg/1 CuSO₄.5H₂O

0,025 mg/1 CoC1₂.6H₂O

37,3 mg/1 Na₂EDTA

27.8 mg/1 FeSO₄.7H₂O mg/1 thiaminu

0,5 mg/1 pyridoxinu

0,5 mg/1 kyseliny nikotinové mg/1 benzylaminopurinu pH 5,95

-5CZ 295392 B6

M20 pevné médium se vařilo v autoklávu s 9 g/1 agaru rostlinné kultury a modifikovalo podle potřeb selekčního schématu filtračně sterilizovanými herbicidními zásobními roztoky. Agar se nalil do umělohmotných. Petriho misek najedno použití o rozměrech 20 x 100ml.

Kultury výhonků se skladovaly za mírného fluorescenčního světla 10 až 20 pE/m^{1 2}s a propagovaly rozřezáním pomocí skalpelu. U těchto výhonkových kultur se určovala hladina rezistence způsobem, který bude popsán dále.

2. Míra imidazolinonové, sulfonylmočovinové a triazolopyrimidinsulfonanilidové rezistence ve výhonkové kultuře

V kroku 7 se herbicidní rezistence výhonkových kultur určovaly tak, že se na každou plotnu s médiem M20, obohaceným logaritmicky se zvyšujícími koncentracemi imidazolinonového herbicidu, sulfonylu močoviny nebo triazolopyrimidinsulfonanilidu od 1 nM do 0,1 mM umístily tři malé, stejně velké řezy výhonků. Odezvy kultury 93R30 se porovnaly s odezvami výhonkových kultur citlivé kontroly (Rel-1) a chlorsulfonově rezistentní imidazolinonové citlivé kontroly (EL-49). Výhonkové kultury se tři týdny skladovaly při 25 °C a světelné intenzitě 20 pE/m²s. Odezva výhonkové kultury se určila hodnocením poškození výhonků a čerstvé hmotnosti tři týdny po přenesení do selekčního média. Hodnotu herbicidní rezistence určoval poměr hodnot I₅₀rezistentní a citlivé kultury (I₅₀ = herbicidní koncentrace, způsobující 50% poškození).

Křížová rezistence každé variety se určila výše popsaným způsobem stou výjimkou, že se v médiu použil jiný herbicid. Výhonková kultura 93R30B vykazovala 3600násobnou rezistenci proti imazethapyru, 10 OOOnásobnou rezistenci proti chlorsulfuronu a 60násobnou křížovou rezistenci proti triazolonpyrimidinsulfonanilidovému herbicidu flumetsulam, jak ukazuje tabulka

1. Pro porovnání, EL-49 vykazuje pouze trojnásobnou rezistenci proti imazethapyru.

Tabulka 1

Hodnota rezistence a křížové rezistence výhonkové kultury

Herbicid	Rodina herbicidů⁶	Rel-1	93R30B	EL-49
		I₅o⁵ (μΜ)	I₅₀ (pM)R/S⁴	I₅₀(gM)R/S
Imazethapyr	IM	0,018	64 3600X	0,053 3X
Imazethabenzmethyl	IM	0,80	>100>125X	20 25X
Imazaquin	IM	0,040	16 400X	0,040 IX
AC299,263‘	IM	0,030	40 1400X	0,070 3X
Chlorsulfuron²	SU	0,0025	25 10000X	25 10000X
Flumetsulam³	TP	0,028	1,7 60X	1,1 40X

¹ - Imadazolinon RAPTOR (Američan Cyanamid, Wayne, NJ) ² - Sulfonylmočovina - GLEAN (Dupont, Wilmington, DE) ³ - Triazolopyrimidinsulfonanilid (BROADSTRIKE, Dow Elanco, Indianopolis, IN) ⁴ - R/S = poměr I₅₀ hodnot rezistentních a citlivých kultur pro konkrétní testované herbicidy ⁵ - I₅₀ je koncentrace herbicidů potřebná pro způsobení 50% poškození výhonkové kultury ⁶ - Klasifikace herbicidní rodiny: IM = imidazolinon; SU = sulfonylmočovina; a TP = triazolopyrimidinsulfonanilid

3. Regerenace a pěstování rostliny

V kroku 8 se výhonkové kultury 93R30B regenerovaly podobným způsobem na celé rostliny. Dva týdny po předchozí subkultivaci výhonků se výhonky 93R30B přemístily do 125ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 40 ml N3 média, které podporuje zakořenění rostlin.

-6CZ 295392 B6

Protokol pro N3 médium:

g/1 sacharózy

100 mg/1 myo-inositolu

1,65 g/1 NH₄NO₃

1,90 g/1 KNO₃

0,44 g/1 CaCl₂.2H₂O

0,37 g/1 MgSO₄.7H₂O

0,17 g/1 KH₂PO₄

6,2 mg/1 H₃BO₃

16.8 mg/1 MnSO₄.H₂O

10,6 mg/1 ZnSO₄.7H₂O

0,88 mg/1 Kl

0,25 mg/1 Na₂MoO₄.2H₂O

0,025 mg/1 CuSO₄.5H₂O

0,025 mg/1 CoCl₂.6H₂O

37,3 mg/1 Na₂EDTA

27.8 mg/1 FeSO₄.7H₂O mg/1 thiaminu

0,5 mg/1 pyridoxinu

0,5 mg/1 kyseliny nikotinové mg/1 benzylaminopurinu pH 5,95

N3 médium se přidalo ve 40ml alikvotních podílech do 125ml Erlenmeyerových baněk, načež se do každé baňky přidalo 9 g/1 agaru (0,45 g) a médium se vařilo v autoklávu, aby mohlo být dále použito při zakořeňování výhonkových kultur. Kultury se následně na 24 hodin přemístily na denní světlo se střední světelnou intenzitou (40 až 60 pE/m²s), kde se udržovala teplota 25 °C. O šest až osm týdnů později se zpravidla vytvořily kořeny.

V kroku 9 se zakořeněné výhonky (Ro-generace) zasadily do hrnkové směsi Baccto (Michigan Peat Co., Houston, TX) a umístily do skleníku. V kroku 10 se rostliny Ro-generace 93R30B regenerátů zkřížily s rostlinou cukrové řepy s hladkým kořenem s označením 293 nebo s REL-1. Semena F^generace z těchto křížení byla samoopylovací a poskytla semena Ro-generace. Dalo se předpokládat, že imidazolinonová rezistence je dominantním nebo semidominantním monogenním znakem. Rostliny F₂-generace, které jsou výsledkem samoopylovací imidazolinonově a sulfonylmočovinově rezistentních rostlin Fi-generace by se měly segregovat v genotypovém štěpném poměru 1 homozygotně rezistentní ku 2 heterozygotně rezistentnímu ku 1 homozygotně citlivému, jak v případě imidazolinonově tak sulfonylmočovinově rezistence.

Existují důkazy o tom, že imidazolinonová rezistence je dominantním znakem ve varietě 93R30B. Tento závěr vyplývá z výsledků testů Fi-generace, vzniklé křížením 93R30B linie a herbicidně citlivé linie cukrové řepy 293, u které dochází k oplodnění pouze samčích rostlin nebo Rel-1, které segregují v poměru 1:1, pokud jde o IM-R nebo IM-S. K podobné ko-segregaci IM-R a SU-R došlo u všech doposud testovaných rostlin F₂-generace nebo zpětných hybridů (BCi). Z toho vyplývá, že oddělené alterace na stejné ALS alele způsobují tyto dvě rezistence. Rezistence nebo citlivost rostliny Fi-generace na imazethapyr a chlorsulfuron se určila pomocí nedestruktivního testu expanze listového kotouče.

Zkušební protokol

Tento test je nedestruktivním testem, navrženým pro analyzování rostlin cukrové řepy, segregovaných pro herbicidní rezistenci, a pro určení toho, zda se jedná o rezistentní nebo citlivé druhy bez toho, zda se jedná o rezistentní nebo citlivé druhy bez toho, že by musely být podrobeny postemergentnímu postřiku těmito herbicidy.

1. Z rostliny se odřízl nově se rozvíjející list (alespoň čtvrtý pravý list).

2. Povrch listu se sterilizoval dvěma dvacetiminutovými oplachy 15% komerční bělicí lázní a 0,025% Tritonem X-100, načež se dvakrát opláchl sterilizovanou destilovanou vodou.

3. Listový kotoučový explantát se vyřízl pomocí korkovrtu č. 3, sterilizovaného plamenem.

4. Listové kotouče se přemístily do B1 média, které neobsahovalo žádný herbicid nebo obsahovalo 10 nM imazethapyru nebo 100 nM chlorsulfuronu. Plotny se rozdělily na čtyři sekce tak, že se čtyři vzorky testovaly pomocí jedné plotny. Čtyři nebo pět kotoučových vzorků se přidalo ke každému vzorku do každé plotny.

5. Plotny se zabalily a inkubovaly 4 až 7 dní při 25 °C a nízké světelné intenzitě (přibližně 10 pE/m²s).

6. Rezistentní vzorky se identifikovaly na základě jejich schopnosti přežít a expandovat na selektivním médiu. Citlivé vzorky na tomto selektivním médiu neexpandují a zežloutnou až zhnědnou. Účinky se porovnaly s expanzí listových kotoučů umístěných na médiu, které neobsahuje herbicid, aby se zajistilo přesné stanovení očekávané úrovně expanze kotouče.

4. Odezva ALS cílového enzymu na imazethapyr

K parciální purifíkaci ALS z rychle se rozvíjejících listů rostlin cukrové řepy, pěstovaných ve skleníku, se použily standardní postupy (Hart a kol., Weed Science 40:378-383 (1992)). Extrakty z heterozygotních 93R30B rostlin Fi-generace a semena Rel-1 Si se analyzovaly s cílem určit aktivitu ALS enzymu v přítomnosti logaritmicky se zvyšujících koncentrací imazethapyru. ALS aktivita se určila z listových extraktů REL-1 a 93R30B linií cukrové řepy. Rostliny se nechaly vyrůst ve skleníku výše popsaným způsobem až do stadia, kdy měly čtyři až šest listů. ALS aktivita z čerstvých extraktů se určovala v přítomnosti imazethapyru a chlorsulfuronu při logaritmicky se zvyšujících koncentracích. Pro tyto účely se použily způsoby a postupy, které byly modifikací způsobů a postupů navržených Rayem (Plant Physiol. 75:827-831 (1984)) a Shanerem a kol., (Plant Physiol. 76:545-546 (1984)). 10 g listů cukrové řepy se homogenizovalo ve 40 ml studeného homogenizačního pufru (0,1 Μ K₂HPO₄, pH 7,5, 1 mM pyruvátu sodného, 0,5 mM MgCl₂, 0,5 mM thiaminpyrofosfátu, 10 μΜ flavinadenindinukleotidu, 10% (obj.) glycerol) a 2,5 g polyvinylpolypyrolidonu. Homogenát se přefiltroval přes osm vrstev procezovacích plátýnek a odstřeďoval při 27 000 G po dobu dvaceti minut. Po odstranění supematantu se u homogenátu dosáhlo 50% nasycení přidáním síranu amonného. Tento roztok se jednu hodinu udržoval při 0 °C, načež se 15 minut odstřeďoval při 18 000 G, pelety se opět rozpustily v 1 ml resuspendačního pufru (0,1 M K₂HPO₄, pH 7,5, 20 mM pyruvátu sodného, 0,5 mM MgCl₂) a zbavil soli na koloně Sephadex G-25 PD-10⁵. Enzymové extrakty se okamžitě použily pro analýzu.

ALS aktivita se měřila přidáním 0,2 ml enzymového přípravku (naředěným v poměru 3:1 resuspendačním pufrem) do 1,3 ml reakčního pufru (25 mM K₂HPO₄, pH 7,0, 0,625 mM MgCl₂, 25 mM pyruvátu sodného, 0,625 mM thiaminpyrofosfátu, 1,25 μΜ flavinadenindinukleotidu) a jednohodinovou inkubací při 35 °C. Reakční směsi obsahovaly 0, 4, 40, 400, 4000, 40 000, 400 000 nebo 4 000 000 nM imazethapyru nebo 0, 0,9, 9, 90, 900, 9000 nebo 90 000 nM chlorsulfuronu. Reakce se zastavila přidáním 50 μΐ 6N H₂SO₄ a patnáctiminutovou inkubací při 60 °C. Tento způsob, jak popsal Westerfield (J. Biol. Chem. 16:495-502 (1945)), rovněž dekarboxyluje ALS enzymový produkt acetolaktát za vzniku acetoinu. Obarvený acetoinový komplex se připravil přidáním 1 ml 2,5% hmotn. α-naftolu a 0,25% hmotn. kreatinu ve 2,5N NaOH a patnáctiminutovou inkubací při 60 °C.

Koupený acetoin se použil jako standard pro kolorimetrickou reakci. Koncentrace acetoinu se určily na základě měření absorpce reakčního roztoku při 530 nm. Experimenty pro každý herbicid se opakovaly třikrát. Koncentrace proteinu v extraktech se určila Bratfordovou metodou

-8CZ 295392 B6 (Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)) za použití albuminu bovinního séra pro sestavení standardní křivky.

Experimenty se prováděly dvakrát a ošetření se opakovala třikrát. Obr. 3 znázorňuje odezvu ALS extraktu z variety 93R30B a citlivé variety Rel-1. 93R30B vykazuje 1750násobnou rezistenci proti imazethapyru při dané hladině enzymu (jak ukázal poměr hodnot I₅₀ pro rezistentní a citlivé linie).

5. Počet ALS genových kopií

Analýza Southemova přenosu se prováděla s cílem určit počet ALS genových kopií, přítomných v citlivé varietě cukrové řepy. Genomová DNA se izolovala z citlivých rostlin F₃-generace, vypěstovaných z původního mutanta Sir—13, a analyzovala se za použití běžně praktikovaných technik (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley And Sons, New York (1991)). Podobným způsobem se analyzovala genomová DNA, získaná z komerční variety cukrové řepy. V obou liniích cukrové řepy byla detekována jediná kopie ALS genu. Tato skutečnost by naznačovala, že by veškerá ALS enzymová aktivita homozygotně mutantního typu cukrové řepy sestávala z rezistentní enzymové formy. To rovněž podporuje předpoklad, že SB změna, pozorovaná v izolátu 93R30B je změněnou formou Sur ALS alely. To se potvrdilo níže popsaným způsobem.

6. Mutace ALS genu

Ke stanovení molekulové báze pro ALS enzymovou rezistenci se použily standardní techniky, které se používají pro sekvencování dvou oblastí ALS genu, ve kterých se vyskytovaly dříve zveřejněné mutace způsobující herbicidní rezistenci (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York (1991)). ALS gen cukrové řepy byl již sekvencován (patent US 5 378 824) a rovněž byly navrženy primery polymerázové řetězové reakce (PCR) pro amplifíkaci těchto dvou oblastí genu, které jsou v již uveřejněných případech zodpovědné za herbicidní rezistenci rostlin. Porovnání sekvenčních dat, získaných ze SU-R IM-S TP-R (Sur), SU-R IM-R TP-R (SB) a senzitivní (Rel-1) cukrové řepy ukázalo, že herbicidní rezistence 93R30B variet je dána dvěmi nezávislými mutacemi vALS genu.

Mutace způsobující SU-R IM-S TP-R (Sur) je výsledkem jediné nukleotidové změny z cytosinu na thymin v poloze 562 v nukleotidové sekvenci, k níž došlo v důsledku nahrazení prolinu v poloze 188 v ALS aminokyselinové sekvenci cukrové řepy serinem. Toto místo, jak bylo zjištěno dříve, se rovněž podílí na sulfonylmočovinové rezistenci Arabidopsis thaliana (Haughn a kol., Molecular and Generál Genetics 211:266-271 (1988)) u tabáku (Lee a kol., EMBO J. 7:1241-1248 (1988)) a kvasinek (patent US 5 378 824). V již zmíněných dvou oblastech ALS genů oproti standardnímu typu nebyly u analyzovaných vzorků pozorovány žádné další podstatné změny nukleotidové sekvence.

Mutace způsobující SU-R IM-R TP-R (SB) je výsledkem dvou nezávislých mutací v ALS nukleotidové sekvenci, které způsobují dvě různé aminokyselinové změny. První změna je identická s výše popsanou Sur mutací. Tyto výsledky se daly očekávat vzhledem k tomu, že rostlina cukrové řepy (93R30) sloužila jako výchozí materiál pro IM-R selekci. Kromě této zmíněné mutace byla pozorována ještě další nukleotidová změna v poloze 337, a to změna z guaninu na adenin. Tato druhá mutace má za následek náhradu alaninu, v poloze 113 aminokyselinové sekvence cukrové řepy, threoninem. Toto místo, jak bylo zjištěno dříve, se rovněž podílí na imidazolinonové rezistenci u řepeně (Bemasconi a kol., J. Biol. Chem. 270:17381-17385 (1995)) a sulfonylmočovinové rezistenci u kvasinek (patent US 5 378 824). Žádné další podstatné změny v těchto dvou oblastech analyzovaného ALS genu oproti standardnímu typu nukleové sekvence nebyly zjištěny.

Následující informace ukazuje na synergismus herbicidní rezistence možných mutací Alan₃ -> Thr a Projgs -> Ser.

-9CZ 295392 B6

Dvojitá mutace ALS genu SB cukrové řepy poskytuje herbicidní rezistenci proti kombinaci chemických rodin, udělenou každou z těchto jednotlivých mutantních variet cukrové řepy jednotlivě (tj. Sur a Sir-13). Obr. 4 znázorňuje základní křížovou rezistenci dvou jednotlivých mutantů (Sur a Sir-13) a dvojitého mutanta (SB). Aminokyseliny znázorněné na obr. 4 reprezentují pět přesně konzervovaných zbytků, které, jak uvádí odborná literatura, se podílí na ALSinhibující herbicidní rezistenci u rostlin. Interakce nezávislých mutací ve dvojitě mutovaném enzymu (a odpovídajících rostlinách) je unikátní. Výsledkem kombinace IM-specifícké rezistence, pozorované v souvislosti se Sir-13 aminokyselinovou substitucí (Alan₃ Thr) a SU- a TPrezistence, pozorované v souvislosti se Sur substitucí (Pro_J88 -> Ser) je cukrová řepa 93R30B (a.k.a. SB), která je rezistentní proti všem třem třídám herbicidních chemikálií.

Nicméně tato rezistence není aditivní, ale jednotlivé mutace mají synergickou rezistenci v porovnání s rezistencí proti imidazolinonovým herbicidům imazethapyru a AC 299,263. Tento jev je možné pozorovat na obr. 5 a 6 a kvantitativně posoudit na základě údajů uvedených v tabulce 2.

Tabulka 2

Odezva celých rostlin cukrové řepy na postemergentní aplikaci ALS-inhibičních herbicidů

		Linie cukrové řepy
		Rel-1	Sir-13	Sur	93R30B
Herbicid	Třída	I₅₀ (gha^-1)	R/S	R/S	R/S
Imazethapyr	IMI	0,5	100 X	3X	300 X
AC 299,263	IMI	1,1	130 X	4X	>250 X
Chlorsulfuron	SU	0,07	IX	>1000 X	20 X
Sulfometuron	SU	0,2	IX	23 X	4X

Jednotlivé mutace cukrové řepy, Sur a Sir-13, vykazují trojnásobnou a stonásobnou rezistenci proti imazethapyru; zatímco dvojitý mutant SB je, pokud se aplikuje postemergentně na celou rostlinu, třistanásobně rezistentní proti herbicidu. Podporou pro tento synergismus je odezva ALS enzymu, získaného z jednotlivých mutantů na imazethapyr (obr. 7). Synergická rezistence na herbicid je opět u dvojitého mutanta SB více než tisícinásobná, zatímco v případě jednoduchých mutantů Sur a Sir-13 je jednonásobná resp. čtyřicetinásobná.

Podobný synergismus lze nalézt pro TP třídu herbicidů. Rezistence výhonků v případě jednoduchých mutantů Sir a Sir-13 byla čtyřicetinásobná resp. jednonásobná a v případě dvojitého mutanta SB byla šedesátinásobná. Výsledky, získané při analyzování ALS enzymu, tento zjištěný synergismus ještě podepřely. V případě jednoduchých mutantů Sur a Sir-13 byla zjištěna padesátinásobná resp. trojnásobná rezistence proti flumetsulamu a v případě dvojitého mutanta SB byla zjištěna dvousetnásobná rezistence (obr. 8). Jak ukázalo pozorování rezistence celých rostlin (obr. 9), druhá mutace u SB skutečně redukovala rezistenci chlorsulfuronu (SU třída herbicidů). V případě chlorsulfuronu se rezistence celých rostlin dvojitého mutanta SB (dvacetinásobná) přidáním Sir-13 ekvivalentní mutace (Alan₃ Thr) (jednonásobná rezistence) k SU-rezistentnímu genu Sur (PrO]₈₈ -> Ser) (více než tisícinásobná rezistence) (tabulka 2) sníží o více než padesátinásobek. Důvod antagonismu mezi Sur jednotlivým mutantem a SB dvojitým mutantem není doposud znám. Na ALS enzymatické úrovni byla v případě chlorsulfuronu rovněž pozorována synergická rezistence (obr. 10).

Je zřejmé, že lze nejprve provést výběr imidazolinonově rezistentních rostlin a potom teprve takto zvoleným rostlinám udělit sulfonylmočovinovourezistenci.

-10CZ 295392 B6

Nakonec je třeba zmínit, že výše uvedené příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky. Aminokyselinové sekvence znázorněné na obr. 4 jsou znázorněny vSEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4.

DODATEK 1

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) údaje k SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY:

(A) popis: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: cukrová řepa (B) KMEN: wt (C) INDIVIDUUM/IZOLÁT:

(G) BUNĚČNÝ TYP: N/A (ix) ZNAKY:

(A) NÁZEV/KLÍČ:

(B) POZICE:

(C) METODA IDENTIFIKACE: podobností s jinou známou sekvencí nebo se zavedenou konsensus-sekvencí (D) JINÉ INFORMACE:

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

Ala Pro Ala Trp Ser (2) údaje k SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) popis: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne

-11CZ 295392 B6 (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: cukrová řepa (B) KMEN: Sir-13 (C) INDIVIDUUM/IZOLÁT: N/A (G) BUNĚČNÝ TYP: N/A (ix) ZNAKY:

(A) NÁZEV/KLÍČ:

(B) POZICE:

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Thr Pro Ala Trp Ser (3) údaje k SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) ORGANIZMUS: cukrová řepa (B) KMEN: Sur (C) INDIVIDUUM/IZOLÁT: N/A (G) BUNĚČNÝ TYP: N/A (ix) ZNAKY:

(A) NÁZEV/KLÍČ:

(B) POZICE:

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

Ala Ser Ala Trp Ser (4) údaje k SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5

-12CZ 295392 B6 (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY:

(A) ORGANIZMUS: cukrová řepa (B) KMEN: 9R30B (C) INDIVIDUUM/IZOLÁT: N/A (G) BUNĚČNÝ TYP: N/A (ix) ZNAKY:

(A) NÁZEV/KLÍČ:

(B) POZICE:

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

Thr Ser Ala Trp Ser

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rostlinný materiál cukrové řepy, který sestává z buněk s mutovaným acetolaktátsyntázovým genem kódujícím syntázu, v němž jsou modifikovány nukleotidy v poloze 562, kde je cytosin nahrazen thyminem, a v poloze 337, kde je guanin nahrazen adeninem, přičemž mutované buňky mají rezistenci jak proti imidazolinonovým, tak proti sulfonylmočovinovým herbicidům a tato rezistence se přenáší konvenčním křížením rostlin vyprodukovaných z buněk a tyto buňky jsou regenerovatelné na rostlinu.
2. Rostlinný materiál cukrové řepy podle nároku 1, který se odvodí z citlivých buněk rodičovské rostliny cukrové řepy, označených jako CR1-B a uložených jako ATCC 97961, které mají rezistenci proti sulfonylmočovinovým herbicidům a nemají žádnou rezistenci proti imidazolinonovým herbicidům, kultivací citlivých buněk v kultivačním médiu s imidazolinonovým herbicidem za účelem výběru mutovaných buněk.
3. Rostlinný materiál cukrové řepy podle nároku 1, který je uložen ve formě semene pod označením ATCC 97535 (93R30B).
4. Rostlinný materiál cukrové řepy podle některého z nároku 1 nebo 2, který má formu semene nebo propagačního materiálu.

-13CZ 295392 B6
5. Způsob produkce herbicidně rezistentní rostliny cukrové řepy, vyznačený tím, že zahrnuje:

(a) vystavení prvních buněk cukrové řepy působení imidazolinonového herbicidu s mutovaným acetolaktátsyntázovým genem kódujícím syntázu, přičemž nukleotidy v poloze 562 jsou v kultivačním médiu modifikovány z cytosinu na thymin a v poloze 337 z guaninu na adenin a homozygotním znakem prvních buněk v kulturním médiu je rezistence proti sulfonylmočovinovému herbicidu; a (b) výběr druhých buněk, které mají rezistenci proti oběma herbicidům.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že druhé buňky jsou odvozené z prvních buněk rostliny cukrové řepy, označených jako 93R30 (SurSur) a uložených pod označením ATCC 97961, vystavením těchto buněk 93R30 působení imidazolinonového herbicidu.
7. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že druhé buňky jsou uloženy ve formě semene pod označením ATCC 97535 (93R30B).
8. Způsob výroby herbicidně rezistentní křížené rostliny, vyznačený tím, že (a) se z druhých buněk vypěstuje první rostlina, přičemž druhé buňky se vyberou způsobem podle nároku 5; a (b) první rostlina z kroku (a) se dále kříží s řepnou rostlinou za vzniku křížené rostliny, která má herbicidní rezistenci.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že řepnou rostlinou v kroku (b) je rostlina cukrové řepy.
10. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že se první buňky v kroku (a) odvodí z cukrové řepy, označené jako 93R30 a uložené pod označením ATCC 97961, vystavením buněk 93R30 působení imidazolinonového derivátu.
11. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že druhé buňky jsou uloženy ve formě semene pod označením ATCC 97535 (93R30B).
12. Způsob kontroly plevele rostoucího společně srostlinami cukrové řepy, vyznačený tím, že zahrnuje:

(a) vypěstování semen polní cukrové řepy, které obsahují buňky podle nároku 1; a (b) aplikaci imidazolinonového herbicidu na rostlinu na poli za účelem kontroly plevelů.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačený tím, že se tato rostlina odvodí z citlivých buněk rodičovské rostliny cukrové řepy, označených jako CR1-B a uložených jako ATCC 97961, které mají rezistenci proti sulfonylmočovinovým herbicidům a nemají žádnou rezistenci proti imidazolinonovým herbicidům, kultivací citlivých buněk v kultivačním médiu s imidazolinonovým herbicidem za účelem výběru mutovaných buněk.
14. Způsob podle nároku 12, vyznačený tím, že rostlina je odvozena ze semene, uloženého pod označením ATCC 97535 (93R30B).