JPS602184A - 生きた単離可能な雑種細胞の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、２つの生きた細胞、好ましくは悪性細胞と
正常細胞の間で形成される生きた、単離可能な雑種細胞
の製造方法に関する。さらに詳細に言うと、この発明は
、細胞融合の技術を用いた単一クローン抗体の製造方法
に関する。

最近、細胞融合として知られる技術が開発された。この
技術では、いわゆる雑種細胞が、それぞれの親細胞の所
望の性質を示すように２つの類似した又は非類似の親細
胞から形成される。典型的には、親細胞の１つとして、
継続的に生育し、分裂することができる、悪性細胞（例
えばミエローマ細胞）が選ばれる。これは、雑種細胞自
体が、継続的に分裂できるという望ましい性質を示し、
それによって、均一な雑種細胞集団（「ハイブリドーマ
」と呼ばれる）を生育できるようにすることを意図して
行なわれる。

雑種細胞の他方の親細胞は、何らかの所望の性質を示す
が継続的に分裂する□ことができない、いわゆる「正常
」細胞である。正常細胞の所望の性質は、典型的には、
抗体のような生産物を生産することである。継続的に分
裂する細胞と、この正常な抗体産生細胞との間の雑種細
胞は、理想的には、親正常細胞の抗体産生能力と、他方
の親の継続的分裂性を示し、このため、所望の抗体を大
量に生産する潜在的能力を有する。以下の議論において
は、簡単のため、継続的分裂細胞を、例示的に、悪性の
ミエローマ細胞であるとして議論を進める。

悪性（ミエローマ）細胞と抗体産生細胞との融合は、い
わゆる「単一クローン」抗体の製造に用いられており、
実際、このような抗体を製造しようという要望は、細胞
融合技術の発展に負うところが大きい。ミエローマ細胞
と抗体産生細胞との雑種細胞は、単一の（単一クローン
性の）生産物を産生ずる。なぜなら、雑種細胞を形成す
るのに、抗体産生細胞としては１つの細胞のみが用いら
れており、この１つの抗体産生細胞はそれ自身、１つの
型の生産物のみをつくることができるからである。従っ
て、ミエローマ細胞集団を融合条件下で抗体産生細胞（
全体としては多くの異なった生産物又は抗体を産生じて
いる）と混合すると、１つのミエローマ細胞と１つの抗
体産生細胞とからなる雑種細胞が複数形成される。それ
ぞれの雑種細胞は１次に、それぞれの特定の１つの生産
物を生産するのに十分な程度にまで増殖させられ、この
生産物は、それが例えば特定の抗原に対する抗体である
か否か調べられる。

有用な雑種細胞（例えば抗体を生産する）を形成するた
めの融合技術の効率は、混合細胞集団から、ミエローマ
細胞と正常細胞との雑種細胞を単離する能力、及び、そ
の後の第２段階において、これらの雑種細胞から特定の
所望の抗体を産生ずる細胞を単離する能力に大きく依存
している。従って、例えば、融合条件下でミエローマ細
胞集団を正常細胞集団（抗体を産生じている）と混合す
ると、得られた細胞集団は、以下の細胞を含んでいる。

（ａ）　ミエローマ細胞と正常細胞との雑種細胞（ｂ）
２つのミエローマ細胞同志の雑種細胞（Ｃ）２つの正常
細胞同志の雑種細胞 （ｄ）融合しなかった正常細胞 （ｅ）融合しなかったミエローマ細胞 第１の単離においては、（ａ）の範噂に入るもののみが
められている。範ＩＩ　（ａ）、（ｂ）　、及び（ｅ）
に属する細胞は、範鴎（Ｃ）及び（ｄ）に属する細胞か
ら「単離」することができる。なぜなら、正常細胞は、
継続的分裂ができないので、最終的には死滅するからで
ある。しかしながら、範ＩＩ　（ｂ）及び（ｃ）の細胞
から範ＩＩＩ　（ａ）の細胞を単離することは困難であ
る。なぜなら、これらの細胞は全て継続的分裂が可能だ
からである。この単離を行なうために、融合操作におい
て、ミエローマ細胞集団として、いわゆる「突然変異」
ミエローマ細胞を用いることが開発された。すなわち、
特定の培地中において、生存に必要な物質を遺伝的に欠
く突然変異ミエローマ細胞が、融合操作に用いられる。

これらの細胞と正常細胞とは上述の培地中で混合され、
融合される（あるいは、これらの細胞と正常細胞を混合
して融合を行なった後、得られた細胞を上述の培地に懸
濁する）。融合しなかった突然変異ミエローマ細胞及び
２つの突然変異ミエローマ細胞から形成された雑種細胞
は最終的にこの培地中で死減し、一方、突然変異ミエロ
ーマ細胞と正常細胞とから形成された所望の雑種細胞は
生存することができる。なぜなら、突然変異ミエローマ
細胞の遺伝的欠陥は、雑種細胞を構成する正常細胞によ
って補われるからである。

この単離方法の１例として、ヒボキサンチンフォスフォ
リポシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）欠損の突然変
異ミエローマ細胞を用いることを挙げることができる。

このような細胞の増殖は、選択ヒボキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン（ＨＡ　Ｔ）培地によって阻害され
る。従って、全ての細胞をこの培地中に懸濁すると、突
然変異ミエローマ細胞と正常細胞とから形成された雑種
細胞のみが選択的に増殖する。

上述の方法によってミエローマ細胞と正常細胞との雑種
細胞を有効に単離することができるけれども、何らかの
遺伝的欠陥を有する突然変異ミエローマ細胞を用いなけ
ればならないので、融合操作そのものが限定される。一
方でこのような突然変異ミエローマ細胞を発見し単離す
ることは、時間と費用を要する極めてやっかいな仕事で
あり、例えば単一クローン抗体の生産のための手段とし
ての融合技術の経済性が低下する。他方、既知のミエロ
ーマ細胞ラインは少数であるので、融合操作に用いるこ
とができる細胞、培地等が限定され、望ましくない。

この発明の目的は、予め特定の突然変異細胞を生産した
り利用したりすることなく、継続的分裂が可能な細胞と
正常細胞との雑種細胞を形成する方法を提供することで
ある。

この発明のもう１つの目的は、単一クローン抗体をつく
るための、上述したような方法を提供することである。

これら及び他の目的は、継続的分裂可能細胞と正常細胞
との雑種細胞を形成する方法であって、継続的分裂可能
細胞として、突然変異の結果得られたものではなく、特
定の培地中での生存に必要な成分を不活性化する化学的
処理を受けたものを用いる方法を提供することによって
達成される。

この発明の方法の１実施例では、ミエローマ細胞を、ミ
エローマ細胞のジヒドロ葉酸還元酵素を不活性化する剤
（例えばメトトレキセート又はアミノプテリン）で処理
する。ジヒドロ葉酸還元酵素は、全ての生きた細胞中に
存在し、ジヒドロ葉酸をフォリニン酸に転化するもので
ある。フォリニン酸は、全ての哺乳動物細胞が生存のた
めに必要とするものである。従って、そのジヒドロ葉酸
還元酵素が不活性化された（メトトレキセート又はアミ
ノプテリンが酵素に結合することによって）ミエローマ
細胞は、ジヒドロ葉酸を含む培地中では生存できない。

なぜなら、これらの処理されたミエローマ細胞は、ジヒ
ドロ葉酸を必要なフォリニン酸に転化することができな
いからである。しかしながら、処理されたミエローマ細
胞のうち正常細胞と融合したものはこのような培地中で
生存することができる。なぜなら、雑種細胞を構成して
いる正常細胞が雑種細胞に対し、必要なフォリニン酸を
生産するのに必要なジヒドロ葉酸還元酵素を与えるから
である。

以下の説明では、上述したように化学的な処理を受けた
細胞を用いた融合方法自体をやや一般的に先ず説明し、
その後で、化学的処理について詳細に説明する。

融合操作においては、「継続的に分裂する」細胞集団と
、「正常」細胞集団とが準備される。

後者は、雑種細胞が持つことがめられている何らかの所
望の性質を有している。継続的に分裂する親細胞が有す
る継続的分裂性の故に、正常細胞の所望の性質は、潜在
的に永久化される。

この発明に用いられる継続分裂細胞は、全ての又は特定
の培地ないしは環境内で継続的に増殖できる能力を有し
、その継続的増殖能力を雑種細胞に与えることができる
ものであれば、どのような細胞でもよい。典型的には、
この継続的分裂細胞は、ミエローマ細胞のような悪性細
胞である。

しかしながら、あるいは、継続分裂細胞は、非悪性細胞
であって、特定の化合物又は培地の存在下で継続的に増
殖するものであってもよい。このようなものの例として
、Ｔ細胞増殖因子の存在下におけるＴ細胞を挙げること
ができる。この場合には、正常細胞とＴ細胞との雑種細
胞は、Ｔ細胞増殖因子の存在下において望ましく継続的
に分裂する。

従来技術においては、継続的分裂細胞はまた、このよう
な細胞と正常細胞との雑種細胞を他の全１の細胞から単
離することを可能にするために、突然変異細胞であるこ
とが要求される。この発明の方法はそれほど限定されな
い、なぜなら、継続的分裂細胞を予め化学的に処理する
ことによって、融合しなかった継続分裂細胞が死滅する
ことが確保されているからである。

再び、説明を簡単にするために、以下の説明では、継続
的分裂細胞を悪性ミエローマ細胞として話を進める。

また、例示のため、正常岬胞は、少なくともそのうちの
あるものが、単離及び採集することがめられている特定
の所望の抗体を産生ずる細胞集団であるとして話を進め
る。正常細胞集団中の他の細胞は、生産物を全く生産し
て−いないか、又は、特定の所望の抗体以外の他の生産
物（例えば抗体）を生産しているものであってよい。

上述した正常細胞集団は、以下に述べるような種々の方
法によって得ることができる。

（ａ）生物を、所望の抗体に対して特異的な抗原で免疫
化し、その生物から細胞を分離する（例えば、免疫化し
た生物からリンパ球を集めることによって）。

（ｂ）所望の抗体に対して特異的な抗原の存在を示す疾
病状態にある生物によって生産された細胞を分離する。

例えば、潰瘍を有する、又は潰瘍が治癒した生物は、潰
瘍抗原に対する抗体を産生ずる細胞を有しているであろ
う。

（Ｃ）生物の正常細胞を、生体外において、所望の抗体
に対して特異的な抗原で攻撃する。

（ｄ）生物の正常細胞を、生体外において、その生物が
遺伝的に生産する能力を有する全ての抗体（所望の抗体
をも含む）を当該細胞に生産せしめることができる化学
物質で処理する。こ′のような化学物質の例として、リ
ボ多糖類及び種々の植物レクチンを挙げることができる
。

正常細胞集団と処理゛ミエローマ細胞とは、融合操作の
１態様に従って、ポリエチレングリコールやセンダイウ
ィルスのような「融合化」剤の存在下で、適当な容器中
で混合される。融合化剤により、混合細胞集団は互いに
ランダムに付着され、一連の融合細胞又はダブレットが
形成される。これらのダブレットのいくつかが雑種細胞
になる。融合が起きるのに十分な時間経過後、全ての細
胞（とりわけ、ミエローマ細胞と正常細胞との融合細胞
、２つのミエローマ細胞の融合細胞、２つの正常細胞の
融合細胞、融合しなかった正常細胞又はミエローマ細胞
）を、ミエローマ細胞集団の化学的前処理の故に、正常
細胞と融合しなかったミエローマ細胞がその中では生き
ることができない培地中に懸濁する。同時に、ミエロー
マ細胞と融合しなかった正常細胞は死滅する。なぜなら
、それらは継続的に分裂することができないからである
。残った生存し分裂する細胞（すなわち、ミエローマ細
胞／正常細胞雑種細胞）を次に、１個の細胞から適当な
数にまで増殖させ、その特定のハイブリドーマが特定の
所望の抗体を産生しているものであるか否かを試験する
。

もう１つの雑種化操作自体の態様では、最初に細胞を付
着させるために融合化剤を用いない。

この方法は、本出願人が１９７９年１１月１日に出願し
た米国特許出願筒９０，１３０号に詳細に記載されてい
る。その発明の名称は、「単一クローン抗体の製造方法
」である。米国特許出願筒９０　、１３０号に対応する
欧州特許出願力５１９８３年５月１８日に特許されてお
り、この特許はこの明細書に組み入れられたものとする
。簡単に言えば、この方法は、ミエローマ細胞と正常細
胞との全ての雑種細胞がうま〈分離されたとしても（突
然変異ミエローマ細胞又はこの発明のように化学的に処
理されたミエローマ細胞を用いることによって）、これ
らの雑種細胞の中からさらに、所望の特定の抗体を産生
じているもののみを単離する必要があるという事実に注
目して考え出された。最初の細胞付着を達成するために
用いられる融合化剤はランダムで非特異的なものであり
、従って、ミエローマ細胞と正常細胞との単°離可能な
雑種細胞は多数得られるが、これらのうちの極めてわず
かのもののみが所望の特定の抗体を産生じて゛いる正常
細胞とミエローマ細胞との雑種細胞である。さらに、後
者の雑種細胞であっても、何らかの理由により、所望の
特定の抗体を生産する能力をすでに有していないものも
ある。融合化剤を用いた既知の雑種化方法では、所望の
特定の抗体を産生ずる雑種細胞のみを最終的に「単離」
することは、全ての生存雑種細胞を個々に増殖させ、そ
の培養物を試験することによってのみ行なうことができ
る。

米国特許出願節９０，１３０号の方法では、雑種化操作
に用いられるミエローマ細胞には、所望の特定の抗体に
対して特異的な抗原がその表面に付着され、又はその表
面の１部を構成している。従って、融合化剤の非存在下
では、このようなミエローマ細胞と正常細胞の混合物中
では、ミエローマ細胞と特定の（所望の）抗体を産生じ
ている正常細胞との付着（最終的には雑種化）のみが起
きる。これらの正常細胞はその表面に抗体様のレセプタ
ーを有している。このレセプターが、ミエローマ細胞上
に設けられた抗原性レセプターに結合する。この方法に
よると、所望の雑種細胞（すなわち、所望の特定の抗原
を実際に産生じているもの）の数が、形成される全ての
雑種細胞の数に対して極めて大きく、従って、このよう
な所望の雑種細胞の単離がはるかに容易になる。

採用される雑種化方法によらず、この発明は、特定の培
地中で生存することができないように化学的に前処理し
た、継続的に分裂する細胞（例えばミエローマ細胞）を
、雑種化技術における継続分裂細胞として用いるために
提供する。この処理により、雑種化操作を終えた細胞を
このような培地に懸濁すると、継続分裂細胞と正常細胞
との雑種細胞以外の全ての細胞が選択的に死滅する。

最初の方で４述べたように、この発明の顕著な利点は、
突然変異を受けた継続分裂細胞をつくり又は得ることが
不要になり、その結果、雑種化技術に、種々の継続分裂
細胞、培地及び他の条件を採用することが可能になるこ
とである。例えば、既知の雑種化技術に用いることがで
きる突然変異ミエローマ細胞は少ない。なぜなら、この
ような突然変異体を単離することが困難であり、かつ。

融合操作を終えた全ての細胞を懸濁できる培地中で、そ
の突然変異が、突然変異細胞に死をもたらすことが確保
されなければならないからである。

この発明の方法では、継続分裂細胞に対して多くの前処
理を施すことができ、それによって、処理細胞を、特定
の培地中では生存できない（正常細胞と雑種化しない限
り）ようにすることが可能となる。現在のところ最も好
ましい化学的処理は、継続分裂細胞のジヒドロ葉酸還元
酵素を不可逆的に不活性化することである。

従って、この発明の方法では、継続的に分裂する細胞の
集団全体を化学的に処理した後、既知のいずれかの雑種
化技術に用いる。その後に細胞を懸濁する培地を適当に
選択すると正常細胞と継続分裂細胞との雑種を単離する
ことができ、必要ならば、これから特定の所望の雑種（
すなわち、特定の生産物を産生ずる）をさらに単離する
ことができる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）継続的に分裂できる細胞の集団と継続的に分裂で
   きない正常細胞の集団と゛を、単一の上記継続分裂可能
   細胞と単一の上記正常細胞との間で１又は２以上の雑種
   細胞が形成される条件下で混合し、」二記混合及び雑種
   形成後の全ての生きた細胞を、採用した特定の分裂可能
   細胞の故に分裂可能細胞と正常細胞との雑種細胞のみが
   生存し得る特定の培地と接触させることからなる、継続
   的に分裂できる細胞と継続的に分裂できない正常細胞と
   の生きた単離可能な雑種細胞の単離方法において、上記
   分裂可能細胞集団は、特定の培地中での生存に必要な成
   分が該継続分裂可能細胞集団と上記正常細胞集団とを雑
   種化のために混合する前に化学的に不活性化されている
   がために上記特定の培地中では生存することができない
   ものであることを特徴とする方法。
2. （２）前記分裂可能細胞は、複数の化学的前処理による
   化学的不活性化を受ける特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. （３）上記特定の培地はジヒドロ葉酸を含むがフォリニ
   ン酩を含まず、上記ミエローマ細胞は化学的に不活性化
   されたジヒドロ葉酸還元酵素を有する特許請求の範囲第
   ３項記載の方法。
4. （４）上記ジヒドロ葉酸還元酵素の化学的不活性化は、
   前記継続分裂可能細胞集団と前記正常細胞集団とを混合
   する前に、ジヒドロ葉酸還元酵素を不活性化する剤の中
   に前記ミエローマ細胞集団を懸濁することによって行な
   われる特許請求の範囲第６項記載の方法。
5. （５）前記剤はメトトレキセート又はアミノプテリンで
   ある特許請求の範囲第７項記載の方法。